李林，張鐸騰，渠允薇

（廈門大學(xué) 柔性電子（未來技術(shù)）研究院，福建 廈門361005）

0 引言

隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們對病理學(xué)的研究更加精細(xì)。準(zhǔn)確解析細(xì)胞/亞細(xì)胞器水平生理變化，對理解疾病的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。因此，細(xì)胞中的特定位點的檢測/監(jiān)測對于生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展具有重要意義［1］。

基于生物醫(yī)學(xué)成像的要求，研究者開發(fā)出了多種成像技術(shù)，如正電子發(fā)射型斷層掃描技術(shù)（Positron Emission Computed Tomography，PET）、磁共振成像技術(shù)（Magnetic Resonance Imaging，MRI）、透射電子顯微技術(shù)（Transmission Electron Microscopy，TEM）、熒光顯微成像技術(shù)（Fluorescence Microscopy，F(xiàn)M）等。其中熒光成像技術(shù)具有獨特的優(yōu)勢：通過采集光信號獲得圖像，對細(xì)胞的毒性較小，可以實現(xiàn)活細(xì)胞的實時成像，通過不同熒光波段的染料染色，實現(xiàn)多色成像等［2］。這些優(yōu)勢使得熒光顯微鏡在生物學(xué)的研究中有著舉足輕重的地位［3］。

自從1853年STOKES G G 首次提出熒光的概念，熒光技術(shù)的發(fā)展突飛猛進(jìn)（圖1）。1911年，隨著第一臺熒光顯微鏡的問世，熒光染料與熒光顯微鏡開始相互配合，成為研究細(xì)胞、活體生理活動的強大工具。1981年，CREMER C 和CREMER T 開發(fā)出第一臺實用的共聚焦熒光顯微鏡，大幅度提高了光學(xué)顯微鏡的分辨率［4］。但是受到光學(xué)衍射極限的制約，其極限分辨率一直無法突破200 nm［5］，無法精確觀測更細(xì)微的生物學(xué)信息，使其應(yīng)用受到了限制。為解決這一問題，HELL S W（STED）［6］、GUSTAFSSON M G L（SIM）［7］、BETZIG E 和MOERNER W（PALM）［8］、莊小威（STORM）［9］等科學(xué)家采用不同的原理和方法，突破光學(xué)衍射極限，開發(fā)出了超分辨熒光顯微鏡（Super-resolution Fluorescence Microscopy，SRFM），極大的拓展了熒光顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。成像設(shè)備和技術(shù)的進(jìn)步同時也對熒光染料的開發(fā)提出了新的要求，設(shè)計適用于超分辨熒光顯微成像的熒光染料成為亟待解決的問題。本文在介紹主要的超分辨熒光顯微成像技術(shù)原理的基礎(chǔ)上，針對不同技術(shù)對有機小分子染料的要求，歸納總結(jié)了目前報道的適用于不同超分辨熒光顯微技術(shù)的有機小分子熒光染料結(jié)構(gòu)和光物理性質(zhì)特點，同時展望了該領(lǐng)域的未來發(fā)展，旨在為超分辨熒光染料的設(shè)計提供思路。

圖1 熒光成像技術(shù)的發(fā)展Fig.1 Development of fluorescence imaging technology

1 超分辨熒光顯微技術(shù)概述

一個理想的點光源經(jīng)過物鏡后，會被投影成具有一定大小的光斑，這就是點擴(kuò)散函數(shù)（Point Spread Function，PSF）。因此物體上距離接近的兩個點，在經(jīng)過物鏡后，其PSF 會重疊，當(dāng)其中一個點的波函數(shù)的一級極大值與接近點的一級極小值重疊時，將無法分辨出這兩個點。傳統(tǒng)的熒光顯微鏡受到衍射極限的約束，其極限分辨率大約在200 nm。而細(xì)胞中的亞細(xì)胞器如線粒體、溶酶體以及細(xì)胞骨架等的直徑均小于這一數(shù)值［10］。因此，傳統(tǒng)的顯微技術(shù)無法獲得這些亞細(xì)胞單位的精確結(jié)構(gòu)。

為了突破衍射極限，化學(xué)和物理學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家聯(lián)合，基于不同的原理搭建了超分辨熒光顯微鏡，目前，應(yīng)用最為廣泛的主要有以下三類技術(shù)：1）基于激發(fā)態(tài)熒光受激損耗的受激輻射損耗熒光顯微技術(shù)（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED）；2）基于熒光分子開關(guān)效應(yīng)的單分子定位成像技術(shù)（Single-molecule Localization Super-resolution Microscopy，SMLM），主要包括光活化定位顯微技術(shù)（Photoactivated Localization Microscopy，PALM）和隨機熒光重構(gòu)顯微技術(shù)（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）；3）基于余弦結(jié)構(gòu)光調(diào)制高頻信號的結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)（Structure Illumination Microscopy，SIM）為與飽和結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)區(qū)分稱為“線性SIM”。

1.1 超分辨熒光成像技術(shù)原理簡介

1994年，德國科學(xué)家HELL S W 提出了在激發(fā)光斑的外圍，引入一束中心光強為零的環(huán)形損耗光，該過程如圖2（a）所示，通過相位調(diào)制作用，使損耗光在樣品上所成的光斑為中空模式，該損耗光的中心與激發(fā)光光斑中心重合。通過受激輻射的原理，使激發(fā)光斑外圍的熒光基團(tuán)發(fā)出與損耗光相干涉的熒光，通過二向色鏡濾波，僅保留中心的短波長的熒光，從而達(dá)到縮小點擴(kuò)散函數(shù)的目的，提高成像分辨率，這就是著名的STED 技術(shù)［6］。STED 能夠?qū)崿F(xiàn)超分辨成像的關(guān)鍵在于損耗光激發(fā)下，受激發(fā)射和自發(fā)熒光之間相互競爭的非線性效應(yīng)。損耗光激發(fā)熒光團(tuán)后，不可避免的會產(chǎn)生自發(fā)輻射，隨著損耗光功率的增強，自發(fā)輻射逐漸被受激輻射取代，當(dāng)功率達(dá)到某一強度，絕大部分電子將以受激輻射的形式返回基態(tài)［11］。因此，STED 的分辨率與損耗光的光強相關(guān)，損耗光功率越高，分辨率越高。

