李東宇，俞婷婷，朱京譚，朱?

（1 華中科技大學(xué)武漢光電國(guó)家研究中心，Britton Chance 生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)研究中心&生物醫(yī)學(xué)光子學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074）

（2 華中科技大學(xué) 高端生物醫(yī)學(xué)成像設(shè)施，武漢430074）

（3 湖北光谷實(shí)驗(yàn)室，武漢430074）

0 引言

在體觀測(cè)大腦的結(jié)構(gòu)和活動(dòng)，對(duì)了解大腦以及腦疾病相關(guān)的神經(jīng)血管功能障礙具有重要意義［1-3］?，F(xiàn)代光學(xué)成像技術(shù)侵入性低、分辨率高，因而能夠用于活體觀測(cè)生物結(jié)構(gòu)和功能［4-10］，在腦科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用［11-13］。例如，激光散斑對(duì)比成像可以實(shí)現(xiàn)對(duì)皮層血流變化的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)［14-15］，高光譜成像［16-17］可以用于監(jiān)測(cè)血管中的血氧飽和度［18-19］，光學(xué)相干斷層掃描可以在微米級(jí)別的分辨率下對(duì)組織進(jìn)行三維成像［20-21］。非線性光學(xué)顯微鏡（雙光子熒光成像、三光子熒光成像、二倍頻成像、三倍頻成像等）可以觀測(cè)大腦皮層的深層神經(jīng)細(xì)胞和血管結(jié)構(gòu)功能［22-26］，并被用于相關(guān)疾病的研究［27-28］。

但是，在活體狀態(tài)下，大腦上面有顱骨覆蓋，而顱骨對(duì)光的強(qiáng)散射嚴(yán)重限制了光的穿透深度，進(jìn)而影響了皮層成像的質(zhì)量和深度［29-30］。為了克服顱骨的散射，以往的研究往往需要在成像前建立各類手術(shù)顱窗，主要包括開顱玻璃窗、磨薄顱骨窗以及它們的變體［31-32］。開顱玻璃窗可以保持一個(gè)月以上，因此適用于長(zhǎng)期重復(fù)成像［33］。但是，開顱手術(shù)容易導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，且往往會(huì)持續(xù)約2 周［32，34］，因此開顱玻璃窗不適合對(duì)急性模型的觀測(cè)。磨薄顱骨窗的建立通過將部分顱骨磨薄至約25 μm 左右，在這種情況下，顱骨不會(huì)過多地限制光的穿透，因而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)皮層的活體高分辨觀測(cè)。但磨薄顱骨窗不適用于大視場(chǎng)觀測(cè)皮層，因?yàn)閷⒋竺娣e的顱骨均勻地磨薄至25 μm 的難度非常大［35-37］。另外，顱骨被磨薄后會(huì)重新生長(zhǎng)，并且新生的顱骨質(zhì)地會(huì)發(fā)生變化、且易碎，成像質(zhì)量會(huì)隨著反復(fù)磨薄越來越差、且難以實(shí)現(xiàn)多次的重復(fù)打磨［32］。所以，磨薄顱骨窗不適用于長(zhǎng)期跟蹤觀測(cè)。

近年興起的組織光透明技術(shù)可以降低生物組織的散射，增強(qiáng)光在組織中的穿透能力，已被廣泛應(yīng)用于離體大組織甚至全器官三維高分辨成像［38-44］。不僅如此，組織光透明技術(shù)在活體水平也得到了很好的應(yīng)用。研究人員發(fā)展的活體顱骨光透明技術(shù)，以及基于此建立的光透明顱窗，可以在不進(jìn)行開顱手術(shù)的情況下，結(jié)合多種現(xiàn)代光學(xué)成像手段，實(shí)現(xiàn)大腦皮層的神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)和功能的觀測(cè)。研究人員針對(duì)不同的應(yīng)用場(chǎng)景，開發(fā)了不同的光透明顱窗，可以分別滿足高分辨、大視場(chǎng)、長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)等要求。相比于開顱玻璃窗，光透明顱窗可以避免手術(shù)帶來的炎癥反應(yīng)，從而適用于急性觀測(cè)；相比于磨薄顱骨窗，光透明顱窗可以通過反復(fù)建立而觀測(cè)數(shù)月，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期跟蹤監(jiān)測(cè)。本文將從活體顱骨光透明技術(shù)與應(yīng)用的角度進(jìn)行介紹。

1 活體顱骨光透明技術(shù)

