劉玲俐，趙亞楠，靳亞潔，祁晶晶，田明星，王少輝，李 濤，于圣青

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

自1932年美國分離出第一株鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestife, RA）后[1]，世界各國都陸續(xù)報道了該菌的感染病例，目前RA已經(jīng)成為影響我國乃至世界家鴨養(yǎng)殖業(yè)的重要細菌性病原體之一。隨著2012年首個鴨疫里默氏桿菌ATCC 11845基因組的發(fā)表，至今為止，美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）已經(jīng)收錄了57個RA的基因組遺傳信息，其中有14個是完整的全基因組序列。通過對基因組進行生物信息學分析，可以提高人們對細菌形態(tài)結構、代謝、致病性、耐藥性等分子機制認識。

另一方面，由于RA血清型眾多，且各血清型之間交叉保護性差，造成商業(yè)化疫苗防控效果不明顯，因此，現(xiàn)階段，使用抗生素是防治RA的主要方法之一。利福平由于具有較好的對細菌殺傷作用，而在養(yǎng)殖場得到廣泛使用，但是近年來流行病學調查結果顯示，RA利福平耐藥菌株分離率逐年上升，但現(xiàn)有研究文獻多偏重耐藥表型分析，對于利福平高耐受RA的基因組分析，鮮見報道。本研究對一株來自安徽某家鴨養(yǎng)殖場分離的利福平耐藥株進行了菌種鑒定、血清型分析、藥敏測試、基因組分析等，以期為RA利福平耐藥機制研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病料與菌株來源 病料采集于安徽某家鴨養(yǎng)殖場，CH3、Yb2、HXb2等菌株由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 胰蛋白大豆肉湯（Tryptic Soy Broth,TSB）購自美國Becton Dickinson公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）股份有限公司；利福平（純度：97%）購自上海Aladdin生化科技股份有限公司；微生物藥敏試紙：利福平、頭孢唑肟、氟苯尼考、多西環(huán)素、紅霉素、林可霉素、大觀霉素、恩諾沙星、四環(huán)素、青霉素、氨芐西林、新霉素、鏈霉素、諾氟沙星、多粘菌素B、氯霉素購自溫州市康泰生物科技有限公司。

1.3 主要儀器與設備 PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；核酸電泳儀及全自動凝膠成像系統(tǒng)均購自上海天能科技有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱及Nano-Drop N1000分光光度計均購自美國Thermo公司。

1.4 細菌分離、純化及保存 無菌采集病鴨的心臟、肝臟、脾臟、腦等組織器官，研磨處理，劃線接種于TSA固體培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～3 d，挑取固體培養(yǎng)基上的單菌落，接種于TSB液體培養(yǎng)基，置于37℃、220 rpm的搖床中培養(yǎng)12～16 h，取菌液劃線接種于TSA固體培養(yǎng)基，連續(xù)三次劃線，挑單菌進行擴大培養(yǎng)。將獲得的單菌菌液，添加終濃度為25%～30%的甘油，置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細菌基因組的提取 將單菌的純培養(yǎng)物以1∶100的比例接種于TSB液體培養(yǎng)基，置于37℃、220 rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)12 h。按照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作說明書，提取基因組DNA，用Nano-Drop N1000分光光度計測定DNA的濃度。

1.6 細菌種屬鑒定 根據(jù)不同血清型RA共有的保守基因：16S rRNA、ompA和groEL設計引物（表1），以CH3菌株為陽性對照，采用三重PCR鑒定RA[2]。PCR擴增體系（20 μL）如下：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，基因組DNA 1 μg，ddH2O補足至20 μL。PCR擴增程序如下：94℃預變性4 min；94℃變性40 s，52℃退火40 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。用凝膠成像儀掃描1%瓊脂糖凝膠電泳后的PCR產(chǎn)物，膠回收產(chǎn)物送至上海擎科生物有限公司進行測序。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.6 細菌血清型鑒定 復蘇凍存于-80℃的RA-WH9，用一次性接種環(huán)劃線接種于TSA固體培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)1～3 d。取RA血清型1型、2型、10型鴨抗血清各一滴分別滴于干凈玻片上，再用一次性接種環(huán)挑取RA-WH9菌落，混勻于不同血清型的鴨抗血清中，室溫靜置片刻后，通過觀察是否有凝集現(xiàn)象的發(fā)生，從而對分離菌的血清型進行鑒定。