1995年，BETZIG E 提出了利用單分子定位的方式突破衍射極限的想法［12］：通過降低熒光分子“開啟”的比例，限制同一時間發(fā)射光子的熒光分子數(shù)量，計算對應(yīng)熒光分子PSF 的中心位置，通過大量的成像和計算，將所有熒光團(tuán)的中心位置擬合在一張圖上，最終獲得超分辨的熒光成像（圖2（b））。2006年，BETZIG E借助一種可激活的變種綠色熒光蛋白，實現(xiàn)了該設(shè)想并獲得了20～30 nm 分辨率的成像，即PALM 技術(shù)［8］。同年，莊小威課題組采用類似原理，利用光調(diào)控有機小分子熒光染料對（Cy3-Cy5），開發(fā)出了STORM 技術(shù)［9］。基于對PSF 的定位精度，單分子定位成像往往需要數(shù)千幀的圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行重構(gòu)，以犧牲時間的方式來換取高空間分辨率，成像速度受到了一定的限制。因此，在對活細(xì)胞進(jìn)行觀測時，為了平衡成像時間和空間分辨率，需要增加激發(fā)光功率，提高采樣頻率，獲得超分辨熒光圖像［13］。

圖2 不同超分辨熒光成像技術(shù)的原理Fig.2 Principle of different super-resolution fluorescence imaging techniques

在空間頻域中，光學(xué)傳遞函數(shù)（Optical Transfer Function，OTF）是PSF 的傅里葉變換結(jié)果。顯微鏡收集到的頻譜，等于被觀察物體的頻譜與OTF 的卷積。因此，提高OTF，可以提升成像的分辨率。GUSTAFSSON M G L 在2000年發(fā)明的線性SIM 技術(shù)通過在激發(fā)光前加入一個光柵，將勻場照明光替換為余弦結(jié)構(gòu)光，通過余弦調(diào)制相位，將高頻信號調(diào)制到低頻信號中，通過旋轉(zhuǎn)光柵，可以得到各個方向的高頻頻譜，最后，通過電腦解析，得到包含有高頻信號的圖像（圖2（c））。利用線性SIM 技術(shù)，可以使物體的分辨率提高一倍，達(dá)到100 nm 左右［7］。2005年GUSTAFSSON M G L 在線性SIM 的基礎(chǔ)上，通過引入非線性光學(xué)，開發(fā)出具有更高分辨率的飽和結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)（Saturated Structured Illumination Microscopy，SSIM，也稱為非線性SIM）［14］。

1.2 超分辨熒光染料的設(shè)計要求

通過對有機小分子染料進(jìn)行針對性的結(jié)構(gòu)修飾，可以提高其性能，使有機小分子染料滿足使用場景的需求。染料進(jìn)入細(xì)胞的能力稱為透膜能力，提高染料的透膜能力有助于改善染料的染色效果，降低染料的用量，減少非特異性標(biāo)記，從而提高成像的信噪比。由超分辨熒光顯微成像技術(shù)的原理可知，相較于傳統(tǒng)的共聚焦熒光顯微成像，超分辨熒光顯微成像需要對成像樣品進(jìn)行更多次數(shù)的掃描以收集足夠數(shù)量的光子，從而獲得更高分辨率的成像［15］。這一特點要求熒光染料具有更加優(yōu)異的光穩(wěn)定性和亮度［16］。同時，超分辨熒光顯微成像需要高功率的激發(fā)光源，這就需要降低染料的光毒性，避免對細(xì)胞的過度損傷。

針對不同的超分辨熒光顯微成像技術(shù)，有機小分子染料結(jié)構(gòu)特點有所不同。SMLM 技術(shù)需要限制同一時間熒光開啟的分子數(shù)量，因此要求熒光分子具有閃爍能力（STORM）或光激活能力（PALM）。針對STORM 成像，需要調(diào)控染料分子處于熒光態(tài)的比例，使每幀圖像獲得稀疏的熒光分子信號，并提升染料的抗光漂白能力，增加成像幀數(shù)，提升成像分辨率。而PALM 成像中，需要使染料在成像前處于暗態(tài)，降低染料的自發(fā)激活熒光，使染料可控釋放熒光，因此通常使用籠化策略來調(diào)控染料分子暗態(tài)與亮態(tài)的轉(zhuǎn)換并獲得適合的光活化量子效率。而用于STED 成像的染料分子，由于損耗光功率極高，因此，STED 成像要求染料具有優(yōu)異的抗光漂白能力，同時，需要避免損耗光對染料的二次激發(fā)，因此對染料光譜的調(diào)控十分重要。線性SIM 成像對于熒光染料沒有特殊要求，是目前活細(xì)胞成像中應(yīng)用最多的超分辨成像技術(shù)，而非線性SIM 的設(shè)計是基于熒光分子激發(fā)態(tài)飽和效應(yīng)，對分子設(shè)計有一定的要求，但目前應(yīng)用尚未普及，因此本文中不再贅述。此外，超分辨熒光顯微成像要求染料在成像時空窗口內(nèi)盡量減少擴(kuò)散，這需要將染料分子與靶向基團(tuán)結(jié)合，從而對目標(biāo)物進(jìn)行熒光標(biāo)記成像。

2 適用于STED 的有機小分子染料

2.1 對染料光穩(wěn)定性的調(diào)控

傳統(tǒng)羅丹明染料，如羅丹明B、羅丹明6G 等，具有優(yōu)異的熒光量子產(chǎn)率（Φ= 0.5～1），在生物成像中可以獲得較高的信噪比［17］。然而，較差的水溶性、低透膜能力使其容易自聚集并產(chǎn)生非特異性結(jié)合。同時，由于STED 成像要求極高的損耗光功率，傳統(tǒng)羅丹明染料的光穩(wěn)定性限制了其在超分辨熒光顯微成像中的應(yīng)用。HELL S W 課題組在羅丹明染料的4、5 號位修飾磺酸基團(tuán)（圖3，1-1，1-2，1-3），在改善羅丹明染料的水溶性和透膜能力的同時有效抑制了染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后的熒光淬滅［18］，顯著提高高功率激光照射下染料的穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上，通過氨基偶聯(lián)反應(yīng)，實現(xiàn)了細(xì)胞中微管的超分辨熒光成像。除此之外，還可以在羅丹明骨架上修飾羥基，以改善其水溶性和透膜能力，降低染料在細(xì)胞中的自聚集。然而，在烯丙基位置連接羥基的染料（R580），容易在高功率激光照射下發(fā)生光氧化，導(dǎo)致染料變質(zhì)。因此，研究者在非烯丙基和非芐基的位點引入羥基獲得了2-1（530RH）和2-2（575RH）等一系列染料（圖3），在提高了染料的水溶性和透膜能力的同時，有效提升了染料的穩(wěn)定性［19］，使其適用于STED 成像。

