劉玲俐，趙亞楠，靳亞潔，祁晶晶，田明星，王少輝，李 濤，于圣青

（中國農業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer, RA）是一種可引起鴨、鵝、雞、火雞等禽類急性或慢性敗血癥的黃桿菌科革蘭氏陰性菌。該菌對水禽的感染在世界范圍內均有報道，并由于其可造成家禽較高死亡率、低飼料轉化率從而給家鴨養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，由于RA血清型眾多，彼此之間無交叉保護，因此，現(xiàn)階段抗生素仍是防控RA的主要手段。然而抗生素的長期使用，使得RA在藥物選擇壓力下，對藥物敏感的菌株被抑制或殺滅，而藥物抵抗菌株則獲得生存優(yōu)勢，繼續(xù)繁殖和克隆傳播，導致RA臨床分離株耐藥率逐年上升。現(xiàn)有文獻表明，RA基因組中抗藥性基因的比重已大大提高，臨床分離株多重耐藥現(xiàn)象十分嚴重。流行病學研究調查顯示，不同區(qū)域、不同血清型的RA對不同抗菌藥物的耐藥水平存在一定差異[1-5]。同時，RA對抗菌藥物產生耐藥性通常是在多種因素共同作用下的結果。本文綜合國內外相關文獻，對RA耐藥機制研究現(xiàn)狀進行總結。

1 外排泵系統(tǒng)

外排泵系統(tǒng)是介導RA內源性和獲得性耐藥的一種主要機制，它通過泵出菌體細胞內的抗菌藥物，使其不能發(fā)揮作用。但是由外排泵系統(tǒng)引起的細菌耐藥性通常為非特異性。

仲崇岳等[6-7]通過對比分析加入外排泵抑制劑羰基-氰-間氯苯腙（CCCP）前后，RA對β-內酰胺類抗菌藥物敏感性的變化，證明了RA臨床株攜帶跨膜質子梯度能驅動型外排泵，并且初次總結出外排泵系統(tǒng)是與RA對β-內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類藥物的耐藥性相關。在此基礎上，金龍翔[8]檢測了CCCP對RA二代氟喹諾酮類抗菌藥物敏感性的影響，實驗結果表明，主動外排泵系統(tǒng)與RA對大部分二代氟喹諾酮類抗菌藥物的耐藥性相關，但主要影響RA對諾氟沙星和環(huán)丙沙星的敏感性，并不影響RA對左氧氟沙星的敏感性。Chen等[9]在臺灣地區(qū)分離的66株RA中，檢測出9株氟苯尼考耐藥株，通過PCR擴增，發(fā)現(xiàn)這9株耐藥菌株均攜帶編碼外排泵蛋白的floR基因，藥敏實驗證明，該外排泵系統(tǒng)與RA對氯霉素和氟苯尼考的耐藥性相關。利用基因組高通量測序技術，Wang等[10]發(fā)現(xiàn)RA ATCC11845株基因組中，攜帶兩種外排泵編碼基因：小多重耐藥家族（small multi-drug resistance family, SMR）和主要易化子超家族（major facilitator superfamily, MFS），猜測其可能與RA對抗菌藥物的耐藥性有關，但未進行實驗證實。Zhang等[11]在RA-CH-1中，鑒定了一個編碼耐藥結節(jié)化細胞分化家族（resistance nodulation cell division family,RND）外排泵RaeB的基因B739_0873，藥敏實驗證明該基因的缺失會增強RA對氨基糖苷類藥物和洗滌劑的敏感性。同樣，李生斗[12]在RA-GD株中，鑒定了一個編碼ATP結合盒超家族（ATP-binding cassette superfamily, ABC）外排泵MarB亞基的基因RIA_1614，利用基因缺失技術，證實該基因的缺失會增強RA對氨基糖苷類藥物和有機溶劑的敏感性。Chen等[13]借助外排泵抑制劑及實時熒光定量PCR技術，證實了外排泵基因與RA耐藥表型之間有一定關聯(lián)，但不是絕對關聯(lián)，同時作者認為外排泵抑制劑可以考慮應用于臨床治療?，F(xiàn)階段，相對其他種屬細菌，RA發(fā)現(xiàn)、鑒定的外排泵種類仍不多，其功能研究也多局限于同源基因的比較，較少涉及外排泵排出藥物機制研究，這與RA缺乏成熟、穩(wěn)定的基因突變系統(tǒng)有關。

