劉凱 李勃 吳向天 明懷德

非小細胞肺癌占肺癌組織學亞型中的85%。肺癌轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后的關(guān)鍵因素之一，進一步研究轉(zhuǎn)移相關(guān)機制則有利于改善肺癌病人的預(yù)后。二甲雙胍是最常用的2型糖尿病一線治療藥物，因其具有潛在的抗癌作用越來越受到學界的關(guān)注。有研究表明，二甲雙胍與標準一線化療聯(lián)合可顯著改善非糖尿病晚期非小細胞肺癌病人的預(yù)后[1]。LncRNA參與了眾多生物學過程，包括細胞增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移[2]。LncRNA-H19具有促進腫瘤的作用，本研究探討二甲雙胍是否通過LncRNA-H19發(fā)揮抑制非小細胞肺癌A549的作用。

材料與方法

一、材料

1. 細胞株:A549人非小細胞肺癌細胞株購于美國ATCC細胞庫。

2.細胞實驗相關(guān)試劑:DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、100 U/ml青霉素+鏈霉素、lipofactemine3000、TRIzol試劑均購自美國Invitrogen公司；基質(zhì)膠購自于康寧公司；引物合成項目購自上海生工生物工程股份有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit)、real-time PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq Ⅱ)均購自日本Takara公司；pc-H19過表達質(zhì)粒購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)： A549人非小細胞肺癌細胞株培養(yǎng)于含雙抗的10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中。

2.過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：本研究所涉及pcH19過表達質(zhì)粒由吉瑪基因設(shè)計、合成、驗證。使用Lipofactemine3000進行轉(zhuǎn)染，48 小時后進行后續(xù)實驗。

3.細胞RNA抽提及qRT -PCR ： 使用TRIzol法提取細胞RNA并檢測濃度，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進一步進行qRT-PCR。qRT-PCR程序使用產(chǎn)品說明書推薦程序。本實驗涉及引物序列如下：U6(人)，F(xiàn)-5'-GCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，R-5'-CGAATTTGCGTGTCATCCTT-3'；LncRNA-H19(人)，F(xiàn)-5'-TGCTGCACTTTACAACCACTG-3'，R-5'-ATGGTGTCTTTGATGTTGGGC-3'。以U6表達量作為內(nèi)參，并使用2-△△Ct值計算靶基因的相對表達量。

4.細胞遷移及侵襲實驗：將基質(zhì)膠鋪于Transwell的上層小室中，成膜后進行侵襲實驗(遷移實驗無需使用基質(zhì)膠)。上層小室中加入約5×104個細胞，下層小室加入含20% FBS的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48小時后取出小室，經(jīng)PBS清洗、4%多聚甲醛固定后使用結(jié)晶紫染色，棉簽拭去上層未遷移細胞后顯微鏡觀察拍攝，統(tǒng)計各組細胞遷移、侵襲的情況。

三、統(tǒng)計學方法

結(jié)果

1.二甲雙胍抑制A549細胞的遷移及侵襲能力:Transwell遷移的結(jié)果與對照組結(jié)果比較見圖1A。 40 mM二甲雙胍處理A549細胞48小時可顯著抑制腫瘤細胞的遷移能力，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Transwell侵襲實驗的結(jié)果與對照組比較見圖1B。 結(jié)果提示,40 mM二甲雙胍同樣可以抑制A549細胞的侵襲能力，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

A:Transwell遷移的結(jié)果與對照組結(jié)果比較。B:Transwell侵襲實驗的結(jié)果與對照組結(jié)果比較注：使用Transwell實驗分別驗證二甲雙胍對于A549細胞遷移及侵襲能力的抑制作用。aP<0.05。Ctrl為對照組，進行t檢驗圖1 二甲雙胍抑制A549細胞的遷移及侵襲能力

2.二甲雙胍抑制LncRNA-H19的表達:qRT-PCR結(jié)果顯示，40 mM二甲雙胍處理48小時可以顯著抑制A549細胞中LncRNA-H19的表達量,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。轉(zhuǎn)染過表達載體48小時后可顯著提升A549細胞中H19的表達量，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步使用二甲雙胍處理可以抑制H19過表達載體的作用，降低肺癌細胞系中H19的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：使用qPCR分別檢測二甲雙胍抑制A549細胞內(nèi)H19表達的作用、pc-H19的過表達效能以及二甲雙胍對于pc-H19過表達作用的拮抗效果。aP<0.05；bP<0.01；cP<0.001。Ctrl vs MET，Ctrl vs pc-H19，pc-H19 vs pc-H19+MET，分別進行t檢驗圖2 二甲雙胍抑制LncRNA-H19的表達