圖3 適用于STED 的有機小分子染料Fig.3 Small molecular organic dyes for STED

以開環(huán)內(nèi)鹽形式存在的羅丹明，其透膜能力低于閉環(huán)螺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的羅丹明。同時，由于正電荷的存在，染料容易富集到線粒體，影響對細(xì)胞其他特定位點的定位能力。在羅丹明染料的2、3 號位引入吸電子基團(tuán)，誘導(dǎo)染料向螺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化是優(yōu)化染料透膜能力的一種有效方式。但是，這種方式常導(dǎo)致染料量子產(chǎn)率的降低。為了解決透膜能力和熒光量子產(chǎn)率之間的矛盾，JOHNSSON K 等報道了一種在改善染料透膜能力的同時保持高信噪比的策略（3 系列，圖3）［20］：將羅丹明中的羧基轉(zhuǎn)化為缺電子的酰胺，這一調(diào)整在不影響羅丹明的光譜特性和熒光量子產(chǎn)率的前提下，可調(diào)控羅丹明開環(huán)-閉環(huán)結(jié)構(gòu)的動態(tài)平衡。在透膜時，染料以閉環(huán)形式存在，當(dāng)染料與目標(biāo)蛋白結(jié)合后，會向開環(huán)形式轉(zhuǎn)移，熒光增加1 000 倍。此系列染料分子覆蓋了500～700 nm 的可見光區(qū)波段，可以用于多色超分辨熒光顯微成像。

LAVIS L D 課題組［21］和肖義課題組［22］分別報道了對四甲基羅丹明中的N，N-二甲基氨基位點的衍生化修飾，抑制扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（Twisted Intramolecular Charge Transfer，TICT）效應(yīng)來獲得具有高亮度和穩(wěn)定性的染料；河北大學(xué)高保祥教授等通過在苯環(huán)6 號位引入甲氧基的策略提升硅基羅丹明的亮度，同時由于兩個甲氧基的存在對羅丹明母體結(jié)構(gòu)9 號位具有空間位阻保護(hù)作用，提高了染料的穩(wěn)定性［23］。HELL S W 等在2019年發(fā)現(xiàn)，在激光照射染料樣品時，會發(fā)生光氧化導(dǎo)致羅丹明上的氮脫烷基化，進(jìn)而導(dǎo)致染料光譜的藍(lán)移。尤其在STED 成像中，使用的激光器功率高，為了避免光氧化，HELL S W 等設(shè)計開發(fā)了一系列三芳基甲烷取代的羅丹明4（圖3），可以在光照下保持穩(wěn)定，防止光譜藍(lán)移，有效提高染料的光穩(wěn)定性［24］。此類設(shè)計具有普適性，可以拓展到羅丹明衍生物中以提升染料的光穩(wěn)定性。

2.2 對熒光光譜的調(diào)控

對染料熒光光譜的調(diào)控是優(yōu)化染料成像性能的重要策略。在STED 成像中，損耗光功率過大引起的光毒性是活細(xì)胞成像中迫切需要解決的問題。近紅外熒光染料在降低光損傷的同時，可以有效避免生物自發(fā)熒光的干擾，提高對生物樣本的穿透能力，受到了研究人員的廣泛關(guān)注。引入久洛尼定環(huán)（Julolidine rings）是一種促進(jìn)羅丹明分子光譜紅移的常用策略。在此基礎(chǔ)上，HELL S W 課題組在羅丹明C3 苯環(huán)上修飾吸電子的F 原子，進(jìn)一步促進(jìn)了羅丹明染料的光譜紅移（5 系列，圖3）［25］。其中，5-1（STAR635）通過引入烯丙基醇結(jié)構(gòu)，在不增加額外電荷的前提下提高了染料的水溶性和透膜能力。同時，5-1 通過增長染料與氨基反應(yīng)基團(tuán)之間碳鏈的長度，改善了其與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)效率，成功地應(yīng)用于STED 成像。

通過將IV 族元素（C，Si，Ge 等）引入到氧雜蒽結(jié)構(gòu)中，可以調(diào)控羅丹明的激發(fā)和發(fā)射波長紅移至600 nm 以上，這是由于與IV 族原子連接的甲基的s-p 軌道和熒光團(tuán)的p 軌道之間的共軛穩(wěn)定了最低未占分子軌道能級（Lowest Unoccupied Molecular Orbit，LUMO）。2008年，肖義教授課題組報道了首個硅基羅丹明染料［26］。該染料在具有近紅外激發(fā)和發(fā)射能力的同時，具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性，適用于STED 成像。然而，硅基羅丹明的開環(huán)比率較低，在常規(guī)的生理緩沖溶液中容易以閉環(huán)形式存在。因此，需要對其修飾以更好的適用于STED 成像。JOHNSSON K 課題組發(fā)現(xiàn)，硅基羅丹明與極性蛋白質(zhì)分子結(jié)合后主要以開環(huán)形式存在，據(jù)此將硅基羅丹明與多西紫杉醇（與微管蛋白特異性結(jié)合）和去溴去甲基-賈斯普拉基內(nèi)酯（與肌動蛋白特異性結(jié)合）連接，獲得了一系列性能優(yōu)異的新型染料（圖3）。當(dāng)6-1（SiR-tubulin）在體外與微管蛋白結(jié)合時，其熒光強度增強了10 倍以上；而6-2（SiR-actin）與肌動蛋白結(jié)合后則顯示出100 倍以上的熒光增強。利用6-1 和6-2，成功實現(xiàn)了活細(xì)胞中微管與肌動蛋白的超分辨熒光成像［27］?；诖嗽?，研究者使用SiRHoechst 實現(xiàn)了對細(xì)胞核中DNA 的染色并進(jìn)行了超分辨熒光成像［28］。