活體組織光透明技術(shù)最早用于皮膚的透明化成像，能夠提高小鼠、大鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚對(duì)光的穿透能力［45］，甚至可以提升對(duì)人體皮膚的成像深度［46-47］。經(jīng)典的活體皮膚光透明試劑包括甘油、丙二醇、聚乙二醇-400 等［47］，它們的作用是使組織脫水并解離膠原蛋白，配合物理或者化學(xué)促滲方法，可以大大提升皮膚的透明度。但是，顱骨（硬組織）和皮膚（軟組織）的結(jié)構(gòu)完全不同，它在失水的狀態(tài)下反而會(huì)更加渾濁，因而顱骨透明化的思路必須與皮膚不同。科研人員經(jīng)過不斷探索，終于在2012年用多種試劑的混合溶液首次實(shí)現(xiàn)了活體小鼠的顱骨透明化并用于光學(xué)成像［48］。而后，研究人員進(jìn)一步從中篩選有效試劑并優(yōu)化配比，以及加入新的試劑，不斷完善方法，開發(fā)了一系列光透明顱窗。

顱骨的主要成分包括羥基磷灰石（鈣質(zhì)）、膠原蛋白（16%）、脂質(zhì)（54%）和水（14%）［49］。因此，活體顱骨光透明的基本原理就是（部分）去除顱骨中的鈣質(zhì)、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，并用折射率匹配液進(jìn)一步提高透明效果（如圖1）。

圖1 活體顱骨光透明的基本原理［50-51］Fig.1 Basic principle of in vivo skull optical clearing［50-51］

1.1 SOCS：實(shí)現(xiàn)活體顱骨光透明

為了去除顱骨中的散射子，WANG Jing 等［48］發(fā)明了一種顱骨光透明液（Skull Optical Clearing Solution，SOCS），它是一種包含乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA），二甲亞砜、山梨醇、月桂醇、乙醇、葡萄糖的弱堿性溶液。在實(shí)驗(yàn)過程中，首先將小鼠的頭皮剪開，暴露顱骨，然后將顱骨用SOCS孵育25 min即可讓混濁的顱骨變得透明，皮層微血管也逐漸從不可見變得清晰，能夠分辨的最小血管直徑為（14.4±0.8）μm，而在開顱狀態(tài)下可分辨的最小血管直徑為（12.8±0.9）μm，證明顱骨透明化的成像效果接近于開顱狀態(tài)。

SOCS 可以提高激光散斑成像的質(zhì)量，實(shí)現(xiàn)皮層血流分布可視化［48］，YANG Xiaoquan 等［52］在體研究了SOCS 處理前后皮層血管光聲成像的差異，發(fā)現(xiàn)透明后相同血管的光聲信號(hào)顯著增強(qiáng)，原本無法觀測(cè)的深皮層血管也可以清楚地觀察到。定量分析結(jié)果表明，顱骨光透明處理后，光聲信號(hào)增加到原始的2.59 倍，且不會(huì)改變皮層血管的直徑。SOCS 首次為皮層血管成像提供了一個(gè)無需手術(shù)的顱窗，證明了活體顱骨光透明的可行性。但其安全性、有效性及可重復(fù)性有待進(jìn)一步評(píng)估。

1.2 SOCW：實(shí)現(xiàn)穿顱神經(jīng)樹突棘成像

2018年，ZHAO Yanjie 等［53］提出了一種優(yōu)化的顱骨光透明窗（Skull Optical Clearing Window，SOCW），結(jié)合雙光子熒光顯微鏡可以獲得達(dá)到突觸級(jí)別的成像分辨率。顱骨中的無機(jī)基質(zhì)和有機(jī)基質(zhì)的主要成分分別是羥基磷灰石鈣和膠原蛋白，隨著小鼠年齡的增長(zhǎng)，無機(jī)基質(zhì)和有機(jī)基質(zhì)的比例也會(huì)發(fā)生變化。因此，對(duì)于幼年小鼠（出生20 天之內(nèi)）和非幼年小鼠（出生大于20 天），采用不同的光透明流程。

SOCW 的建立步驟分為兩步：對(duì)于出生15～20 天的小鼠，用10%的膠原酶溶液孵育5～10 min；對(duì)于出生21～30 天的小鼠，將膠原酶溶液置換為10%的EDTA 二鈉溶液，同樣孵育5～10 min；對(duì)于出生超過30 天的小鼠，顱骨生長(zhǎng)得更厚，因此需要先將顱骨磨薄至約100 μm，然后用10%的EDTA 二鈉溶液孵育5～10 min。進(jìn)一步，將80%的甘油滴加在顱骨上，進(jìn)行折射率匹配，即完成了光透明顱窗的建立。SOCW 建立的顱窗可以通過用磷酸緩沖液擦洗顱骨來“關(guān)閉”，即使得顱骨恢復(fù)到渾濁狀態(tài)。但是，如果需要在第二天進(jìn)行重復(fù)開窗觀測(cè)，光透明處理的時(shí)間需要比前一天略長(zhǎng)一些。

利用雙光子熒光顯微鏡，可以透過SOCW 實(shí)現(xiàn)對(duì)皮層20～80 μm 深處的神經(jīng)元樹突棘的觀測(cè)，說明其分辨率可以達(dá)到亞微米尺度，這是活體顱骨光透明技術(shù)的一個(gè)突破；與此同時(shí)，該方法在安全性方面得到了有效驗(yàn)證。但是，該方法用于4 周齡以上的小鼠時(shí)需要對(duì)顱骨進(jìn)行打磨，不僅增加了實(shí)驗(yàn)難度，還會(huì)遇到與磨薄顱骨窗同樣的問題，即難以實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)的觀測(cè)以及長(zhǎng)期重復(fù)觀測(cè)。