2 細胞膜通透性的改變

革蘭氏陰性菌可以通過改變細胞外膜的通透性，來降低菌體內抗菌藥物濃度或者阻止抗菌藥物進入細菌體內。仲崇岳[7]發(fā)現(xiàn)臨床株RA14、RA58和RA59這3株菌株對苯唑西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、青霉素的MIC值均不受外排泵抑制劑CCCP的影響且對部分藥物顯示為耐藥表型，通過頭孢硝噻吩法和PCR擴增方法，檢測其β-內酰胺酶表型及基因型均為陰性，猜測這3株分離株的藥物耐藥機制可能是由于細胞膜通透性降低而引起。此外，仲崇岳[7]利用人工誘導耐藥方法，構建了RA43頭孢吡肟耐藥株，SDS-PAGE電泳檢測原始頭孢吡肟敏感株和人工誘導耐藥株外膜蛋白，結果顯示，誘導后RA43的外膜蛋白條帶和誘導前有所不同，在大約20 kDa和45 kDa處各有2條條帶發(fā)生缺失，作者推測外膜蛋白缺失導致細胞膜通透性改變是導致RA43發(fā)生耐藥性改變的主要原因之一。目前，臨床常用抗菌藥物多為親脂性，可自由進入RA細胞膜磷脂雙層結構，特別是β-內酰胺類抗生素很容易通過RA細胞膜上存在的孔蛋白通道進入胞內，然而當外膜的滲透性發(fā)生改變，如基因突變導致部分種類孔蛋白通道關閉或缺失，RA就會產生對該抗菌藥物的耐藥性，目前該耐藥機制多見于β-內酰胺類藥物。

3 藥物靶基因突變

病原菌可以通過使藥物作用靶位點基因發(fā)生突變的方式，來改變藥物作用靶位點蛋白的結構，從而改變藥物接合位點的空間構象，使其與藥物的親和力降低甚至不能與藥物結合，從而導致藥物藥效降低甚至失活[14-15]，由于細菌突變進化速度較快，藥物靶基因突變導致的耐藥機制是細菌產生藥物抵抗性主要原因。劉穎等[16]對比分析了喹諾酮類藥物耐藥菌株與敏感菌株的gyrA基因喹諾酮類藥物決定區(qū)（quinolone resistance determinational region,QRDR）核酸序列，發(fā)現(xiàn)耐藥菌株通過堿基突變，使QRDR對應位點的氨基酸發(fā)生突變，從而使喹諾酮類藥物作用靶蛋白DNA促旋酶A亞基空間構象發(fā)生變化，導致RA對喹諾酮類藥物的敏感性降低、耐藥性增強。孫亞妮等[17]分析了30株RA諾氟沙星耐藥株gyrA基因QRDR，發(fā)現(xiàn)氨基酸突變位點主要是QRDR第83位和第87位氨基酸，其中9株Ser83突變?yōu)锳rg83，21株Ser83突變?yōu)镮le83，30株RA耐藥株中，Gly87均突變?yōu)锳sp87。在此基礎上，Sun等[18]分析發(fā)現(xiàn)RAgyrA雙突變株（第83位和第87位氨基酸同時突變）對喹諾酮類藥物的抗性水平顯著高于單突變株；同時，該研究還證實了RA菌株中與喹諾酮類藥物耐藥相關的另一基因parC基因QRDR突變熱點不同于大腸桿菌[19]、銅綠假單胞菌[20]及胸膜肺炎桿菌[21]，parC的QRDR中只檢測到一個突變熱點Arg120Glu，作者推測該位點氨基酸的突變可能與環(huán)丙沙星耐藥相關，因為在gyrA和parC中均有突變的分離株比gyrA單突變株表現(xiàn)出更高的環(huán)丙沙星耐藥性。Sun等[22]對18個RArpoB基因氨基酸序列的比較分析和利福平MIC測定表明，以下5個氨基酸位點突變與利福平耐藥相關：V382I、H491N、G502K、R494K和S539Y，這些氨基酸的突變導致rpoB基因編碼的RNA聚合酶β亞基空間構象發(fā)生改變，使利福平無法與作用靶位點之間形成緊密的分子作用力，從而致使利福平無法通過阻止RNA轉錄發(fā)揮抗菌作用。

4 產生滅活酶或鈍化酶

細菌可以通過產生滅活酶的方式，使進入細菌菌體內的抗菌藥物結構發(fā)生改變，然后轉變?yōu)閷毦鸁o活性的代謝物，失去抗菌藥物原本的活性。近年來，耐藥基因流行病學分析結果表明，RA中能夠檢測到的滅活酶的數(shù)量和種類越來越多，主要可以分為以下幾類：

4.1 滅活氨基糖苷類抗生素的鈍化酶 鈍化酶是耐藥菌株產生的可通過水解或修飾作用破壞藥物活性基團，從而使藥物失效的蛋白酶。劉穎[23]通過PCR方法，對RA進行9種常見氨基糖苷類鈍化酶基因的檢測，檢測到ant(3")-I基因。蔡秀磊[24]在22株臨床分離的RA中，檢測到編碼核苷轉移酶的aadA5、aadA1基因和編碼?；D移酶的aac6-II基因。Sun等[18]通過PCR方法，對103株RA氨基糖苷類藥物的鈍化酶基因進行檢測，檢測結果如下：共發(fā)現(xiàn)了6種氨基糖苷類藥物的鈍化酶基因，包括aph（3'）-VII、aadAl、aadA2、aac（3'）-IV、aac(3')-IIc、aac(6')Ib。此外，楊芳芳[25]采用PCR方法，從2005-2006年臨床分離到的38 株RA中檢測出了ant(3")-Ia、aac(6')-Ib和aph(3')IIa這3種氨基糖苷類鈍化酶基因，且其核苷酸的同源性與大腸桿菌和沙門菌中的氨基糖苷類耐藥基因核苷酸的同源性很高。在此基礎上，李翠[26]將氨基糖苷類敏感株E.coli8099與氨基糖苷類耐藥株RA P3進行混合培養(yǎng)，獲得了氨基糖苷類耐藥結合子大腸桿菌E1，進一步研究發(fā)現(xiàn)，結合子從RA P3菌株中獲得了編碼氨基糖苷類乙酰轉移酶aac6-I基因，說明aac6-I導致的氨基糖苷類耐藥可在RA與E.coli之間水平傳播。