為了進(jìn)一步得到長波長的超分辨熒光染料，HELL S W 課題組在硅基羅丹明的基礎(chǔ)上，連接了氟化苯環(huán)，在不影響熒光量子產(chǎn)率的前提下獲得了發(fā)射波長在680 nm 的染料7-1 和7-2（圖3）。通過連接蛋白質(zhì)標(biāo)簽，可以實現(xiàn)對細(xì)胞骨架的精確定位，并且這兩個染料可以選擇800 nm 的損耗光，有效減少了損耗光對細(xì)胞的損傷［29］。

羅丹明染料（包括硅基羅丹明染料）的斯托克斯位移（Stocks shift）一般在20～40 nm 范圍內(nèi)，容易被損耗光二次激發(fā)，導(dǎo)致信號干擾。KLAN P 課題組以及WU L 和BURGESS K 課題組在前期的工作中提出：羅丹明的9 號位引入9-氨基吡喃酮支架是促進(jìn)羅丹明斯托克斯位移增加的有效方法［30，31］?；诖耍琀ELL S W 課題組設(shè)計了C、Si、Ge 取代O 原子的新型羅丹明染料（8 系列，圖3），并獲得了超過100 nm 的斯托克斯位移（圖3），有效避免了損耗光對樣品的二次激發(fā)［32］。

除了羅丹明染料外，香豆素染料的分子結(jié)構(gòu)小，亮度高等特點也受到了研究者的關(guān)注。HELL S W 課題組設(shè)計了一系列大斯托克斯位移的香豆素類染料（9 系列，圖3）［33］。其中9-4 具有超過200 nm 的斯托克斯位移，并具有優(yōu)異的熒光量子產(chǎn)率。通過引入三氟甲基結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步提高了染料的光穩(wěn)定性，使其適用于STED 成像。基于不同母體結(jié)構(gòu)的超分辨熒光染料的開發(fā)，也為設(shè)計新型超分辨熒光探針（Fluorescent probe）提供了更多的染料選擇。

2.3 協(xié)同策略調(diào)控?zé)晒馊玖闲阅?/h3>

染料多種性能的共同提升對于新型染料的設(shè)計開發(fā)具有重要意義。然而亮度、光譜、穩(wěn)定性等性能的共同提升對染料的結(jié)構(gòu)設(shè)計以及合成提出了很高的要求，通常難以實現(xiàn)。近期，袁林教授和王璐課題組合作報告一種協(xié)同策略，同時改善常規(guī)熒光團(tuán)的光穩(wěn)定性、亮度以及斯托克斯位移。研究者將具有調(diào)控電子密度的四氫吡嗪基團(tuán)引入到傳統(tǒng)的羅丹明中，合成了具有振動結(jié)構(gòu)的不對稱羅丹明（9，圖3）。該策略可以增加染料激發(fā)態(tài)的振動弛豫，并抑制了扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的形成，提高了亮度和光穩(wěn)定性，同時增加了斯托克斯位移［34］。這種結(jié)合了抑制扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移和不對稱合成的協(xié)同策略為構(gòu)建更優(yōu)異的STED 染料提供了新的思路。

3 適用于SMLM 的有機小分子染料

目前，常用的SMLM 主要包括PALM 和STORM。PALM 技術(shù)最初是通過光活化的熒光蛋白（Fluorescent protein）實現(xiàn)的，但依賴基因編碼的技術(shù)缺陷限制了其應(yīng)用場景，后來逐步發(fā)展到可以通過有機小分子染料完成成像；而STORM 技術(shù)的實現(xiàn)，得益于莊小威以及SAEUR M，TINNIFILED P 等在2005年報道的Cy5 染料在暗態(tài)與亮態(tài)之間切換的光閃爍現(xiàn)象［35，36］。盡管使用Cy3-Cy5 分子對可以對活細(xì)胞進(jìn)行單分子定位成像［37］，但仍需要借助氧化還原緩沖溶液，這在某種程度上限制了STORM 技術(shù)對活細(xì)胞中生理過程的監(jiān)測。光活化/光閃爍的超分辨熒光染料的匱乏和缺陷，促使研究者們著力于開發(fā)新的結(jié)構(gòu)體系的同時，不斷優(yōu)化其光物理性能。

3.1 光活化超分辨染料

羅丹明染料在開環(huán)-閉環(huán)狀態(tài)下具有高信噪比，同時，其高量子產(chǎn)率的特性使得這類染料在受激后可以輻射較多光子，滿足SMLM 成像的要求。因此，在羅丹明結(jié)構(gòu)上修飾適當(dāng)?shù)幕\化基團(tuán)，活化光調(diào)節(jié)羅丹明“off”到“on”的過程，可以實現(xiàn)PALM 成像（圖4）。早在1977年，KNAUER K H 和GLEITER R 就報道了羅丹明酰胺的光致變色反應(yīng)［38］。2007年，HELL S W 等通過將4-氨基鄰苯二甲酰亞胺作為芳基取代基對羅丹明B 進(jìn)行修飾，得到在紫外區(qū)有明顯吸收的光活化羅丹明熒光染料11（圖4）［39］。該染料分子具有極低的自發(fā)激活熒光比例（小于0.01%），在50 W·cm-2的紫外光（375 nm）光活化后，染料熒光增強，單個染料分子平均可以收集到900 個光子。利用該分子成功對微管蛋白進(jìn)行了超分辨熒光成像，同時，實現(xiàn)了U373MG 細(xì)胞表面的3D 成像。然而該染料通過紫外光光活化，同時染料分子的水溶性不理想，限制了其對活細(xì)胞的超分辨成像。因此，2014年，MOERNER J課題組基于染料11的思路，對羅內(nèi)酰胺的取代基進(jìn)行修飾，通過增加內(nèi)酰胺上烷烴取代物的共軛結(jié)構(gòu)和正電荷獲得更大的吸收波長紅移的染料，并獲得了活化光波長大于400 nm 的染料12-1 和12-2（圖4）［40］，該染料具有0.89%的光活化量子產(chǎn)率，可以利用更低功率（18 W·cm-2）的活化光活化，有效減少了應(yīng)用過程中紫外光對細(xì)胞的損傷。