3.二甲雙胍通過LncRNA-H19抑制A549遷移及侵襲:Transwell遷移的結(jié)果與對照組結(jié)果比較見圖3A，MET可以顯著抑制A549細胞的遷移能力，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而pc-H19轉(zhuǎn)染后可以顯著促進A549細胞的遷移能力(P<0.05,圖3A)，而MET可以顯著抑制過表達H19的促進腫瘤遷移的能力(P<0.05,圖3A)。Transwell侵襲實驗也得出相同趨勢的結(jié)論，即MET可能通過拮抗H19發(fā)揮抑制A549侵襲能力的作用(P<0.05,圖3B)。

注：使用Transwell實驗分別檢測過表達LncRNA-H19、過表達H19+二甲雙胍處理48小時對于A549細胞遷移能力(A)及侵襲能力(B)的影響。aP<0.01；bP<0.001；cP<0.001。使用單因素方差分析。圖3 二甲雙胍通過LncRNA-H19抑制A549遷移及侵襲

討論

本研究表明，二甲雙胍在體外實驗中具有抑制非小細胞肺癌細胞系A(chǔ)549遷移及侵襲的作用，可能與抑制LncRNA-H19的表達有關(guān)。二甲雙胍廣泛應(yīng)用于糖尿病的臨床治療，越來越多的臨床研究支持二甲雙胍具有一定的抗癌作用。研究發(fā)現(xiàn)，與2型糖尿病病人相比，不合并2型糖尿病的非小細胞肺癌病人的生存率更佳[3]。研究人員進一步發(fā)現(xiàn)，使用二甲雙胍是非小細胞肺癌合并2型糖尿病病人具有良好預(yù)后的獨立因素之一[3]。除合并2型糖尿病的肺癌病人外，一項薈萃分析表明，二甲雙胍暴露與肺癌病人生存率提高顯著相關(guān)[4]。關(guān)于二甲雙胍抑制腫瘤、改善預(yù)后的機制研究主要集中于調(diào)節(jié)細胞凋亡和自噬，影響細胞增殖和死亡[5]，增強免疫細胞的抗癌活性[6]，抑制癌細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[7]，以及改善肺癌病人的耐藥性并提高療效[8]。這些發(fā)現(xiàn)均支持了二甲雙胍對非小細胞肺癌的潛在治療效果。

LncRNA-H19具有促癌作用，多種腫瘤中均表達上調(diào)。在肺癌組織中H19也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，促進肺癌細胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移[9-10]。H19可通過多種途徑促進腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移能力，Gao等[9]發(fā)現(xiàn)，H19可通過調(diào)節(jié)肺癌細胞中CDH1啟動子的甲基化表達水平，調(diào)控腫瘤細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程、增殖、腫瘤干細胞特性、抗凋亡、遷移以及侵襲能力。Liao等[10]發(fā)現(xiàn)，H19可促進肺癌細胞中間充質(zhì)標志物(波形蛋白和N-鈣黏蛋白)的表達，降低了上皮標志物(E-鈣黏蛋白)的表達，從而增強了癌細胞的侵襲能力。另外一項薈萃分析發(fā)現(xiàn)，H19的多態(tài)性(rs217727和rs2839698)與肺癌發(fā)生風險增加之間存在關(guān)聯(lián)[11]，這表明H19的異常表達可促進癌癥進展。一項以中國人群為基礎(chǔ)的病例對照研究顯示，H19基因的4個單核苷酸多態(tài)性(rs2067051、rs217727、rs2839698和rs4929984)是中國非小細胞肺癌人群中最常見的基因型。其中rs2067051和rs217727多態(tài)性對非小細胞肺癌的易感性有潛在影響[12]。Gupta等[13]報道，從痰樣本中獲得的三個LncRNAs(SNHG1、H19和HOTAIR)被證明是診斷鱗狀細胞癌的高度敏感的生物標志物組合。這些結(jié)果均顯示了H19在肺癌發(fā)生、診斷、治療中的重要作用。這些結(jié)果進一步支持我們的發(fā)現(xiàn)，LncRNA-H19/β-catenin通路是二甲雙胍治療肺癌的潛在靶點之一。今后的研究將進一步深入挖掘LncRNA-H19促進非小細胞肺癌增殖及轉(zhuǎn)移的機制，發(fā)現(xiàn)下游相關(guān)靶基因并進一步研究二甲雙胍通過H19發(fā)揮抑癌作用的分子機制。