1.3 USOCA：可開合的大視場(chǎng)顱窗

2018年，ZHANG Chao 等［54］發(fā)展了一種基于尿素的光透明方法（Urea-based Skull Optical Clearing Agent，USOCA），成功解決SOCW 未能解決的兩大難題，即視場(chǎng)較小和無法實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期跟蹤。

USOCA 包含兩種混和試劑，其一是75%乙醇溶解的飽和尿素溶液，乙醇溶液與尿素的體積-質(zhì)量比約為10∶3 mL/g。其二是高濃度的十二烷基苯磺酸鈉（Sodium Dodecyl Benzene Sulfonate，SDBS）溶液，它是由0.7 mol/L 的氫氧化鈉溶液與十二烷基苯磺酸配置而成的，前者與后者的體積-質(zhì)量比約為24∶5 mL/g，且pH 值保持在7.2～8 的范圍內(nèi)。乙醇分子上的羥基可以促使膠原解離，尿素不僅因其有水合作用而被廣泛用于組織透明化，還可以起到促滲的作用；十二烷基苯磺酸鈉是一種離子型去垢劑，有去脂作用，可以使得顱骨成分更加均一。

剪開小鼠頭皮、暴露顱骨后，用第一種試劑滴加在顱骨，其間用鑷子夾住小棉球不斷在顱骨上按摩，進(jìn)行物理促滲，顱骨會(huì)慢慢變透明。10 min 后，擦除第一種試劑，將第二種試劑滴加在顱骨上，并孵育5 min，在這段時(shí)間內(nèi)，顱骨會(huì)很快變得更為透明。由于完全不需要對(duì)顱骨進(jìn)行磨薄處理，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整光透明顱窗的尺寸，實(shí)驗(yàn)人員利用USOCA 對(duì)缺血性腦卒中及再灌注過程進(jìn)行了雙側(cè)大腦皮層的血流成像。待成像完成后，用磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffer Solution，PBS）將光透明試劑清洗干凈，顱骨即可恢復(fù)至原有狀態(tài)，即“關(guān)閉”光透明顱窗。若需要進(jìn)行重復(fù)成像，只需再進(jìn)行透明操作即可再次“打開”光透明顱窗。

值得一提的是，USOCA 可以適用于2～8月齡的小鼠，這一特性與大視場(chǎng)和可長(zhǎng)期重復(fù)“開合”的特性，極大地拓展了活體顱骨光透明技術(shù)的應(yīng)用范圍。但是，USOCA 結(jié)合雙光子熒光顯微術(shù)，也僅能獲得皮層300 μm 的成像深度，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)不到小鼠皮層的厚度（＞1 mm）。因此光透明顱窗的透明度還有待進(jìn)一步提升，來滿足深皮層成像的需求。

1.4 SOCW 結(jié)合USOCA：進(jìn)一步提高透明度

為了進(jìn)一步提高光透明顱窗的透明度，CHEN Yage 等［55］將SOCW 和USOCA 兩種顱骨光透明方法進(jìn)行結(jié)合，并從理論和實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面驗(yàn)證了這種結(jié)合的可行性。在研究中，他們利用非標(biāo)記的高光譜受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering，SRS）顯微術(shù)對(duì)兩種顱骨光透明方法的分子機(jī)制進(jìn)行了闡釋。SRS 可以將光透明劑對(duì)顱骨不同成分的影響進(jìn)行可視化。

SOCW 的主要成分是膠原酶和EDTA。研究發(fā)現(xiàn)，10%的膠原酶孵育5～10 min 后，顱骨表面的膠原纖維能得到有效解聚。然而，膠原酶不能降解羥基磷灰石和羥基磷灰石內(nèi)部的膠原。相反，EDTA 孵育5～10 min后，骨陷窩周圍形成大量空腔，顱骨內(nèi)羥基磷灰石的厚度明顯降低。這意味著EDTA 不僅能分解羥基磷灰石，還能使蛋白質(zhì)均質(zhì)化。USOCA 的主要有效成分是尿素的75%乙醇溶液（S1）和十二烷基苯磺酸鈉溶液（S2）。研究表明，USOCA 孵育15 min 后，顱骨表面和深層區(qū)域的蛋白均被解聚并重新均勻分布。結(jié)果還表明，與膠原酶相比，USOCA 具有更強(qiáng)的溶解蛋白質(zhì)的能力。

由于SOCW 和USOCA 的透明機(jī)理有所不同，CHEN Yage 等結(jié)合兩種方法，并開展了活體實(shí)驗(yàn)?？蒲腥藛T依次用USOCA（25 min）、10%的EDTA（25 min）對(duì)顱骨進(jìn)行孵育，去除后滴加80%的甘油并進(jìn)行成像，可以得到非常顯著的透明效果。結(jié)合三光子熒光顯微鏡，可以對(duì)皮層850 μm 深的血管進(jìn)行成像觀測(cè)。