圖4 適用于PALM 的有機小分子染料Fig.4 Small molecular organic dyes for PALM

基于光化學(xué)反應(yīng)的基團(tuán)也可以作為籠化基團(tuán)。MOERNER W E 課題組在2008年，開發(fā)出了疊氮基-二氰基亞甲基二呋喃［41］。在443 nm 的光照射下，不穩(wěn)定的疊氮結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為氨基，光活化量子產(chǎn)率為0.59%，分子內(nèi)的推拉電子結(jié)構(gòu)促使染料的熒光增強。通過結(jié)合HaloTag 蛋白標(biāo)簽，構(gòu)建了染料13（圖4），可以對活細(xì)胞中蛋白進(jìn)行標(biāo)記，實現(xiàn)PALM 成像［42］。LAVIS L D 課題組在羅丹明螺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)中引入重氮結(jié)構(gòu)作為籠化單元，構(gòu)建了無色羅丹明，設(shè)計了染料14（圖4）［43］。重氮結(jié)構(gòu)作為籠化基團(tuán)的引入縮小了籠化基團(tuán)的分子大小，提高了羅丹明的透膜能力，同時使該染料具有了優(yōu)異的熒光激活率（83.5 s）和極低的自發(fā)激活熒光比例（10-6）。光活化后，羅丹明結(jié)構(gòu)由閉環(huán)向開環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，釋放熒光。然而，該籠化基團(tuán)在光活化后會形成部分非熒光物質(zhì)，丟失部分信號。

氟硼二吡咯（BODIPY）染料同樣具有量子產(chǎn)率高，穩(wěn)定性好，生物相容性優(yōu)良的特點，因此，通過對BODIPY 母體結(jié)構(gòu)修飾籠化單元可以得到適用于PALM 成像的染料。光活化硼烷基化的BODIPY 染料15（圖4）在光照下硼烷基裂解后可被溶劑加合物所取代，光活化量子產(chǎn)率為0.12%［44］。該染料的光活化和激發(fā)過程均使用低功率激光（488 nm，160 W cm-2）為光源，對細(xì)胞的刺激較小。通過將紫杉醇與15 共價偶聯(lián)，SMITH E A 等對活細(xì)胞中的微管結(jié)構(gòu)進(jìn)行了超分辨熒光成像，為開發(fā)光活化BODIPY 超分辨熒光染料提供了新思路。RAYMO F M 和其合作者將BODIPY 與光敏感的惡嗪雜環(huán)化合物連接獲得染料16（圖4），從而調(diào)控其熒光強度與熒光光譜［45］。不同于將熒光團(tuán)通過籠化基團(tuán)完全屏蔽的設(shè)計，該染料在光活化前仍具有熒光，惡嗪雜環(huán)在光活化后與BODIPY 結(jié)構(gòu)共軛，吸收與發(fā)射光譜紅移，（激發(fā)波長從608 nm 紅移至656 nm，發(fā)射波長從623 nm 紅移至669 nm），通過收集活化后響應(yīng)波段的熒光，從而獲得超分辨成像。該染料的光活化量子數(shù)為1%，在405 nm 的激發(fā)光下，單個分子平均可以收集到2 000 個光子，可以對活細(xì)胞溶酶體進(jìn)行超分辨熒光成像，并通過與溶酶體內(nèi)蛋白質(zhì)共價結(jié)合防止染料在細(xì)胞中擴(kuò)散，優(yōu)異的信噪比使其分辨率達(dá)到了15 nm。這一設(shè)計表明籠化單元不一定需要將熒光完全屏蔽，如果可以實現(xiàn)光譜的大斯托克斯位移調(diào)控，同樣可以用于PALM 成像。

通過簡單的分子結(jié)構(gòu)調(diào)整獲得分子效能的提升是研究者追求的目標(biāo)，萊斯大學(xué)的XIAO H 課題組通過在傳統(tǒng)的熒光團(tuán)中進(jìn)行硫-氧原子替換，開發(fā)了一種簡便且通用的PALM 成像熒光染料設(shè)計策略，在可見光譜范圍內(nèi)獲得了一系列可光活化的小分子熒光染料［46］（染料17 為例）。基于理論計算，熒光團(tuán)內(nèi)的硫代羰基取代通過光致電子轉(zhuǎn)移可誘導(dǎo)熒光團(tuán)熒光淬滅，而熒光團(tuán)處于有氧環(huán)境能由可見光（365～630 nm）活化，光活化量子效率為2.6%。在這一過程中，硫籠熒光團(tuán)可以有效地被氧化為其氧代衍生物，從而恢復(fù)熒光團(tuán)的熒光，活化后熒光亮度提升260 倍。這一設(shè)計策略在最小的結(jié)構(gòu)改變下獲得了優(yōu)異的熒光性能的調(diào)整，為PALM 超分辨染料的設(shè)計提供了新的思路。

傳統(tǒng)羅丹明結(jié)構(gòu)容易受到pH 和極性變化的干擾，在緩沖溶液或細(xì)胞中熒光開關(guān)狀態(tài)隨機切換，干擾了光活化超分辨熒光成像的精度。肖義課題組通過在螺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)中直接引入羧基，構(gòu)建了甘氨酸羅丹明染料（18，圖4）。在光激活開環(huán)釋放熒光的同時，引入的羧基與氮負(fù)離子形成氫鍵，穩(wěn)定了羅丹明染料的開環(huán)結(jié)構(gòu)［47］。通過與傳統(tǒng)羅丹明對比，18 具有更高的穩(wěn)定性（熒光分子的開啟時間延長到68.5 ms）和收集光子數(shù)（單個分子的平均收集光子數(shù)達(dá)到43 200），這些優(yōu)點顯著了提高染料的超分辨熒光顯微成像性能。而FUENTES P R 課題組則開發(fā)了一種結(jié)合光活化和流動性特點，且獨立于分子介質(zhì)特性來控制開環(huán)熒光分子數(shù)量的方法（19，圖4）［48］。19 在光活化后，會存在一個閉環(huán)形式的反式結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與開環(huán)的熒光分子間存在著熱平衡關(guān)系，因此發(fā)光的熒光分子比例有可調(diào)控性。85 mW·cm-2的光源光活化100 s 后，體系中的開環(huán)順式結(jié)構(gòu)占比為0.64%，而熒光分子占比為0.25%。通過將染料分子嵌入PVA 薄膜，測試得到分子開關(guān)次數(shù)達(dá)到221 次，每次分子開關(guān)可以收集到640 個光子。此外，即使光活化后的分子被光漂白，閉環(huán)形式的反式結(jié)構(gòu)將向開環(huán)形式轉(zhuǎn)化，從而保持開環(huán)熒光分子的數(shù)量。該策略能夠以極小的光毒性進(jìn)行長時間的熒光信號采集，利用19 追蹤細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，同時實現(xiàn)對神經(jīng)元中突觸小泡運輸過程的三維延時成像。

