周 君，侯佳影，王麗萍，于文清，周 雪，劉清華

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，新疆 石河子 832008；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院昌吉分院，新疆 昌吉 831100；3.重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院感染科，重慶 401420；4.德陽(yáng)市人民醫(yī)院腫瘤科，四川 德陽(yáng) 618000)

原發(fā)性肝癌(PHC)在我國(guó)乃至全世界都具有極高發(fā)病率和致死率，發(fā)病率達(dá)4.7%，在世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤中居于第六，在癌癥致死率方面，排名第三，僅在肺癌與結(jié)直腸癌之下[1]。在世界新增男性肝癌人員中，我國(guó)占據(jù)了1/2左右，同時(shí)肝癌位于男性癌癥死亡譜第二位[2]。因此肝癌疾病負(fù)擔(dān)長(zhǎng)期居高不下，在我國(guó)西部和農(nóng)村地區(qū)尤其突出[3]。肝癌常隱匿發(fā)病，多數(shù)病例在進(jìn)展為中晚期才被發(fā)現(xiàn)，顯著增大了早期診斷與干預(yù)治療肝癌的難度。肝癌診斷主要通過(guò)影像學(xué)、病理學(xué)以及基因測(cè)序、血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)等手段，因早期病灶較小，影像學(xué)敏感度較差，同時(shí)病理學(xué)檢測(cè)的創(chuàng)傷性，常不作為疾病診斷的首選。因此，對(duì)于無(wú)法接受病理學(xué)檢查的人員，血清腫瘤標(biāo)志物測(cè)定可起到關(guān)鍵性的補(bǔ)充作用，經(jīng)由此項(xiàng)檢查，或與其他類型診斷結(jié)果聯(lián)合判斷，實(shí)現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)肝臟腫瘤病灶。核仁磷酸蛋白(NPM)屬于核磷蛋白家族，NPM1是NPM家族中研究最為廣泛的成員，與其同屬于一個(gè)家族的蛋白還包括NPM2和NPM3。細(xì)胞中NPM的生物學(xué)功能較為復(fù)雜，涉及參與核糖體的合成，與中心體復(fù)制緊密相關(guān)，通過(guò)調(diào)控蛋白周期發(fā)揮分子伴侶功能，同時(shí)利用對(duì)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)影響細(xì)胞增殖和凋亡[4]。研究發(fā)現(xiàn)它在增殖細(xì)胞中比在靜止細(xì)胞中表達(dá)水平顯著提高[5]。目前國(guó)內(nèi)外多篇文獻(xiàn)報(bào)道NPM在惡性血液系統(tǒng)疾病、肺腺癌、宮頸鱗癌、膀胱癌及口腔鱗狀細(xì)胞癌[6-8]等多種腫瘤性疾病中高表達(dá)，且NPM表達(dá)上調(diào)大多正向相關(guān)于腫瘤的形成、遷移與侵襲。另有文獻(xiàn)提示NPM在部分乳腺癌[9]及胃癌組織中[10]表達(dá)低于相關(guān)癌旁及正常組織，此結(jié)果表明，在胃癌(GC)、乳腺癌(BC)內(nèi)NPM對(duì)腫瘤可能起著抑制效應(yīng)。2015年Ahuja R等發(fā)現(xiàn)，在慢性乙型病毒性肝炎(乙肝，CHB)中NPM可介導(dǎo)HBx(乙肝病毒x蛋白)發(fā)揮致癌效應(yīng)，NPM升高常與預(yù)后不良存在關(guān)聯(lián)[11]。楊瓊等認(rèn)為，NPM會(huì)提高肝纖維化速度，通過(guò)使NPM沉默表達(dá)和對(duì)其進(jìn)行敲除途徑，能夠下調(diào)相關(guān)肝纖維化標(biāo)志基因，如基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、Collagen Ⅰ與ACTA2等[12]。本研究通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)NPM在健康體檢者、CHB、肝炎后肝硬化(LC)及乙肝相關(guān)性原發(fā)性肝癌(PHC)患者血液和尿液中的表達(dá)水平，以期對(duì)診斷原發(fā)性肝癌提供新思路。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2020年10月～2021年5月本院相關(guān)科室就診的體檢健康者(HE)、CHB、肝炎后LC及乙肝相關(guān)性PHC患者295例。男156例(53%)，女139例(47%)，年齡(52.82±12.49)歲。67例HE為對(duì)照組，65例CHB患者、76例LC患者、87例乙肝相關(guān)性PHC患者為試驗(yàn)組。在年齡上，比較慢性乙肝組、LC組未見(jiàn)明顯區(qū)別，其余組別皆顯示明顯區(qū)別(P<0.05)。見(jiàn)表1。試驗(yàn)獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)準(zhǔn)可，受試者在試驗(yàn)前均被詳細(xì)告知相關(guān)注意事項(xiàng)并由本人及家屬簽署知情同意書(shū)。