4.2 滅活氯霉素的乙酰轉移酶cat基因可編碼乙酰轉移酶，催化乙酰輔酶A乙酰化能力，從而改變氯霉素的分子結構，最后形成1，3-二乙酸氯霉素，導致氯霉素失去抗菌活性[27]。蔡秀磊[24]在22株臨床分離的RA中，檢測到catB3基因。Huang等[28]通過PCR方法，對192株RA分離株進行檢測，檢測結果表明：有69株RA攜帶catB3基因，其中RA-CH-2攜帶有2個拷貝的catB3基因（G148_1769和G148_1772），作者利用自殺載體pRE112進行同源重組使catB3基因缺失，并測定突變株對氯霉素的MIC，結果表明：當這兩個基因同時缺失時，RA-CH-2對氯霉素的敏感性增強了8倍，說明catB3基因與RA對氯霉素的耐藥性相關。

4.3 滅活林可酰胺類藥物的核苷酸轉移 核苷酸轉移酶是調控DNA合成和修復的關鍵酶和限速酶，可催化4種核糖核苷酸還原，生成相應的脫氧核糖核苷酸。Luo等[29]首次證明RA-CH-2中G148_1775基因，所編碼的蛋白是一種新型的林可酰胺核苷酸轉移酶，與其他報道中林可酰胺核苷酸轉移酶的同源性小于41%；通過體外動力學測定，表明該蛋白可以抑制林可酰胺類藥物的抗菌活性，從而使RA對該類藥物產生高水平的耐受性；此外，作者還發(fā)現(xiàn)G148_1775基因可通過轉化的方式，使ATCC 11845對林可霉素和克林霉素的MIC分別增大512倍、32倍，猜測該基因的廣泛存在，是RA對林可酰胺類藥物普遍耐受的主要原因。

4.4 滅活四環(huán)素類藥物的氧化還原酶 產生滅活四環(huán)素類藥物的氧化還原酶是病原菌對四環(huán)素類藥物（四環(huán)素、米洛環(huán)素、多西環(huán)素、替加環(huán)素等）具有耐受性的主要原因之一，其中以tetX基因為代表。Li等[30]利用轉座子隨機突變技術，使編碼氧化還原酶的M949_0459基因（tetX同源基因）失活，通過對比CH3及其突變株對替加環(huán)素的MIC，證明了RA氧化還原酶可增強CH3對替加環(huán)素的抵抗性。此外，Zhu等[31]發(fā)現(xiàn)RA菌株中tetX基因存在水平轉移現(xiàn)象，可使四環(huán)素敏感株變成耐藥株。

5 產生修飾酶

erm基因編碼的核糖體甲基化酶可以使病原菌核糖體亞基甲基化，從而導致大環(huán)內酯類藥物不能與其作用靶位點結合。Luo等[32]通過PCR方法對206株RA進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)有64株RA攜帶有編碼核糖體甲基轉移酶的ermF基因，基因缺失實驗證明，ermF基因的缺失會增強RA對林可酰胺類抗菌藥物和大環(huán)內酯類抗菌藥物的敏感性，使RA對紅霉素、阿奇霉素、泰樂新和林可霉素的MIC分別降低1024、1024、4和2048倍。Xing等[33]同樣證實了由ermFU基因或ermF基因編碼的甲基化酶是導致RA對紅霉素耐藥的主要機制之一；此外，他還發(fā)現(xiàn)與其他病原菌一樣，RA攜帶的ermF和ermFU基因也可增強對大環(huán)內酯-林可酰胺-鏈球菌B組抗生素的耐藥性[34]。

6 小結

近年來，病原菌耐藥性的出現(xiàn)和傳播已成為公共衛(wèi)生領域日益嚴重的問題。除某些病原菌具有固有耐藥性，能對某些種類的抗生素具有天然的耐藥性，許多敏感菌也可通過環(huán)境誘導基因突變及耐藥基因水平轉移的方式獲得耐藥性。流行病學調查結果顯示，RA耐藥菌株分離率逐年上升，但現(xiàn)有研究文獻多偏重耐藥表型分析，對于RA耐藥機制的研究不夠全面。綜合相關文獻，我們可以看出RA對抗菌藥物產生耐藥性是多種因素共同作用的結果，但是這些機制在生物體內共同作用的過程是一個極其復雜的生理生化過程，對于這一方面的研究仍然任重而道遠。進一步研究RA對各種藥物的耐藥機制，不僅有利于預防和治療RA感染、指導獸醫(yī)合理應用抗生素，同時還可為研發(fā)新型藥物、制定有效治療方案提供理論依據(jù)。