肖義課題組通過亞硝基籠化策略構(gòu)建新型羅丹明，能通過可見光激活（532 nm）熒光團(tuán)［49］，促進(jìn)N-NO鍵的斷裂實現(xiàn)高亮度熒光發(fā)射，該染料的光活化量子產(chǎn)率為16%（離去一個一氧化氮）和2.7%（離去第二個一氧化氮）。結(jié)合生物正交偶聯(lián)定位技術(shù)，20（圖4）可以實現(xiàn)活細(xì)胞中線粒體和微管的超分辨熒光成像。與傳統(tǒng)的鄰硝基芐基策略相比，研究者將籠化單元簡化為一氧化氮，降低了籠化單元對羅丹明母體結(jié)構(gòu)光學(xué)性能的干擾。同時，通過可見光對籠化基團(tuán)進(jìn)行光活化，減少了光源對細(xì)胞的光毒性。

3.2 光閃爍超分辨染料

不同于2006年莊小威課題組對Cy3 和Cy5 在DNA 上進(jìn)行修飾構(gòu)成分子對的方法，MOERNER W E 等在2008年通過共價修飾連接Cy3 和Cy5，消除了Cy3 和Cy5 分子間距離的不確定性影響，實現(xiàn)了對新月形桿菌管狀莖結(jié)構(gòu)的超分辨熒光成像［37］。2013年，莊小威課題組報道了通過優(yōu)化緩沖溶液體系促進(jìn)花菁染料應(yīng)用于超分辨成像［50］，然而這些方法聚焦于改善緩沖溶液體系來促使染料從三線態(tài)回到基態(tài)，而非對染料結(jié)構(gòu)的調(diào)控，本綜述不作贅述。

羅丹明染料的開閉環(huán)結(jié)構(gòu)可以實現(xiàn)熒光的開啟或關(guān)閉。2013年JOHNSSON K 課題組設(shè)計了具有優(yōu)異過膜能力和光譜特性的硅基羅丹明染料（21，圖5）。當(dāng)使用1 kW·cm-2的激發(fā)光時，每幀圖片可以收集到630 個光子，因此適用于STORM 成像［51］。通過結(jié)合不同的蛋白標(biāo)簽“HaloTag，SNAPTag 和CLIPTag”，實現(xiàn)了對不同蛋白的標(biāo)記和活細(xì)胞中的超分辨熒光成像。但是，此染料無法實現(xiàn)dSTORM，應(yīng)用存在一定的限制。

圖5 適用于STORM 的有機小分子染料Fig.5 Small molecular organic dyes for STORM

LAVIS L D 課題組將N，N-二甲基結(jié)構(gòu)替換為四元的氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，通過抑制扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)極大的提升了硅基羅丹明的量子產(chǎn)率和亮度，同時不影響硅基羅丹明開閉環(huán)結(jié)構(gòu)比例。在14 kW·cm-2，637 nm 的激發(fā)光激發(fā)下，10 000 幀照片可以定位到283 501 個分子。研究者將該染料與HaloTag 蛋白標(biāo)簽結(jié)合，開發(fā)出了染料22（圖5），實現(xiàn)了對活細(xì)胞的STORM 成像［21］。同樣為了獲得更高的熒光亮度，肖義課題組利用季銨基團(tuán)的吸電子效應(yīng)，抑制染料在激發(fā)態(tài)時電荷誘導(dǎo)效應(yīng)，降低分子扭曲導(dǎo)致的非輻射能量損耗，從而增強熒光發(fā)射［22］。這一策略提升了羅丹明染料的量子產(chǎn)率，并提升了熒光開啟時的壽命，進(jìn)而促進(jìn)單分子成像時可收集的總光子數(shù)增加。在PBS 緩沖溶液中單分子收集到的總光子數(shù)提升近四倍，達(dá)到40 600 個，有助于提高單分子成像的精度。研究者利用染料23 及其衍生物（圖5），用2 kW·cm-2，532 nm 的激光激發(fā)染料實現(xiàn)了對細(xì)胞膜和活細(xì)胞中溶酶體的超分辨熒光成像。這兩種策略雖然對染料的亮度進(jìn)行了提升，然而由于沒有對羅丹明染料的開閉環(huán)性能進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)控，無法實現(xiàn)dSTORM，同時，所需的激發(fā)光功率較高，特別是染料22，達(dá)到了14 kW·cm-2，不利于對活細(xì)胞的成像。

正因如此，研究者希望通過調(diào)控處于亮態(tài)（開環(huán)狀態(tài)）羅丹明的比例，獲得適用于dSTORM 成像的染料。基于對羅丹明開閉環(huán)比例的調(diào)控，URANO Y 等設(shè)計了一種新型羅丹明染料（24，圖5）［52］，區(qū)別于傳統(tǒng)羅丹明的螺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，在此分子中，通過引入分子內(nèi)的親核反應(yīng)基團(tuán)，調(diào)節(jié)親核基團(tuán)（羥基）的親核性和親電基團(tuán)（羅丹明母體結(jié)構(gòu)）的親電性來調(diào)控分子的分子內(nèi)螺環(huán)化平衡常數(shù)（pKcycl）。該染料的pKcycl為5.8，開環(huán)形式的壽命約為100 ms，因此在pH 7.4 的生理條件下，該染料的開環(huán)比例極低，可以直接應(yīng)用于活細(xì)胞超分辨熒光成像。