將SOCW 和USOCA 進(jìn)行結(jié)合，進(jìn)一步拓展了光透明顱窗下的成像深度。但是，結(jié)合兩種方法，使得光透明顱窗的建立時(shí)間接近一個(gè)小時(shí)，降低了便捷性。另一方面，同時(shí)去除了顱骨中的膠原蛋白和羥基磷灰石，可能使得顱骨的剛性結(jié)構(gòu)、以及它對(duì)大腦的保護(hù)作用受到影響，不利于長(zhǎng)期跟蹤觀測(cè)。

1.5 VNSOCA：可見-近紅外兼容的光透明顱窗

顱骨光透明技術(shù)主要著眼于減低顱骨的散射，這對(duì)于利用可見光和近紅外Ⅰ區(qū)（700～900 nm）波段的成像非常重要。但是，在近紅外Ⅱ區(qū)（900/1 000～1 700 nm），生物組織的散射減少［56-60］，吸收就是另一個(gè)需要考慮的重要因素。

LI Dongyu 等［51］測(cè)量了USOCA 方法所用的兩種混和試劑的透過率，發(fā)現(xiàn)在近紅外Ⅱ區(qū)、尤其在1 300 nm以上的波段有著非常大的吸收，這對(duì)于近紅外Ⅱ區(qū)成像顯然非常不利。研究發(fā)現(xiàn)，該吸收主要是光透明試劑中的重要成分——水（H2O）帶來的。為了克服這一問題，研究人員將水替換成在可見光到近紅外Ⅱ區(qū)均有較高透過率的重水（D2O），并將以此配置的顱骨光透明試劑命名為適用于可見-近紅外Ⅱ區(qū)的顱骨光透明試劑（Visible-Near infrared Ⅱ-compatible Skull Optical Clearing Agent，VNSOCA）。

研究人員首先用體外成像實(shí)驗(yàn)比較了USOCA 和VNSOCA 對(duì)近紅外二區(qū)激發(fā)的非線性光學(xué)成像的適用性。研究人員將一種三倍頻探針的溶液放置在毛細(xì)玻璃管中，將其放置在1 560 nm 飛秒激光激發(fā)的三倍頻顯微鏡下，分別將USOCA 和VNSOCA 作為成像介質(zhì)進(jìn)行成像。結(jié)果表明，由于USOCA 對(duì)激發(fā)光有較大的吸收，限制了整套成像方案的效率，因而探測(cè)到的三倍頻信號(hào)非常有限。相對(duì)的，VNSOCA 作為成像介質(zhì)時(shí)，測(cè)得的信號(hào)強(qiáng)度提升了3 倍以上。進(jìn)而，研究人員進(jìn)行了活體實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，即使基于利用近紅外二區(qū)（1 560 nm）激發(fā)的三倍頻成像技術(shù)，也只能在渾濁顱骨下獲取皮層200 μm 深的毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)，而VNSOCA 建立的光透明顱窗，可以將穿顱血管成像深度提升3 倍以上。VNSCOA 的發(fā)明，為顱骨光透明顱技術(shù)在近紅外Ⅱ區(qū)成像領(lǐng)域的應(yīng)用提供了方法，拓展了光透明顱窗適用的波段范圍。幾種顱骨光透明技術(shù)的比較見表1。

表1 幾種顱骨光透明技術(shù)的比較Table 1 Comparisons of skull optical clearing techniques

續(xù)表

2 活體顱骨光透明用于神經(jīng)/血管成像

活體顱骨光透明技術(shù)與多種光學(xué)成像方法技術(shù)的結(jié)合，已被證明可廣泛用于小鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞）和血管的觀測(cè)。比如，利用激光散斑襯比成像技術(shù)和高光譜成像技術(shù)，可以對(duì)皮層表面血管的血流和血氧分布進(jìn)行無標(biāo)記成像；利用雙光子熒光成像、三倍頻成像等非線性光學(xué)成像技術(shù)，可以對(duì)皮層深層神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)實(shí)施三維觀測(cè)。

2.1 突觸可塑性觀測(cè)

神經(jīng)元樹突棘的生長(zhǎng)和消融與記憶和認(rèn)知功能有著緊密的聯(lián)系，其異常往往與許多腦神經(jīng)疾病相關(guān)［66-67］，因而觀測(cè)其變化具有重要的生物學(xué)意義［68-70］。但是，樹突棘的尺寸在亞微米級(jí)，這就對(duì)成像方法提出了很高的要求。一般來說，在體觀測(cè)神經(jīng)元樹突棘需要使用雙光子熒光顯微鏡，同時(shí)配合開顱玻璃窗或磨薄顱骨窗。光透明顱窗技術(shù)為該應(yīng)用提供了一種新型的低侵入式的觀測(cè)思路。

