李錦楠 崔亮 肖旭仁 吳學(xué)杰 代曉飛 李景敏

傳統(tǒng)的移植瘤模型是把人體腫瘤細(xì)胞或鼠源性腫瘤細(xì)胞通過體外篩選穩(wěn)定的細(xì)胞系，然后將其注射到不同程度的免疫缺陷的小鼠皮下組織或者原位從而構(gòu)建穩(wěn)定的移植瘤模型。連續(xù)傳代的腫瘤細(xì)胞通常無法適應(yīng)外界環(huán)境，導(dǎo)致原代腫瘤喪失了異質(zhì)性，因此不能精準(zhǔn)判斷原始腫瘤的生物學(xué)特征[1]。目前，最準(zhǔn)確的模型是病人來源的腫瘤異種移植物(patient derived xenografts，PDX)，將術(shù)后取下的新鮮腫瘤組織塊移植到存在免疫缺陷的小鼠上，已被證明適用于多種癌癥，包括膀胱癌，乳腺癌，胰腺癌，肺癌，結(jié)腸癌，肝癌以及黑色素瘤[2-8]。這些模型反映了原始腫瘤的異質(zhì)性，在體外實驗無法重現(xiàn)的原位腫瘤基質(zhì)間的相互作用。研究表明這樣的方法是適合在免疫缺陷的小鼠體內(nèi)發(fā)展RCC PDX模型[9-10]。PDX模型的最突出的優(yōu)點是保留了臨床病人腫瘤的特點：主要體現(xiàn)在原始腫瘤的組織學(xué)特征和病人腫瘤特有的基因組特征以及原始腫瘤的異質(zhì)性，均高度保存在PDX模型移植瘤中[10]。PDX模型移植瘤也包含從臨床病人來源的腫瘤基質(zhì)、免疫細(xì)胞及腫瘤生長微環(huán)境[10]。目前，PDX腫瘤模型有可能是目前具有臨床相關(guān)性較好的癌癥模型，其在預(yù)測的藥物作用平臺方面上升到了一個新的高度，能夠更加準(zhǔn)確的概括病人治療的療效。為了分析腫瘤的生物學(xué)特點，我們以腎癌病人新鮮腎癌組織為標(biāo)本來源進(jìn)行移植，構(gòu)建小鼠移植瘤模型，進(jìn)行觀察。

材料與方法

一、材料

用于建立模型的新鮮腎癌組織手術(shù)標(biāo)本來源于我院泌尿外科病人，術(shù)前診斷均為腎癌，病人編號1，65歲，男，腫瘤直徑7 cm×7 cm×5.5 cm，病理類型為腎透明細(xì)胞癌，無瘤栓，無肉眼血尿；病人編號2,29歲，女，腫瘤直徑8 cm×7 cm×6 cm，病理類型為腎實質(zhì)內(nèi)多形性上皮樣細(xì)胞腫瘤，無瘤栓，無肉眼血尿；病人編號3,67歲，男，腫瘤直徑2.1 cm×1.8 cm×1.5 cm，病理類型為腎透明細(xì)胞癌，無瘤栓，無肉眼血尿；病人編號4,65歲，男，腫瘤直徑5.5 cm×7 cm×5 cm，病理類型為腎透明細(xì)胞癌，有瘤栓，無肉眼血尿；病人編號5,70歲，女，腫瘤直徑3.8 ×3.5 ×3.5 cm，病理類型為腎透明細(xì)胞癌，無瘤栓，無肉眼血尿；病人編號6,60歲，男，腫瘤直徑6 cm×6 cm×4.5 cm，病理類型為腎透明細(xì)胞癌，無瘤栓，有肉眼血尿；病人編號7,61歲，男，腫瘤直徑5.8 cm×5.5 cm×5 cm，病理類型為腎透明細(xì)胞癌，無瘤栓，無肉眼血尿。術(shù)中標(biāo)本切除后，立即放入0 ℃含10%的胚牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，運送至實驗室，所構(gòu)建的移植瘤模型腫瘤組織，術(shù)后常規(guī)病理診斷為腎癌。應(yīng)用NOD-SCID小鼠：該小鼠是NOD小鼠和SCID(severe combined immunodeficiency)小鼠雜交后得到的，其中SCID小鼠是非肥胖型糖尿病或重癥聯(lián)合免疫缺陷小鼠，是在prkdcscid基因位點發(fā)生純合子基因突變形成的，T細(xì)胞和B細(xì)胞喪失基本功能，并且NOD小鼠的巨噬細(xì)胞存在功能缺陷、補(bǔ)體和NK細(xì)胞功能降低。本實驗所用的NOD-SCID小鼠均是在SPF條件下飼養(yǎng)的6～8周雌/雄小鼠。