雖然硅基羅丹明在生理環(huán)境下以閉環(huán)形式為主，但存在不穩(wěn)定性，易受到環(huán)境因素干擾，為了穩(wěn)定硅基羅丹明的開環(huán)比例，IWANAGA S 等提出通過對Si 原子上的取代基進(jìn)行修飾，引入硅烷結(jié)構(gòu)，將有利于提高呫噸環(huán)上的電子密度，促進(jìn)羅丹明染料的環(huán)化反應(yīng)，進(jìn)而降低羅丹明染料兩性離子的占比。研究者設(shè)計了一系列分子驗證了這一假設(shè)，并篩選出具有合適開關(guān)比例的染料25-1（4%）和25-2（3%）［53］。在0.18 kW·cm-2的激發(fā)光激發(fā)下，25-1 單分子可收集到411 個光子，25-2 可收集到332 個光子。通過染料25（圖5），實現(xiàn)了對HeLa 細(xì)胞微管的超分辨熒光成像。

羅丹明的螺環(huán)化反應(yīng)平衡也可以通過對氧雜蒽上不同位點的修飾來進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而獲得具有適宜開關(guān)比的染料用于STORM 超分辨熒光成像。徐兆超和劉小剛發(fā)現(xiàn)羅丹明的開環(huán)比例與吉布斯自由能差值（ΔG）之間存在良好的線性關(guān)系，因此，可以通過ΔGc-o來指導(dǎo)羅丹明染料的設(shè)計［54］。基于ΔGc-o這一思路，研究者設(shè)計并合成了pKcycl為5.3 的染料26（圖5），其具有優(yōu)異的亮度和光穩(wěn)定性，在1.92 kW cm-2的激發(fā)光下可以單分子可以收集到800 個光子。通過對吉布斯自由能差值的計算，可以提前預(yù)測染料的pKcycl，以獲得適用于dSTORM 成像的染料。

羅丹明螺內(nèi)酰胺因其閉環(huán)反應(yīng)較慢，常作為光調(diào)控籠化基團(tuán)用于PALM 成像而非STORM 成像。徐兆超課題組提出通過引入氫鍵來穩(wěn)定螺內(nèi)酰胺（27，圖5）［55］，加速了其從熒光開環(huán)結(jié)構(gòu)到非熒光螺內(nèi)酰胺的閉環(huán)轉(zhuǎn)化，使其具有了優(yōu)異的光閃爍性能。通過在螺內(nèi)酰胺上進(jìn)一步取代6-苯基乙炔基萘酰亞胺，可以將活化光波長紅移至405 nm，同時活化光功率降低至1.8 W·cm-2，降低光毒性對細(xì)胞的影響。該染料克服了傳統(tǒng)羅丹明染料對酸性環(huán)境敏感易開環(huán)的特點，拓展了羅丹明染料在酸性環(huán)境下的超分辨成像，并成功應(yīng)用于枯草芽孢桿菌細(xì)胞表面微結(jié)構(gòu)的超分辨熒光成像。

XU K 課題組報道了一種實現(xiàn)高性能STORM 成像染料設(shè)計的新思路［56］。利用1，3-雙取代咪唑鎓替代羅丹明類染料中的苯環(huán)，得到的新型熒光染料分子（28，圖5）。1，3-雙取代咪唑鎓帶有正電荷，可促進(jìn)染料分子捕獲電子而破壞母體的共軛結(jié)構(gòu)，并在560 nm 光源的照射下進(jìn)而進(jìn)入暗態(tài)。與傳統(tǒng)羅丹明相比，該類染料更容易進(jìn)入暗態(tài)，并且可以在405 nm 的紫外照射下恢復(fù)到熒光態(tài)，在收集100 000 幀照片后仍具有優(yōu)異的光閃爍性能，平均單個分子在光漂白前可收集到4 500 個光子。

二芳基乙烯（DAE）具有良好的穩(wěn)定性和光致變色特性，但這類物質(zhì)在生物成像中受到溶解度差的應(yīng)用限制。HELL S W 課題組通過水溶性基團(tuán)修飾，改善了DAE 結(jié)構(gòu)的水溶性，獲得了一系列新型染料（圖5）［57］。其中，染料29 可通過375 nm 的光源光活化（轉(zhuǎn)化率0.15%）并在480 nm 的激發(fā)下向開環(huán)形式轉(zhuǎn)換（轉(zhuǎn)化率0.018%），同時，單分子每次激發(fā)可釋放2 500 個光子使得高密度的目標(biāo)物標(biāo)記成為可能。該染料不需要額外的緩沖溶液輔助就可以實現(xiàn)光閃爍，避免了對活體樣本的干擾。這類染料的開發(fā)拓展了超分辨熒光染料的種類，但為了改善水溶性而增加了染料的分子量，不利于進(jìn)一步對分子的功能化修飾。

KAMIYA M 和URANO Y 等開發(fā)了一種在活細(xì)胞中自發(fā)閃爍的新方法［58］：利用細(xì)胞內(nèi)高含量的谷胱甘肽（GSH）對氧雜蒽熒光團(tuán)的9 號位進(jìn)行親核進(jìn)攻，得到了可用于STORM 成像的硅取代和碳取代兩類熒光染料。研究者通過染料對GSH 的解離常數(shù)（Kd，GSH）來衡量該類染料的熒光開啟率。其中30-1 的Kd，GSH為1 μM，30-2 的Kd，GSH為3.1 μM，兩個染料均表現(xiàn)出在熒光和無熒光狀態(tài)下GSH 加合物之間的平衡性以及優(yōu)異的自發(fā)閃爍能力，可結(jié)合STORM 成像活細(xì)胞中的微管或線粒體。此外，通過使用自發(fā)閃爍的近紅外染料30-1（SiP650，圖5）和綠色熒光團(tuán)30-2（CP550，圖5），在不需要介質(zhì)的條件下，實現(xiàn)了雙色活細(xì)胞單分子成像。這種方式避免了光活化對細(xì)胞的副作用。