1.7 細菌藥敏實驗 藥敏實驗按CLSI2018版本推薦的K-B紙片擴散法及微量肉湯稀釋法進行，K-B紙片擴散法判斷標準參照CLSI2018。由于目前RA利福平耐藥折點未確定，因此參照Sun等[3]研究設定RA利福平MIC＞0.5 μg/mL為利福平耐藥。

1.8rpoB基因突變分析 以RA-rpoB-F：ATGAATAA GAACATCATATTTGCC、RA-rpoB-R：TTTCAA TCTATCTATCGTATTATCC為引物，分別擴增CH3、Yb2、HXb2、RA-WH9的rpoB基因。PCR擴增體系（50 μL）：基因組DNA 1 μg，RA-rpoB-F 1 μL，RA-rpoB-R 1 μL，2×PrimeSTAR Max 25 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR擴增程序采用三步法：98℃預變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸70 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。用凝膠成像儀掃描1%瓊脂糖凝膠電泳后的PCR產(chǎn)物，膠回收產(chǎn)物送至上海擎科生物科技有限公司進行測序，比對測序結果，分析rpoB基因的突變位點。

1.9 生長曲線測定 復蘇凍存于-80℃的菌種保存液，劃線接種于TSA固體培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)1～3 d，挑取TSA固體培養(yǎng)基上的單菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基，置于37℃、220 rpm的搖床中，震蕩培養(yǎng)至OD600值為1.0，1∶100比例轉接于含有150 mL TSB液體培養(yǎng)基錐形瓶中，置于37℃、220 rpm的搖床中，震蕩培養(yǎng)18 h，每隔2 h取800 μL菌液測定OD600值并記錄（實驗重復3次）。最后用GraphPad Prism 6.02繪制菌株在體外的生長曲線，以CH3、Yb2、HXb2等RA代表株作為參照株。

1.10 細菌全基因組測序和組裝 利用MiSeq測序平臺對分離菌基因組DNA進行測序。通過使用兩個獨立的基因組文庫：Illumina HiSeq小片段文庫及PacBio 20 kb文庫，采用鳥槍法進行測序。用短序列組裝軟件SOAPdenovo2和組裝軟件Canu、SPAdes等對lllumina和PacBio平臺的測序結果進行聯(lián)合組裝，最終獲得該分離株的全基因組序列。

1.11 細菌基因預測與注釋 利用Glimmer、GeneMarkS、Prodigal軟件對ORF進行預測，使用GeneMarkS預測質?；蚪M，利用tRNAscan-SE v2.0軟件對基因組中包含的tRNA進行預測，利用Barrnap軟件對基因組中包含的rRNA種類、位置、序列信息進行預測，利用Tandem Repeats Finder軟件進行串聯(lián)重復序列位置、重復次數(shù)、核酸組成等信息預測，通過NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫（Non-Redundant Protein Database,NR）、EBI非冗余基因數(shù)據(jù)庫Swiss-Prot和Pfam數(shù)據(jù)庫，對ORF進行功能注釋，利用COG數(shù)據(jù)庫對蛋白質的同源基團進行功能分類，利用GO數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology）進行基因聚類分析，通過IslandViewer預測基因組島（Gene Ilands, GIs），使用CGView軟件繪制基因組圖譜。

2 結果

2.1 細菌的分離與鑒定 經(jīng)純化培養(yǎng)后，分離菌株在TSA固體培養(yǎng)基上呈半透明、露滴樣的圓形菌落。采用三重PCR擴增RA保守基因：16S rRNA、ompA和groEL基因。結果表明，該菌株可擴增到RA 16S rRNA、ompA和groEL基因片段，大小分別為250 bp、500 bp和750 bp，與預期結果相符（圖1），膠回收PCR產(chǎn)物并送測序。結果表明，PCR擴增出了RA的特征條帶，可判定該菌為鴨疫里默氏桿菌，將其命名為RA-WH9。

圖1 PCR擴增鑒定結果Fig.1 The result of PCR amplification

2.2 血清型鑒定結果 玻片凝集實驗結果顯示，室溫靜置片刻后，RA-WH9與血清型1型鴨抗血清出現(xiàn)清晰的凝集顆粒，與血清型2型鴨抗血清、血清型/10型鴨抗血清無明顯凝集現(xiàn)象，因此確定RA-WH9為血清型1型分離菌株。