二、方法

1、腎癌PDX NOD-SCID小鼠皮下移植瘤模型的建立：6～8周齡的NOD-SCID小鼠飼養(yǎng)在SPF級屏障環(huán)境中，適應(yīng)環(huán)境不少于3天。將從手術(shù)室獲得的腎癌手術(shù)標(biāo)本，放入冰浴的含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基里。運送至實驗室，在超凈臺內(nèi)，將冰DMEM培養(yǎng)基倒掉，加入無菌生理鹽水，反復(fù)洗滌3次。將所有臨床標(biāo)本倒入放有無菌生理鹽水的小皿中，并將較大塊的腫瘤組織分離成體積<3 mm×3 mm×3 mm的組織碎片，并相應(yīng)的去除壞死組織以及包膜等的結(jié)締組織。將組織平均分成多份，放入提前混勻的加有75 μl PBS和75 μl Matrigel基質(zhì)膠的EP管中，放在冰上保存。取NOD-SCID小鼠，按照70 mg/kg的比例，采用3%戊巴比妥鈉溶液腹腔麻醉的方式麻醉小鼠，碘伏消毒小鼠背部皮膚，無菌棉球擦拭干凈，用高溫高壓滅菌過的眼科組織剪開背部皮膚，切口約0.4～0.5 cm，使用組織鉗鈍性剝離皮下組織，用移液器抽出150 μl含有Matrigel的組織塊注入皮下組織，用5/0絲線縫合傷口，碘伏消毒。重復(fù)上述做法分別接種于背部左上、左下、右上、右下4個位置。術(shù)后放回籠中待蘇醒。定期觀察小鼠傷口的恢復(fù)情況、精神、活動、毛發(fā)及飲食情況等；觀察并記錄局部皮下移植瘤體積、成瘤時間、成瘤概率、存活和死亡率。最后處死小鼠取出移植瘤，觀察其外觀、大小，并分別作常規(guī)病理切片HE染色，觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)特征。

2、腎癌PDX NOD-SCID小鼠原位腎包膜下移植瘤模型的建立：術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉同方法1，于小鼠背部中段剪開一約2 cm切口，鈍性分開皮下組織，尋找到脊柱中下段，用眼科剪打開小鼠腹腔，在肝臟靠脊柱內(nèi)側(cè)尋找腎臟，并完整暴露腎臟，用20 G套管針行腎包膜下穿刺，注意輕柔，誤損傷腎實質(zhì)，用無齒眼科鑷從破口處將腎包膜提起，將小塊腫瘤組織利用另一把眼科鑷輕輕放入包膜下，并向上推至包膜完整部位，需注意小鼠腎臟較脆，易出血損傷，操作需輕柔。腎臟還原原位，用5-0絲線連續(xù)縫合腹壁，再用5-0絲線單純間斷縫合皮膚，將傷口表面血漬用碘伏擦凈，放入籠中等待蘇醒。

結(jié)果

1、小鼠荷瘤生長情況及成瘤潛伏期：腎癌標(biāo)本移植后成瘤潛伏期分別為74天，86天，65天，58天，53天及47天，平均約63.83天，于種植部位可捫及花生粒大小的腫瘤，皮下活動度小，呈紅色，質(zhì)地稍硬呈實體腫塊，隨后腫瘤體積逐漸增大，小鼠出現(xiàn)程度不等的消瘦、活動度減弱等惡病質(zhì)情況。

2、小鼠腫瘤生長速度及成瘤率：臨床病人腎癌活體標(biāo)本在經(jīng)過處理后，在NOD-SCID小鼠皮下行原代移植，每例臨床標(biāo)本移植2只小鼠，共14只。結(jié)果，6只小鼠成功移植，分別來自6例不同的臨床病人。因此，原代小鼠的移植成瘤率為42.86%。計算相對腫瘤體積(相對腫瘤體積=0.52×長徑×短徑2)。見表1。

表1 移植瘤生長體積變化(mm3)

3、小鼠移植瘤病理學(xué)檢查：將所有成瘤小鼠做常規(guī)病理切片，HE染色，可觀察到除3號小鼠屬于瘤樣增生外，其他人腎癌移植瘤均可看到腎臟透明細(xì)胞癌的特征。見圖1～3。

結(jié)節(jié)內(nèi)可見邊緣處為腫瘤細(xì)胞密集似有排列，鮮見核分裂相。瘤樣增生可能性大圖1 移植腫瘤組織(HE×100)

可見腫瘤局部區(qū)域為腫瘤細(xì)胞部分有排列，鮮見核分裂相。屬于高分化腎透明細(xì)胞癌圖2 移植腫瘤組織(HE×100)

腫瘤結(jié)節(jié)內(nèi)可見邊緣處有癌細(xì)胞密集，可見核分裂相。癌結(jié)節(jié)中心可見大片的紅染壞死區(qū)域，多為崩解碎裂的腫瘤細(xì)胞。屬于低分化腎透明細(xì)胞癌。圖3 移植腫瘤組織(HE×100)