4 適用于SIM 的有機小分子熒光染料

基于結(jié)構(gòu)光成像的原理，線性SIM 技術(shù)對熒光染料沒有特殊要求，并且根據(jù)奈科斯特定律，其需要收集的光子數(shù)也僅為共聚焦成像的4～8 倍，遠(yuǎn)低于STED 成像和SMLM 成像，因此絕大多數(shù)熒光染料都適用于線性SIM 成像。對于非線性SIM 技術(shù)，雖然對分子的飽和吸收有要求，但目前應(yīng)用尚未普及，在本文中不再贅述。據(jù)此，本綜述就不再對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類評述，僅通過兩個典型案列解析設(shè)計理念。與此同時，線性SIM 也是最具潛力的用于長時間監(jiān)測細(xì)胞生理活動的熒光成像技術(shù)。然而，即便在線性SIM 成像中使用了較低功率的激發(fā)光和更短的采樣時間，光毒性依然會對細(xì)胞產(chǎn)生影響，特別是在觀察一些對光毒性敏感的亞細(xì)胞器，如線粒體等。在長時間照射時，線粒體的形態(tài)會發(fā)生變化，功能也可能會收到影響，這會對監(jiān)測與這些亞細(xì)胞器相關(guān)的生理和病理過程產(chǎn)生干擾，無法做到精準(zhǔn)檢測［59］。因此，研究者開發(fā)了自修復(fù)染料用于降低光毒性的影響［60，61］。2014年BLANCHARD S C 課題組報道了利用三線態(tài)淬滅劑中和光照產(chǎn)生的ROS 的策略設(shè)計新型染料（31，圖6）。這一策略可以極大的降低染料的光毒性并提高染料的穩(wěn)定性［62］。2020年，陳知行教授課題組基于這一策略，報道了新型線粒體示蹤劑32［63］，這一示蹤劑相較于傳統(tǒng)的MitoTracker 系列染料，具有更高的光穩(wěn)定性，同時，通過結(jié)構(gòu)光成像，研究者驗證了這類新型染料不會對線粒體構(gòu)成明顯的光損傷，可實現(xiàn)無損監(jiān)測線粒體動態(tài)變化過程。

圖6 染料光毒性示意圖和自修復(fù)染料分子Fig.6 Schematic diagram of dye phototoxicity and self-healing dye molecules

5 總結(jié)與展望

綜上，熒光染料的發(fā)展促進(jìn)了成像技術(shù)的進(jìn)步，而成像技術(shù)也進(jìn)一步指導(dǎo)了染料結(jié)構(gòu)的優(yōu)化與完善。超分辨熒光顯微成像技術(shù)采用創(chuàng)造性的策略突破衍射極限，使研究者可以對亞細(xì)胞器、生物大分子以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間相互作用進(jìn)行研究，成為了研究生理學(xué)和病理學(xué)的有力工具。熒光顯微鏡的使用離不開熒光染料，相較于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡，超分辨熒光顯微鏡所采用的光源功率更高，需要收集信號的時間更長，對光譜的要求更為嚴(yán)苛，因而對染料的設(shè)計提出了更高的要求。其中，有機小分子熒光染料具有易于修飾以調(diào)控光物理性質(zhì)，便于使用，操作簡便等優(yōu)點，受到了超分辨熒光顯微技術(shù)研究者的廣泛青睞。為了改善有機小分子染料的水溶性和過膜率，研究者在染料上修飾水溶性基團(tuán)或改善熒光分子攜帶的電荷。除此之外，STED 技術(shù)使用高功率的激光作為損耗光，對染料的光穩(wěn)定性有嚴(yán)格要求，研究者通過對染料結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，改善其光穩(wěn)定性，降低染料的光漂白，從而獲得穩(wěn)定的熒光信號；通過抑制分子的扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)，優(yōu)化電子排布來提高熒光量子產(chǎn)率進(jìn)而收集更多的熒光信號；通過調(diào)控染料激發(fā)發(fā)射光譜紅移，采用近紅外的損耗光激發(fā)，降低對細(xì)胞的光損傷；同時，通過增大斯托克斯位移，避免損耗光的二次激發(fā)，以獲得更高分辨率的成像。染料分子的光活化或閃爍能力在SMLM 中至關(guān)重要。研究者設(shè)計不同的籠化基團(tuán)和光敏基團(tuán)調(diào)控PALM 染料分子的穩(wěn)定性，優(yōu)化籠化基團(tuán)，設(shè)計分子量小、熒光屏蔽效果好的籠化基團(tuán)，改善染料分子的亮態(tài)與暗態(tài)對比度和光活化量子產(chǎn)率，獲得高質(zhì)量的PALM 成像。對羅丹明分子結(jié)構(gòu)的調(diào)控，優(yōu)化其開閉環(huán)的比率，從而獲得適合的開環(huán)熒光團(tuán)的占比，同時通過染料分子穩(wěn)定性和亮度的提升，降低激發(fā)波長功率，從而降低對活細(xì)胞的光損傷，以獲得高質(zhì)量的活細(xì)胞STORM 成像。雖然線性SIM 成像對染料的光物理性質(zhì)并沒有特殊的要求，但研究者也通過進(jìn)一步減少分子受激發(fā)產(chǎn)生的超氧自由基對生物樣本損傷等策略，降低成像過程中染料的光毒性，以提高成像效果。

這些策略的共同目的都是力求精準(zhǔn)，減小染料分子對目標(biāo)物的影響，客觀地對目標(biāo)物進(jìn)行觀測。目前，不同波段的高穩(wěn)定性熒光染料不斷涌現(xiàn)，豐富了超分辨熒光染料庫，促進(jìn)了多色超分辨熒光顯微成像的發(fā)展。然而要實現(xiàn)長時間無損監(jiān)測亞細(xì)胞器之間、生物大分子與亞細(xì)胞器、生物大分子之間的相互作用，以及復(fù)合時間尺度的“四維超分辨成像”，仍需進(jìn)一步優(yōu)化有機小分子熒光染料的結(jié)構(gòu)和性能。如何在盡量不增加染料分子體積/分子量的前提下，實現(xiàn)染料分子的高透膜性、優(yōu)異的精準(zhǔn)定位能力、高光穩(wěn)定性及低光毒性，是研究人員的不懈追求［64］。而隨著光物理性質(zhì)優(yōu)異的熒光團(tuán)的不斷開發(fā)，有機小分子熒光團(tuán)/探針，也將在精準(zhǔn)檢測領(lǐng)域發(fā)揮越來越大的作用，成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究中的重要工具之一。