ZHAO Yanjie 等［53］率先驗(yàn)證了光透明顱窗用于觀測(cè)神經(jīng)元突觸可塑性的可行性。利用SOCW，研究人員對(duì)神經(jīng)元自發(fā)表達(dá)黃色熒光蛋白（Yellow Fluorescent Protein，YFP）的小鼠進(jìn)行了活體成像。結(jié)果表明，SOCW 的建立使得圖像質(zhì)量得到顯著改善，足以對(duì)樹突棘進(jìn)行清晰地成像。進(jìn)一步地，對(duì)幼鼠（P19）的神經(jīng)元樹突棘進(jìn)行了為期1 小時(shí)的持續(xù)觀測(cè)，觀察到樹突棘的出現(xiàn)和消失、以及形狀的變化。并且，相較于樹突棘，神經(jīng)元的絲狀偽足具有更高的運(yùn)動(dòng)性，它甚至可以轉(zhuǎn)化為樹突棘，說明絲狀偽足在發(fā)育過程中可能是樹突棘的前體。這些結(jié)果表明，小鼠神經(jīng)元突觸的可塑性在第三周是非常強(qiáng)的（如圖2）。

圖2 透過SOCW 對(duì)出生19 天的未成年小鼠的突觸可塑性的動(dòng)態(tài)觀測(cè)［53］Fig.2 Dynamical monitoring of the plasticity of dendritic protrusions in infantile mice（P19）through the SOCW［53］

2.2 皮層血流血氧跟蹤監(jiān)測(cè)

血流和血氧變化是反應(yīng)血管功能的重要指標(biāo)，監(jiān)測(cè)皮層血流、血氧信息對(duì)于研究多種腦疾病有著重要的意義［71-73］。激光散斑襯比成像是一種非標(biāo)記的、高時(shí)空分辨的血流分布成像技術(shù)［74-76］；高光譜成像技術(shù)是一種非標(biāo)記的血氧分布成像技術(shù)［76-78］。顱骨光透明技術(shù)的出現(xiàn)使其得以在完整顱骨下獲取皮層血流血氧信息。

ZHANG Chao 等［54］發(fā)展的USOCA 技術(shù)極大地拓展了光透明顱窗在皮層跟蹤監(jiān)測(cè)方面的應(yīng)用。利用搭建的激光散斑襯比成像/高光譜成像雙模態(tài)系統(tǒng)，結(jié)合USOCA，科研人員對(duì)大腦中動(dòng)脈阻塞（Middle Cerebral Artery Occlusion，MCAO）后的雙側(cè)皮層血流血氧分布進(jìn)行了30 min 的持續(xù)觀測(cè)。結(jié)果表明，隨著時(shí)間的推移，手術(shù)側(cè)血流和血氧值都急劇下降。MCAO 術(shù)后10 min，手術(shù)側(cè)動(dòng)脈血流的下降值約為初始值的60%，并在術(shù)后30 min 完全停止流動(dòng)。，術(shù)側(cè)靜脈血流在術(shù)后10 min 時(shí)下降約40%，30 min 時(shí)，下降約60%。血氧飽和度的變化與血流的變化規(guī)律基本一致。在MCAO 對(duì)側(cè)，血流顯著增加，動(dòng)脈血流增加到初始值的近3 倍，靜脈增加約50%。然而，研究人員發(fā)現(xiàn)手術(shù)對(duì)側(cè)的動(dòng)靜脈血氧飽和度只是略有增加。

不僅如此，利用USOCA，可以持續(xù)一周地每天對(duì)小鼠進(jìn)行顱骨透明化操作并獲取血流血氧信息。不僅如此，研究人員對(duì)2月齡的小鼠進(jìn)行了每月一次、為期5 個(gè)月的持續(xù)成像，并成功觀察到皮層血管網(wǎng)的動(dòng)態(tài)變化，即部分血管的消失和新生（圖3）。

圖3 基于USOCA 的重復(fù)光透明成像用于皮層血流和血氧監(jiān)測(cè)［54］Fig.3 Repeatability of USOCA-based optical clearing imaging of cortical blood flow and blood oxygen［54］

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，因此有監(jiān)測(cè)糖尿病不同發(fā)展階段體內(nèi)腦血管功能障礙的變化具有與重要意義。FENG Wei 等［61］透過基于USOCA 建立的顱骨光透明窗，對(duì)一型糖尿病發(fā)展過程中，小鼠皮層血流和血氧對(duì)擴(kuò)血管藥物硝普化鈉的響應(yīng)變化進(jìn)行了可視化研究。結(jié)果表明，對(duì)于健康小鼠，靜脈注射硝普化鈉后，皮層血流值會(huì)快速下降，然后快速上升并超過基線值，最終恢復(fù)至靜息狀態(tài)的數(shù)值；皮層血氧飽和度對(duì)硝普化鈉的響應(yīng)也與血流響應(yīng)類似。但是，隨著糖尿病病程的發(fā)展，皮層血流響應(yīng)會(huì)顯著下降，而血氧響應(yīng)則會(huì)顯著上升，這表示長(zhǎng)期的高血糖環(huán)境使得皮層血管功能發(fā)生異常。