2.3 藥敏實驗結果 K-B紙片法結果顯示，RA-WH9對頭孢唑肟、氯霉素、氟苯尼考、多西環(huán)素、紅霉素和林可霉素敏感；對大觀霉素、恩諾沙星和四環(huán)素中度敏感；對青霉素、氨芐西林、新霉素、鏈霉素、諾氟沙星、多粘菌素B和利福平耐藥。微量肉湯稀釋法表明RA-WH9對利福平的MIC＞50 μg/mL，CH3、Yb2、HXb2對利福平的MIC＜0.1 μg/mL。

2.4rpoB基因突變分析結果 研究表明病原菌對利福平的耐藥性通常是由靶位點基因rpoB突變所導致[4]，因此我們將RA-WH9rpoB基因與對利福平敏感的CH3、Yb2、HXb2做了多重序列比對。結果表明，rpoB氨基酸序列與Yb2、HXb2有2個位點氨基酸不同，與CH3有5個位點氨基酸不同，而Yb2、HXb2 rpoB氨基酸序列則完全相同（表2）。

表2 RA-WH9與 CH3、Yb2、HXb2 rpoB氨基酸差異Table 2 rpoB amino acid differences among RA-WH9, CH3, Yb2 and HXb2

2.5 生長曲線測定結果 生長曲線測定結果表明，在體外培養(yǎng)的條件下（相同培養(yǎng)基，無藥物選擇壓力），利福平敏感株CH3、Yb2、HXb2之間的生長速率無明顯差異，但利福平耐藥株RA-WH9的生長速率小于利福平敏感株CH3、Yb2、HXb2（圖2）。

圖2 RA-WH9和 CH3、Yb2、HXb2生長曲線Fig.2 Growth curves of CH3, Yb2, HXb2 and RA-WH9

2.6 基因組分析

2.6.1 基因組組分分析 RA-WH9攜帶一個染色體及一個質粒，染色體包含2 488 018個堿基對，GC含量34.58%。多重基因組比對結果表明，RA-WH9染色體與HXb2、RA-CH-1、RCAD0133染色體結構最為接近（圖3）。ORF預測結果表明，RA-WH9染色體共編碼2563個基因，總長度為2 223 315 bp，占基因組的88.98%，GC含量35.24%，平均每個基因的長度為867.476 bp，其中有1805個基因的長度小于1000 bp，758個基因的長度大于1000 bp，編碼3套16S-23S-5S核糖體rRNA操縱子，41個tRNA，36個串聯(lián)重復序列，250個轉運蛋白，420個跨膜蛋白。

圖3 多重基因組比對圈圖Fig.3 Multiple genomic alignment map

2.6.2 COG數(shù)據(jù)庫注釋 COG數(shù)據(jù)庫分析結果表明，RA-WH9基因組包括20個功能類別，其中505個基因與新陳代謝有關，329個基因與細菌分裂繁殖相關，562個基因與染色體結構和穩(wěn)定性相關（圖4）。

圖4 COG注釋分類統(tǒng)計Fig.4 COG annotation classification statistics

2.6.3 GO數(shù)據(jù)庫注釋 GO數(shù)據(jù)庫分析結果表明，RAWH9染色體共有1697個基因獲得GO注釋，占全部基因的66.21%，根據(jù)GO注釋中功能的不同，可將這1697個基因分為三大類，其中與細胞組分相關的基因有749個，與分子功能相關的基因有1407個，與生物過程相關的基因有1243個（圖5）。

圖5 GO注釋聚類分析Fig.5 Gene distribution based on GO classification

2.6.4 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋 為了進一步研究每個基因在各種代謝途徑中所發(fā)揮的作用，我們使用KEGG數(shù)據(jù)庫，進行了基于pathway的分析。分析結果表明，共有1313個基因獲得KEGG注釋，占全部基因的51.23%，分布于39個信號通路（圖6）。

圖6 KEGG通路分類統(tǒng)計圖Fig.6 Classification statistics of KEGG pathway

2.6.5 毒力基因分析 RA-WH9毒力基因分析結果表明，RA-WH9基因組編碼128個與毒力有關的基因（表3）。進一步分析表明，該菌含有Ⅳ型菌毛，且攜帶有三種類型的分泌系統(tǒng)：Ⅲ型分泌系統(tǒng)、Ⅵ型分泌系統(tǒng)、Ⅶ型分泌系統(tǒng)。