表1 研究對(duì)象基本信息

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn)：①CHB患者、LC患者需與我國(guó)《慢性乙型肝炎防治指南》(2015版)[13]所示診斷條件相符；②乙肝相關(guān)性PHC病例符合我國(guó)2017年《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》[14]診斷要求；③在Child-pugh分級(jí)中，肝功能屬于A級(jí)、B級(jí)；④各組病例自愿參加本臨床研究，在本院存有完整臨床資料。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型病毒性肝炎(不含乙肝)及其所致的肝硬化、肝癌；②合并其他類型惡性腫瘤；③繼發(fā)性肝癌；④在Child-pugh分級(jí)中，肝功能屬于C級(jí)與/或大量腹水的存在；⑤合并泌尿系炎性疾病或其他慢性基礎(chǔ)疾??；⑥參與度差，漏脫風(fēng)險(xiǎn)高的患者。

1.3方法：所有入組對(duì)象于標(biāo)本采取前1天22∶00后禁食，次日晨抽取外周靜脈血5 ml置于EDTA采血管中(紫頭管)，同時(shí)收集清晨中段尿標(biāo)本5 ml置于尿管，靜置后使用離心機(jī)(鑫奧GENIUS 4K)以4 000 r/min離心10 min，二者上清液均分裝于無(wú)酶EP管后冰箱凍存?zhèn)溆?。采?gòu)泉州市九邦生物科技有限公司的NPM通過(guò)ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血、尿樣本，具體操作嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用美國(guó)Bio-Tek(博騰)ELx800多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度檢測(cè)。利用實(shí)驗(yàn)所獲OD值建立坐標(biāo)系繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線以推算血清、尿標(biāo)本NPM含量。

2 結(jié)果

2.1血液常規(guī)、生化功能、凝血功能分析表：收集HE、CHB、LC、PHC病例的相關(guān)臨床資料，統(tǒng)計(jì)分析提示各組紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、血小板(PLT)、清蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBIL)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)及凝血酶原活動(dòng)度(PTA)、凝血酶原時(shí)間(PT)、INR比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。四組肌酐值(Cr)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(皆P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 血常規(guī)、生化、血凝指標(biāo)表達(dá)情況[P50(P25，P75)]

2.2血清、尿液NPM表達(dá)水平：血清NPM在HE中表達(dá)明顯低于CHB組、LC組及PHC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；LC組、PHC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；尿液NPM在試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3，圖1。

表3 血液、尿液NPM在原發(fā)性肝癌不同病理階段表達(dá)水平[P50(P25，P75)，ng/ml]

注：與HE組比較，①P<0.001

2.3血清NPM對(duì)PHC的診斷效能：血清NPM對(duì)乙肝、肝硬化、肝癌均有一定診斷價(jià)值，當(dāng)約登指數(shù)最大為0.34時(shí)，可檢出在診斷肝癌上，實(shí)現(xiàn)50.0%的敏感度，與84.0%的特異度，AUC=0.682。見(jiàn)表4，圖2。

表4 血清NPM診斷原發(fā)性肝癌的效能(ng/ml)

圖2 各指標(biāo)單一與結(jié)合診斷PHC的ROC曲線

2.4血清甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、糖類抗原199(CA199)、NPM對(duì)PHC的診斷價(jià)值：統(tǒng)計(jì)分析四組對(duì)象的一般臨床資料(血清AFP、CEA、CA199)，將其與血清NPM相結(jié)合進(jìn)行肝癌聯(lián)合診斷，描繪ROC曲線下面積。由表可知：與血清CEA、AFP、CA199聯(lián)合測(cè)定能夠促進(jìn)肝癌診斷的靈敏度提升。見(jiàn)表5，圖2。