2.3 深皮層血管可視化

在體皮層成像深度可以從側(cè)面反應(yīng)光透明顱窗的透明度，因此研究人員經(jīng)常會(huì)設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，探索發(fā)展的顱骨光透明方法對(duì)于深組織血管和神經(jīng)細(xì)胞的成像能力。ZHANG Chao 等［54］探究了USOCA 的深組織成像能力，發(fā)現(xiàn)顱骨光透明之前，雙光子熒光顯微鏡僅能獲取深度在120 μm 之內(nèi)的大血管（直徑67.5 μm）的結(jié)構(gòu)信息，而顱骨透明后則可以對(duì)300 μm 深的毛細(xì)血管（直徑4.5 μm）進(jìn)行觀測(cè)。

CHEN Yage 等［55］探究了SOCW 與USOCA 相結(jié)合獲取深皮層血管信息的能力，他們對(duì)顱骨依次進(jìn)行膠原解離、脫脂、脫鈣和和折射率匹配后，利用三光子熒光顯微鏡達(dá)到了850 μm 的成像深度。

LI Dongyu 等［51］探究了VNSOCA 用于近紅外二區(qū)激發(fā)的皮層深組織非線性成像的能力。利用1 560 nm激發(fā)的三倍頻信號(hào)，可以獲取650 μm 的深層毛細(xì)血管信息，該深度是不進(jìn)行顱骨光透明時(shí)的3 倍，接近與開顱狀態(tài)下的結(jié)果（800 μm）。圖4 展示了光透明顱窗用于三光子成像和三倍頻成像的結(jié)果。

圖4 光透明顱窗用于深皮層血管非線性成像［51，55］Fig.4 Skull optical clearing window for nonlinear optical imaging of deep cortical vasculature［51，55］

3 活體顱骨光透明用于皮層光操控

現(xiàn)代光學(xué)技術(shù)不僅可以獲得高分辨率的神經(jīng)血管圖像，而且可以對(duì)大腦皮層進(jìn)行操控或建立特定的模型?；陲B骨光透明技術(shù)的窗口，也可替代開顱窗和磨薄窗，用于皮層光操控。比如，結(jié)合光透明顱窗和光動(dòng)力效應(yīng)，既可以打開血腦屏障，也可以建立靶向缺血性腦卒中模型；此外，透過光透明顱窗，將飛秒激光聚焦在血管上，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)單根血管的燒蝕，從而建立局部靶向的出血性腦卒中模型。

3.1 光動(dòng)力效應(yīng)打開血腦屏障

血腦屏障在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用［79-80］。它能阻止血液中的有害物質(zhì)進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)，從而維持大腦的正常功能［81］，同樣也會(huì)屏蔽許多神經(jīng)藥物［82］而影響治療。為了特定的藥物遞送，需要暫時(shí)打開血腦屏障［83-90］，而利用光動(dòng)力效應(yīng)打開血腦屏障的方法得到了廣泛關(guān)注［91-92］。

光動(dòng)力效應(yīng)是指光敏劑在特定波長(zhǎng)的光的照射下會(huì)產(chǎn)生單線態(tài)氧、進(jìn)而產(chǎn)生毒理性的化學(xué)反應(yīng)的過程。顯然，利用光動(dòng)力效應(yīng)產(chǎn)生的單線態(tài)氧能夠影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，使得光照部位周圍的血腦屏障被打開［92］。靶向打開血腦屏障，要求光能夠在不被顱骨散射的情況下到達(dá)皮層的目標(biāo)區(qū)域。即使是非靶向地利用光動(dòng)力效應(yīng)打開血腦屏障，如果不對(duì)顱骨進(jìn)行開窗處理，就需要提高光功率，而這往往會(huì)造成嚴(yán)重的血管性水腫。

ZHANG Chao 等［62］利用光透明顱窗，在不開顱的情況下實(shí)現(xiàn)了光動(dòng)力效應(yīng)打開血腦屏障。離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，光透明顱窗建立后，靜脈注射光敏劑和熒光小分子伊文思藍(lán)（961 Da），激光照射皮層會(huì)引起血管伊文思藍(lán)的外滲，而同等劑量下不對(duì)顱骨進(jìn)行透明化處理并未在組織中觀察到伊文思藍(lán)。FENG Wei 等［63］同樣在光透明顱窗下利用光動(dòng)力效應(yīng)打開血腦屏障，并在活體水平跟蹤了伊文思藍(lán)的滲漏過程。除了小分子，他們還證明光透明顱窗結(jié)合光動(dòng)力效應(yīng)也可以向腦實(shí)質(zhì)中運(yùn)送右旋糖酐（Rhodamine-dextran-70 kDa，圖5）和脂質(zhì)體（粒徑100 nm）等大分子。

