吳永力 方漢剛 陳靜 閆瑞承

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是結(jié)直腸黏膜上皮起源的消化道惡性腫瘤，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后較差[1]。CRC根據(jù)TNM分期采用相應(yīng)方法進(jìn)行治療，但仍有部分病人出現(xiàn)術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，對(duì)其生存期造成嚴(yán)重威脅[2-3]。尋求有效的CRC臨床分期診斷和術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移評(píng)估指標(biāo)，有助于CRC治療方案的制定和臨床篩查術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移高危人群。有研究報(bào)道了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、糖類抗原19-9(cancer antigen 19-9，CA19-9)在食管癌病人診斷及預(yù)后判斷中的作用，微小RNA-21(miR-21)、VEGF等是影響CRC病人預(yù)后的因素[4-5]。本研究探討外周血miR-21、VEGF、CA19-9水平與CRC臨床分期和術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

2019年10月～2020年10月本院行手術(shù)治療的CRC病人62例，為CRC組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合CRC診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，經(jīng)臨床病理檢查證實(shí)；無(wú)放療、化療史，符合CRC手術(shù)指征[7]，行結(jié)腸癌根治手術(shù)；未使用糖皮質(zhì)激素治療；病人及家屬了解并知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器功能不全及其它免疫性相關(guān)性疾??；合并免疫相關(guān)性疾病或凝血功能障礙。另選取62例同期于本院體檢并經(jīng)檢查排除CRC的健康志愿者(healthy controls,HC)為HC組。CRC組年齡35～75歲，平均年齡(47.19±5.32)歲，男38例，女24例，其中TNM臨床分期I～I(xiàn)I期35例，Ⅲ～Ⅳ期27例。HC組年齡33～75歲，平均年齡(47.62±5.45)歲，男41例，女21例。兩組年齡、性別等比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、方法

1.外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)：分別于術(shù)前1周和體檢當(dāng)日清晨，采集所有入組被試空腹靜脈血3 ml，離心后取上清，采用Trizol試劑盒提取總RNA并檢測(cè)其純度和濃度，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)產(chǎn)物稀釋后作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)模板。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行引物擴(kuò)增，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以U6為內(nèi)參，引物序列見表1。用2-△△CT方法計(jì)算miR-21的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

2.血清CA19-9、VEGF水平檢測(cè)：分別于術(shù)前1周和體檢當(dāng)日清晨，采集所有入組被試空腹靜脈血3 ml，離心后取上清，采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)VEGF水平，采用化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)CA19-9水平。CA19-9陽(yáng)性診斷標(biāo)準(zhǔn)以CA19-9>27 U/L判定為陽(yáng)性。

3.隨訪及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移：62例CRC病人術(shù)后均通過(guò)門診進(jìn)行隨訪，隨訪截至2021年10月31日，隨訪12個(gè)月，直至病人死亡或隨訪結(jié)束。根據(jù)術(shù)后隨訪期間病史、癥狀體征、實(shí)驗(yàn)室、影像學(xué)和病理學(xué)檢查結(jié)果，記錄其術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生情況。

4.觀察指標(biāo)：比較CRC組和HC組外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平；比較TNM臨床分期Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期CRC病人外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平；比較術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的CRC病人外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1.兩組術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平比較見表2。結(jié)果表明，CRC組術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平高于HC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 兩組術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平比較

2.不同TNM臨床分期CRC病人術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平比較見表3。結(jié)果表明，Ⅲ～Ⅳ期CRC病人術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平均高于Ⅰ～Ⅱ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 不同TNM臨床分期CRC病人術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平比較

3.CRC組病人術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平與TNM臨床分期的Spearman相關(guān)性分析:CRC組病人術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平與TNM臨床分期呈正相關(guān)(r=0.451、0.339和0.307，P<0.05)。

4.CRC組術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病人術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平比較見表4。CRC組術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病人術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平高于無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病人，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 CRC組復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移與無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病人術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平比較

5.術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平對(duì)CRC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值：術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平檢測(cè)評(píng)估CRC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線下面積(Area Under Curve，AUC)分別為0.779、0.722和0.702，術(shù)前外周血miR-21、VEGF、CA19-9聯(lián)合檢測(cè)評(píng)估CRC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC為0.843，具有最高的預(yù)測(cè)效能(P<0.05)。見圖1、表5。

圖1 術(shù)前外周血miR-21、VEGF、CA19-9水平評(píng)估CRC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

表5 術(shù)前外周血miR-21、VEGF、CA19-9水平評(píng)估CRC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC特征