表5 血清NPM與AFP、CEA、CA199對(duì)原發(fā)性肝癌的診斷價(jià)值比較

2.5NPM在AFP陰性PHC中的診斷價(jià)值：臨床實(shí)踐中，觀察到一些PHC患者血清AFP表達(dá)低于預(yù)期診斷水平，從而降低的肝癌患者檢出率。本研究所收集的肝癌組中部分患者表現(xiàn)AFP陰性，統(tǒng)計(jì)處理這些患者的血清NPM表達(dá)量，并繪制ROC曲線，在確定約登指數(shù)最大為0.403時(shí)，AUC等于0.713 9，另特異度、靈敏度各是67.6%、72.7%。結(jié)果表明NPM對(duì)血清AFP陰性PHC患者也有一定的診斷價(jià)值。見(jiàn)圖3。

圖3 血清NPM診斷AFP陰性原發(fā)性肝癌的ROC曲線

3 討論

NPM的快速穿梭功能使其參與到許多細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中[15]。此外，NPM染色體變異可影響細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育[4]。目前多篇文獻(xiàn)報(bào)道NPM與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系，可用于腫瘤的早期診斷?，F(xiàn)有文獻(xiàn)里關(guān)于血液中NPM的報(bào)道以血液系統(tǒng)疾病居多，暫未檢索到尿液中NPM研究的報(bào)道。

本試驗(yàn)通過(guò)ELISA法檢查試驗(yàn)組與對(duì)照組血清、尿液NPM表達(dá)水平，探究其在原發(fā)性肝癌中的表達(dá)規(guī)律及臨床意義。本研究血清NPM檢測(cè)結(jié)果與任鵬飛等提出的血清NPM單項(xiàng)對(duì)肝癌的診斷價(jià)值A(chǔ)UC可達(dá)0.713 9的結(jié)論相符[16]。

NPM在各組尿液檢測(cè)中表達(dá)無(wú)顯著差異。查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)目前尚無(wú)關(guān)于NPM在尿液中的報(bào)道。周金煦等檢測(cè)血液、膽汁及尿液中AFP表達(dá)水平時(shí)發(fā)現(xiàn)，尿檢中APF含量常與肝癌瘤體大小、腫瘤分期以及血液AFP表達(dá)呈正相關(guān)，且通常僅占血液的0.3%[17]。丁俊峰發(fā)現(xiàn)尿液中核基質(zhì)蛋白22(NMP-22)含量在膀胱癌術(shù)后降低約2.3倍[18]?？紤]腫瘤動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞核內(nèi)物質(zhì)活躍，引起表達(dá)增高，在根治或減瘤術(shù)后表達(dá)驟降。由于本次研究所選取試驗(yàn)病例偏少，未對(duì)原發(fā)性肝癌患者進(jìn)行具體臨床分期及治療方式篩查，不除外為統(tǒng)計(jì)誤差所致，后續(xù)可經(jīng)由提高樣本量途徑實(shí)施再次驗(yàn)證，以探究原發(fā)性肝癌中尿液NPM的表達(dá)情況。

NPM在乙肝、肝硬化、肝癌患者血液中表達(dá)出現(xiàn)呈遞增狀態(tài)，云徑平等在觀察鼠肝切除術(shù)中發(fā)現(xiàn)NPM在肝臟再生過(guò)程中呈拋物線式表達(dá)，肝臟作為重要代謝器官其再生及修復(fù)能力極強(qiáng)[19]。乙肝病毒不斷復(fù)制推進(jìn)病情進(jìn)展過(guò)程中，肝細(xì)胞長(zhǎng)期處于壞死與修復(fù)相互交替的狀態(tài)，NPM高表達(dá)可能在乙型病毒性肝炎病程發(fā)展中存在提示意義，可作為肝再生過(guò)程中評(píng)價(jià)肝細(xì)胞增生程度的標(biāo)記物。