討論

腎癌發(fā)病率約為全身惡性腫瘤發(fā)病率的2%～3%[11]，男性發(fā)病率是女性的2倍，其中80%以上是來源于近曲小管的透明細(xì)胞癌，并以每年2%的比例遞增[12]。手術(shù)切除是臨床上最常見的治療方式。臨床上一些局部進(jìn)展期的腎癌并不少見，約20%～30%病人明確診斷腎癌時已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腎靜脈甚至腔靜脈癌栓形成，此類病人術(shù)后多預(yù)后不良，仍有20%～30%病人3年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，大大降低了病人的生存時間及生存率[13]。傳統(tǒng)的放化療對腎癌治療不敏感，特別是手術(shù)無法切除的晚期腎癌病人，預(yù)后較差[14]。

但目前從成功治療荷瘤動物模型到應(yīng)用于臨床腫瘤治療的轉(zhuǎn)化過程中，平均成功率不足8%[18]。影響轉(zhuǎn)化率的最主要的原因是：傳統(tǒng)的移植瘤模型是把人體腫瘤細(xì)胞或鼠源性腫瘤細(xì)胞通過體外篩選，并通過細(xì)胞傳代培養(yǎng)獲得穩(wěn)定的細(xì)胞系，然后將其注射到不同程度的免疫缺陷的小鼠皮下組織或者原位從而構(gòu)建穩(wěn)定的移植瘤模型。在建構(gòu)移植瘤模型時，連續(xù)傳代的腫瘤細(xì)胞一般不能適應(yīng)外界環(huán)境，從而喪失了原代腫瘤的異質(zhì)性，不能反應(yīng)原始腫瘤的生物學(xué)特征[1]。用于單一細(xì)胞株上的抗腫瘤療法難以轉(zhuǎn)化到復(fù)雜多變的臨床病人中。

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的提出與興起，對于疾病個性化治療的模式成為熱點，PDX模型具有無可替代的優(yōu)點，它是把病人術(shù)后的活體腫瘤組織移植到不同成度免疫缺陷的小鼠上，得到人源性腫瘤異種移植小鼠。

根據(jù)不同腫瘤類型，研究的問題不同，以及預(yù)期的結(jié)果不同，重要的是選擇一個準(zhǔn)確PDX模型。當(dāng)選擇合適的免疫缺陷小鼠時需要考慮以下幾個因素，包括背景特征(如腫瘤的移植敏感性)，內(nèi)源性免疫功能(如B或T細(xì)胞的存在)，繁殖能力，壽命和遺傳特征。

本研究選用6～8周雌/雄NOD-SCID小鼠進(jìn)行實驗，NOD/SCID小鼠是NOD小鼠和prkdcscid基因位點發(fā)生純合子基因突變的SCID小鼠雜交后得到的，其中SCID小鼠T細(xì)胞和B細(xì)胞喪失基本功能，NOD小鼠的巨噬細(xì)胞存在功能缺陷、補(bǔ)體和NK細(xì)胞功能降低。因此此種小鼠的腫瘤移植成活率較裸鼠要高。

在腎癌PDX模型的制作方法上，本實驗選用了兩種腫瘤移植方法：皮下移植及腎包膜下移植。皮下移植的PDX模型已經(jīng)廣泛開展，由于其簡單的步驟及腫瘤大小的容易測量，適用于對PDX模型的大量擴(kuò)增。原位移植模型是表現(xiàn)出更加相似于臨床病人腫瘤的生物學(xué)行為，尤其是在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等方面，表現(xiàn)出了極大的相似性。但對于不同腫瘤的PDX模型而言，需要有訓(xùn)練有素的外科手術(shù)技能相支持。

本研究所構(gòu)建成功的腎癌PDX模型中，移植瘤與臨床病人術(shù)后腎癌病理檢查有相似的組織學(xué)特征，腫瘤細(xì)胞部分有排列且腫瘤呈實質(zhì)狀，細(xì)胞胞體較大，胞膜清晰，胞漿較寬且透明、胞核大小不一，可見核分裂相。根據(jù)病人病理類型不同以及相同病理類型的腫瘤分化程度不一，相對應(yīng)的PDX模型的移植瘤的病理結(jié)果也不同，可見2號病人腫瘤病理類型為腎實質(zhì)內(nèi)多形性上皮樣細(xì)胞腫瘤，PDX模型移植瘤病理為瘤樣增生。其余臨床病人的病理結(jié)果均為腎臟的透明細(xì)胞癌，腎癌PDX模型移植瘤的病理結(jié)果也為不同分化程度的腎透明細(xì)胞癌。因此，說明腎癌PDX移植瘤在其發(fā)生發(fā)展的過程中，保留了病人原始腫瘤的組織學(xué)特性以及生物學(xué)特性，同時也保留了不同病人間腫瘤的異質(zhì)性。