表3 RA-WH9的毒力基因預測分類統(tǒng)計表Table 3 Statistical table of virulence gene prediction of RA-WH9

2.6.6 耐藥基因分析 RA-WH9耐藥基因分析結果表明，RA-WH9基因組共編碼88個耐藥基因，主要包括：四環(huán)素、磷霉素、異煙肼、多粘菌素、利福平、甲氧芐氨嘧啶、莫西霉素、莫匹羅星、氨基香豆素、氟喹諾酮類抗生素、糖肽類抗生素、吡嗪酰胺、林可酰胺類抗生素、鏈球菌素、β-內酰胺類抗生素、磺胺類抗生素、糖肽類抗生素、脂肽類抗生素等，與RA-WH9藥敏實驗的結果較一致（圖7）。此外，RA-WH9染色體中還攜帶多種可導致非特異性耐藥的基因，可通過外排泵的泵出作用、基因盒的整合作用、滅活酶的產(chǎn)生、細胞膜通透性的改變等方式產(chǎn)生耐藥性。

圖7 耐藥基因分類統(tǒng)計圖Fig.7 Classification statistics of drug resistance gene

2.6.7 基因組島分析 攜帶有多種功能基因的基因組島，是水平轉移元件中最為重要的一種形式，根據(jù)攜帶的功能基因，可將基因組島分為共生島、毒力島、耐藥島及代謝島等[5]?；蚪M島長度一般為10～100 kb，攜帶功能基因、整合酶及質粒接合相關的因子等，其攜帶的基因通常能夠給病原菌帶來選擇優(yōu)勢[6]。

利用IslandViewer對RA-WH9基因組，進行基因組島分析，我們發(fā)現(xiàn)RA-WH9基因組共含有19個基因組島（表4），其中GI03是毒力島，GI01、GI02、GI04、GI05、GI06、GI07、GI10、GI13、GI17、GI19是代謝島，GI-16既是毒力島又是耐藥島，攜帶有毒素因子基因relE及四環(huán)素類藥耐藥基因tetX[7]。此外，分析結果還表明，GI03基因島中攜帶有一個血凝素基因，血凝素具有免疫原性，在病原菌導入宿主細胞的過程中發(fā)揮著重要的作用[8]；GI14基因組島含有2個編碼冷休克蛋白的基因，冷休克蛋白不僅參與宿主冷休克反應和低溫脅迫，也是宿主正常生長和分化所必需重要基因之一[9]。

表4 基因組島詳情Table 4 Genomic island details

2.6.8 RA-WH9的進化分析 為了分析RA-WH9與其他鴨疫里默氏桿菌的親緣關系，我們構建了一個基于16S rRNA的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。結果表明，RA-WH9和鴨疫里默氏桿菌P-2123、RCAD0133遺傳距離最近（圖8）。

圖8 基于16S rRNA的進化分析Fig.8 Evolution analysis based on 16S rRNA

3 討論

RA是世界家鴨養(yǎng)殖業(yè)重要病原菌之一，迄今為止，國內外報道RA的流行血清型超過21種，且不同血清型菌株之間缺乏有效的交叉保護[10]，給RA防治帶來很大困難，因此，抗生素是現(xiàn)階段防治RA的主要手段之一。然而，由于養(yǎng)殖業(yè)長時間、超范圍的使用抗生素，導致RA耐藥問題越來越嚴重，臨床耐藥菌株分離率逐年上升[11]。程冰花等[12]對2017-2018年在安徽地區(qū)分離的37株RA進行耐藥分析，發(fā)現(xiàn)所有分離菌均對卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素、丁胺卡那、多粘菌素B耐藥，超過90%的分離菌對阿莫西林、新霉素、紅霉素、阿奇霉素、林可霉素耐藥。朱元軍等[13]檢測南方地區(qū)分離的120株RA對16種抗生素的敏感性，發(fā)現(xiàn)超過90%的菌株對慶大霉素、鏈霉素、丁胺卡那，卡那霉素耐藥，7重及以上耐藥菌株占比高達97.5%。但現(xiàn)有研究多局限于流行病學調查，較少見耐藥基因的分離、鑒定等研究。近年來，隨著基因組測序技術的發(fā)展，盡管國內外相關研究者基于基因組測序技術，發(fā)現(xiàn)和鑒定了一些RA毒力因子，但尚未見從基因組層面對RA耐藥菌株進行全面分析[14]。