圖5 光透明顱窗結(jié)合光動(dòng)力效應(yīng)打開血腦屏障后利用雙光子顯微鏡觀察血管中Rhodamine-dextran 的滲漏情況［62］Fig.5 Skull optical clearing window combined with photodynamic effect for blood brain barrier opening and two-photon fluorescence observing of the leakage of Rhodamine-Dextran in blood vessels［62］

進(jìn)一步地，ZHANG Chao 等［93］研究了光動(dòng)力效應(yīng)不同年齡小鼠（2/4/6/8 周齡）血腦屏障功能影響的差異性。結(jié)果表明，年輕小鼠的血腦屏障更易受光動(dòng)力效應(yīng)的調(diào)控，從而能允許大分子透過。

3.2 建立靶向腦卒中模型

少量的單線態(tài)氧可以影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，從而打開血腦屏障，而大劑量的單線態(tài)氧可以損傷內(nèi)皮細(xì)胞，造成血小板聚集，形成血栓。因此，利用光動(dòng)力效應(yīng)可以建立缺血性腦卒中模型，也稱為光栓模型，被廣泛應(yīng)用于對(duì)缺血性腦卒中的研究當(dāng)中。傳統(tǒng)的靶向光栓模型需要在開顱的情況下建立，但開顱引發(fā)的顱內(nèi)壓變化和炎癥，使得大腦在卒中建立之前就處在非正常的環(huán)境當(dāng)中，從而對(duì)觀測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。

HU Zhengwu 等［64］將USOCA 與光栓技術(shù)相結(jié)合，在非開顱的情況下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腦皮層血管的靶向栓塞。改變激光照射位置和照射劑量，方便地對(duì)栓塞程度和栓塞區(qū)域進(jìn)行調(diào)節(jié)。

在傳統(tǒng)的光栓模型中，栓子的主要成分是血小板［94-95］，但是臨床上栓子的主要成分包括血小板和纖維蛋白［96-97］，并且纖維蛋白才是大部分溶栓藥物的有效靶點(diǎn)。因此，傳統(tǒng)的光栓不適合用于對(duì)溶栓藥物的研究。2020年，SUN Yuyo 等［98］提出了一種改進(jìn)的光栓模型，通過將凝血酶與光敏劑同時(shí)注射到小鼠的循環(huán)系統(tǒng)，激光照射后會(huì)在血管中形成同時(shí)包含血小板和纖維蛋白的栓子，更接近于臨床的情況。

LI Dongyu 等［65］將光透明顱窗與改進(jìn)的光栓模型相結(jié)合，分別對(duì)大腦中動(dòng)脈、大腦中動(dòng)脈二級(jí)分支和大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)端小血管建立了靶向缺血性腦卒中模型，用于研究臨床藥物尿激酶對(duì)不同尺寸血管的溶栓治療效果。結(jié)果表明，對(duì)于小尺寸的遠(yuǎn)端小血管，尿激酶溶栓時(shí)間最短，但容易形成二次堵塞；對(duì)于大尺寸的大腦中動(dòng)脈，尿激酶溶栓時(shí)間長(zhǎng)，且溶栓不完全；對(duì)于大腦中動(dòng)脈二級(jí)分支，尿激酶能比較好的實(shí)現(xiàn)血管再通，并且在一天后仍未出現(xiàn)二次堵塞現(xiàn)象（圖6）。

圖6 光透明顱窗用于建立靶向光栓模型及尿激酶對(duì)不同尺寸血管溶栓效果評(píng)估［65］Fig.6 Skull optical clearing window for establishment of targeted photothrombosis and evaluation of thrombolytic effect of urokinase for vessels with different sizes［65］

激光損傷模型因其損傷范圍和部位易于控制而被廣泛應(yīng)用［99-100］。LI Dongyu 等［51］透過光透明顱窗，將近紅外Ⅱ區(qū)的飛秒激光聚焦，實(shí)施了對(duì)皮層血管的靶向燒蝕，成功地建立了單血管出血性腦卒中模型。實(shí)驗(yàn)表明，在直徑較小和直徑較大的血管上都可以建立該模型。并且，實(shí)驗(yàn)人員利用光透明顱窗和三倍頻顯微鏡，能夠觀測(cè)到血管損傷出血、血液擴(kuò)散到血管損傷位點(diǎn)凝血的全過程。