由于肝炎后肝硬化是慢性乙型病毒性肝炎向原發(fā)性肝癌進(jìn)展轉(zhuǎn)化的必由病理階段，血清NPM在診斷PHC方面可能起著關(guān)鍵性作用。Liu M團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)NPM1抗體多出現(xiàn)于肝癌早期，檢測(cè)其陽(yáng)性率可達(dá)22.4%[20]。王科妍等對(duì)PHC進(jìn)行分期研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，NPM等指標(biāo)在肝硬化組中略高于TNM-Ⅰ期肝癌組，TNM-Ⅰ期肝癌組高于其他分期肝癌組，且均高于健康對(duì)照組[21]。既往通過(guò)收集研究PHC患者確診前12個(gè)月、9個(gè)月、6個(gè)月、3個(gè)月的血清發(fā)現(xiàn)越接近肝癌診斷時(shí)間點(diǎn)NPM陽(yáng)性率越高[22]。楊瓊提出NPM、ACTA2和p-AKT/p-mTOR蛋白質(zhì)在由TGF-β、LX-2細(xì)胞激活的肝星狀細(xì)胞中高表達(dá)，對(duì)NPM基因行沉默表達(dá)或敲除處理，可使MMP9、ACTA2與Collagen Ⅰ這三類肝纖維化標(biāo)志基因表達(dá)下調(diào)，NPM此調(diào)控功能的達(dá)成可能離不開(kāi)Akt途徑[12]。李祺福等等在對(duì)SMMC-7721的研究中發(fā)現(xiàn)NPM與c-Fos、c-Myc、mtP53、Rb等基因共同定位在細(xì)胞核基質(zhì)上及細(xì)胞中，研究提示NPM可能通過(guò)改變其分布與表達(dá)、與原癌基因和抑癌基因的互相作用、蛋白質(zhì)修飾來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化[23]。

臨床方面，大多將AFP當(dāng)做肝癌標(biāo)志物來(lái)應(yīng)用。Wang T在研究[24]中發(fā)現(xiàn)NPM自身抗體在甲胎蛋白陰性肝癌中陽(yáng)性表達(dá)率為21.4%。任鵬飛還發(fā)現(xiàn)自身抗體聯(lián)合診斷AFP陰性的肝癌的陽(yáng)性率為89.7%[16]。說(shuō)明血清NPM對(duì)進(jìn)一步篩選AFP陰性肝癌病例仍有潛在價(jià)值，可為AFP陰性病例診斷提供新思路。曾有研究[16]提示AFP聯(lián)合NPM在內(nèi)的自身抗體檢測(cè)肝癌的陽(yáng)性檢出率為96.6%，表明各生物標(biāo)志物聯(lián)合診斷可不同程度上提高原發(fā)性肝癌檢出率[25]。本試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析NPM與AFP、CEA、CA199四項(xiàng)聯(lián)合診斷原發(fā)性肝癌敏感度提高至63.0%，AUC=0.740，高于各指標(biāo)單獨(dú)診斷價(jià)值。此時(shí)特異度稍降為78.1%，結(jié)合早期肝癌癥狀體征難以察覺(jué)、檢出難度大等特點(diǎn)，此時(shí)對(duì)高敏感性指標(biāo)的要求更為迫切，可見(jiàn)，聯(lián)合診斷不僅可使診斷敏感度大幅提升，還不會(huì)明顯影響特異度，有助于早期肝癌的診治。

綜上所述，PHC血液中NPM過(guò)表達(dá)，在早期肝癌及肝硬化中尤甚，提示NPM與腫瘤發(fā)生發(fā)展存在良好相關(guān)性。同時(shí)對(duì)于APF陰性PHC病例而言NPM仍存在不錯(cuò)的檢出率。NPM與其他常見(jiàn)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合診斷PHC效率可得到顯著提升，可見(jiàn)其具備成為肝癌腫瘤標(biāo)志物的潛力。目前尚不知曉NPM通過(guò)何種生物機(jī)制在原發(fā)性肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)化過(guò)程中發(fā)揮作用，研究其作用機(jī)制可能為肝癌化學(xué)治療、靶向治療以及耐藥性等方面提供全新解題思路，故研究其病理機(jī)制可作為本試驗(yàn)的后續(xù)主要方向。