本研究從安徽養(yǎng)殖場患病家鴨組織器官中分離、鑒定出一株RA，將其命名為RA-WH9。由于RA對培養(yǎng)基營養(yǎng)成分要求較高，在MH培養(yǎng)基上不生長，因此藥敏實驗均采用TSB液體培養(yǎng)基、TSA固體培養(yǎng)基。K-B紙片擴散法及微量肉湯稀釋法結果表明該菌為多重耐藥菌，其對利福平的MIC達到50 μg/mL。Sun等[3]通過微量肉湯稀釋法測定了110株RA對利福平的MIC，發(fā)現(xiàn)有71%RA對利福平的MIC≤8 μg/mL。這表明，RA-WH9為利福平高耐受菌株。

現(xiàn)有研究表明，細菌對利福平主要耐藥機制之一為細菌rpoB氨基酸突變。利用多重序列比對，我們分析了RA-WH9與其他3株利福平敏感株（CH3、Yb2、HXb2）rpoB氨基酸序列異同，分析結果表明，與利福平敏感株相比，RA-WH9 rpoB存在5個位點的氨基酸不同：D481Y、S539Y、T930A、A937T、T993A。Sun等[3]證實RA rpoB中，S539Y的突變與利福平的耐藥性相關，T930A、A937T、T993A這3個點突變與利福平的耐藥性無關，至于rpoB D481Y突變是否與利福平的耐藥相關仍需進一步的研究。

文獻指出，某些基因的耐藥突變通常會對細菌的重要生理功能產(chǎn)生不利影響，即在沒有藥物選擇壓力下，藥物敏感株往往比耐藥株能夠更好完成生活周期[15]。利用體外生長曲線模型，我們比較了RA-WH9與藥物敏感株CH3、Yb2、HXb2生長周期異同。實驗數(shù)據(jù)顯示，相同培養(yǎng)基，無藥物選擇壓力下，RA-WH9生長速率小于藥物敏感株，暗示RA-WH9某些基因的耐藥突變導致適應成本。細菌呈現(xiàn)的耐藥特征稱為耐藥表型（resistant phenotype），攜帶的耐藥基因稱為耐藥基因型（resistant genotype）。盡管細菌的耐藥表型由其耐藥基因型決定，但耐藥表型和耐藥基因型之間沒有完全的一致性。通過K-B紙片擴散法、微量肉湯稀釋法，我們檢測了RA-WH9的耐藥表型；為了全面了解RA-WH9耐藥基因型，借助細菌基因組高通量測序技術，我們構建了RA-WH9基因組精細圖。分析結果表明，RA-WH9基因組共編碼88個耐藥基因，其耐藥基因型與耐藥表型較為一致。同時，多重基因組比對分析結果表明，RA-WH9染色體與HXb2、RA-CH-1、RCAD0133染色體結構最為接近。文獻研究表明，RA-CH-1為血清1型RA，這也側面證實了我們對RA-WH9血清學鑒定結果[16]。

細菌獲得耐藥性的另外一種重要方式是基因水平轉移（horizontal gene transfer, HGT），是指以轉化、轉導和接合轉移三種方式，通過質粒、整合子、轉座子、基因島等水平轉移元件（mobile genetic element, MGE），在不同菌株間發(fā)生基因交換。文獻研究表明，細菌間的基因水平轉移無時無刻不在發(fā)生，是造成細菌基因組多樣性的主要原因之一，也是耐藥性基因在環(huán)境擴散主要風險因素之一。MGE同樣在RA耐藥性的傳播中也發(fā)揮著重要的作用。染色體分析結果表明，RA-WH9攜帶有多個可移動元件：1個質粒、7個CRISPR系統(tǒng)、19個基因島，猜測其對抗生素的耐藥性尤其是對利福平的耐藥性可通過基因水平轉移的方式擴散至自然環(huán)境中，存在較大的環(huán)境擴散風險，但仍需進一步的研究。

總之，本研究從全基因組水平對鴨疫里默氏桿菌利福平高耐受菌株RA-WH9進行了初步的解析，這些信息將為后續(xù)耐藥機制及分子致病機制等方面的研究指明方向。