討論

腫瘤分期可描述疾病的嚴(yán)重程度，早期發(fā)現(xiàn)和治療可延長(zhǎng)生存期，提高生存質(zhì)量[8]。CRC病人早期通常缺乏典型病理表現(xiàn)，且腫瘤分期越晚，其預(yù)后越差[9]。CA19-9是腫瘤分期診斷和術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移評(píng)估常用標(biāo)志物， 具有促進(jìn)腫瘤血管生成的作用，miR-21與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，在腫瘤的臨床診治中應(yīng)用廣泛[10-11]。

本研究結(jié)果顯示，CRC組術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平高于HC組，說(shuō)明CRC病人術(shù)前外周血miR-21、VEGF、CA19-9呈現(xiàn)顯著升高趨勢(shì)。miR-21是一種具有調(diào)控功能的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及凋亡過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[12]。CA19-9是人體糖類抗原類血清腫瘤標(biāo)志物，臨床中常應(yīng)用于腫瘤臨床分期的輔助診斷[13]。腫瘤細(xì)胞在多種血管刺激生成因子誘導(dǎo)下，可合成釋放大量血管生成因子，促進(jìn)腫瘤血管生成，VEGF是其中誘導(dǎo)效應(yīng)較強(qiáng)的血管生成因子，可導(dǎo)致腫瘤血管異常生長(zhǎng)[14]。本研究結(jié)果顯示，Ⅲ～Ⅳ期CRC病人術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平均明顯高于Ⅰ～Ⅱ期。采用Spearman相關(guān)性分析外周血miR-21、VEGF、CA19-9與CRC臨床分期的關(guān)系，結(jié)果顯示，術(shù)前外周血miR-21、VEGF、CA19-9與臨床分期呈正相關(guān)，說(shuō)明隨著腫瘤惡性程度的增高，CRC病人術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平明顯升高。miR-21表達(dá)與腫瘤細(xì)胞浸、潤(rùn)侵襲能力有關(guān)，其高表達(dá)通常預(yù)示腫瘤浸潤(rùn)深度增加，病情嚴(yán)重[12]。VEGF在腫瘤細(xì)胞團(tuán)向?qū)嶓w腫瘤轉(zhuǎn)化過(guò)程中含量異常升高，對(duì)惡性腫瘤的早期篩查及臨床分期判斷具有重要的意義[14]。付蕾等[15]研究發(fā)現(xiàn)，CRC病人血清CA19-9水平與腫瘤分期及預(yù)后相關(guān)，說(shuō)明術(shù)前外周血miR-21、VEGF、CA19-9檢測(cè)對(duì)CRC病人TNM臨床分期具有較好的診斷價(jià)值。

本研究結(jié)果顯示，CRC組術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病人術(shù)前外周血miR-21相對(duì)表達(dá)量和VEGF、CA19-9水平高于無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病人，說(shuō)明術(shù)前外周血miR-21、VEGF、CA19-9與CRC病人術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)。術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的CRC病人體內(nèi)腫瘤細(xì)胞再次呈現(xiàn)異常增殖，并向其他組織、器官侵襲轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致結(jié)直腸上皮組織及其他正常細(xì)胞破壞，刺激新生血管生成，使CA19-9等腫瘤標(biāo)志物和VEGF水平升高。術(shù)后腫瘤細(xì)胞復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移常由多種miRNA調(diào)控，miR-21可通過(guò)調(diào)節(jié)血管形成等靶基因的表達(dá)使微環(huán)境改變，達(dá)到促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用。ROC分析術(shù)前外周血miR-21、VEGF、CA19-9對(duì)CRC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示，術(shù)前外周血miR-21、VEGF、CA19-9聯(lián)合檢測(cè)的AUC為0.834，說(shuō)明術(shù)前外周血miR-21、VEGF、CA19-9聯(lián)合檢測(cè)對(duì)CRC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移評(píng)估具有較好評(píng)估價(jià)值。有研究發(fā)現(xiàn)，VEGF、CA19-9水平與結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生相關(guān),聯(lián)合檢測(cè)有助于評(píng)估腫瘤轉(zhuǎn)移情況，提示臨床可將術(shù)前外周血miR-21、VEGF、CA19-9作為CRC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，CRC病人術(shù)前外周血miR-21、VEGF、CA19-9水平明顯升高，且與其臨床分期呈正相關(guān)，術(shù)前外周血miR-21、VEGF、CA19-9聯(lián)合檢測(cè)對(duì)CRC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，可作為CRC病人臨床分期及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的可靠的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。本研究的不足之處在于樣本數(shù)量有限，未對(duì)術(shù)前外周血miR-21、VEGF、CA19-9水平對(duì)CRC病人預(yù)后影響進(jìn)行具體分析。