4 總結(jié)與展望

近年發(fā)展的顱骨光透明技術(shù)為活體皮層觀測(cè)提供了一個(gè)無需開顱的光學(xué)窗口。十年來，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，至今已有多種光透明顱窗可供選擇，它們各有特點(diǎn)。SOCW 的作用機(jī)理是，對(duì)幼年小鼠顱骨進(jìn)行膠原解離，對(duì)成年小鼠顱骨進(jìn)行脫鈣，并用甘油進(jìn)行折射率匹配。它能對(duì)皮層淺層區(qū)域?qū)崿F(xiàn)突觸分辨。但是，由于沒有引入促滲劑，用于成年小鼠時(shí)需要預(yù)先將顱骨打磨至100 μm 厚。USOCA 通過乙醇和尿素來解離膠原并促進(jìn)滲透，并用十二烷基苯磺酸鈉進(jìn)行去脂。它不需要對(duì)顱骨進(jìn)行打磨，可以適用于最老8月齡的小鼠，并能實(shí)現(xiàn)5 個(gè)月的長(zhǎng)期重復(fù)透明觀測(cè)。將SOCW 和USOCA 結(jié)合，同時(shí)去除顱骨的羥基磷灰石、膠原蛋白和脂質(zhì)，可以進(jìn)一步提高顱骨的透明度，從而實(shí)現(xiàn)三光子深皮層血管成像。VNSOCA 將USOCA 中的水替換為重水，大大提高了其對(duì)近紅外Ⅱ區(qū)的透過率，同樣能借助三倍頻顯微鏡實(shí)現(xiàn)深皮層血管成像。近期，LI Dongyu 等［101］在bioRxiv 公開了一種長(zhǎng)效光透明顱窗，能使得小鼠顱骨在數(shù)周之內(nèi)保持透明，以供重復(fù)成像。同時(shí)，發(fā)表的新型光透明顱窗可以用于清醒動(dòng)物神經(jīng)元響應(yīng)以及光遺傳學(xué)研究，進(jìn)一步拓展了光透明顱窗的適用范圍。

隨著新型光透明顱窗的出現(xiàn)，光聲成像、激光散斑成像、高光譜成像和非線性顯微成像等多種光學(xué)成像技術(shù)被應(yīng)用于活體觀察皮層神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、血管結(jié)構(gòu)和功能。借助光透明顱窗，可以動(dòng)態(tài)觀測(cè)神經(jīng)突觸可塑性、神經(jīng)元自發(fā)發(fā)放或?qū)Υ碳さ捻憫?yīng)、長(zhǎng)時(shí)程監(jiān)測(cè)血管的修剪與新生、表層與深層的血液流速變化等。光學(xué)相干層析成像技術(shù)是一種非標(biāo)記的層析成像技術(shù)，可以在活體水平觀測(cè)組織或血管的三維結(jié)構(gòu)［102］，借助手術(shù)顱窗，該技術(shù)在腦科學(xué)研究中已得到廣泛應(yīng)用［103］。研究表明，活體皮膚光透明技術(shù)可以顯著增強(qiáng)光學(xué)相干層析成像在皮膚中的成像質(zhì)量，有助于獲取皮膚深組織信息。因此，將光透明顱窗技術(shù)與光學(xué)相干層析成像技術(shù)相結(jié)合，有潛力在無需標(biāo)記的情況下獲取皮層深組織的血管結(jié)構(gòu)與功能信息。不僅如此，顱骨光透明技術(shù)也為皮層靶向光操控提供了非侵入性的窗口。利用飛秒激光，可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)血管的靶向損傷，結(jié)合光動(dòng)力效應(yīng)，可以實(shí)現(xiàn)血腦屏障的開放或建立光栓模型。

不同的腦科學(xué)研究對(duì)顱窗提出了不同的要求。比如，神經(jīng)突觸成像需要高分辨觀測(cè)，許多疾病的研究需要長(zhǎng)時(shí)程跟蹤［66-67］，急性病理模型需要建窗口立即觀測(cè)［104-106］，神經(jīng)功能成像需要在清醒動(dòng)物上開展［107-108］，跨腦區(qū)研究需要較大的觀測(cè)視場(chǎng)［109］。開顱玻璃窗無法實(shí)現(xiàn)急性觀測(cè)，磨薄顱骨窗無法實(shí)現(xiàn)大視場(chǎng)觀測(cè)。而光透明顱窗發(fā)展至今，已同時(shí)具備了高分辨、大視場(chǎng)、長(zhǎng)時(shí)程、適用于急性觀測(cè)的優(yōu)勢(shì)，因而有望在某些傳統(tǒng)顱窗無法勝任的場(chǎng)合（比如急性創(chuàng)傷性腦損傷［110-111］的跨腦區(qū)觀測(cè)）提供重要的技術(shù)支撐，從而在未來的腦科學(xué)研究中大放異彩。

誠(chéng)然，目前顱骨光透明技術(shù)依然有所限制。比如，目前尚未有適用于更大動(dòng)物（比如大鼠、獼猴等）的活體顱骨光透明方法，這需要研究人員繼續(xù)探索更高效的顱骨光透明方法。一方面，可以篩選折射率更高的試劑用于折射率匹配；另一方面，需要發(fā)展更有效的物理或化學(xué)促滲方法，幫助光透明試劑充分作用于更厚的顱骨。另外，相較于開顱玻璃窗和磨薄顱骨窗的平面結(jié)構(gòu)，光透明顱窗維持了顱骨的曲面結(jié)構(gòu)，雖然這使得大腦在被觀測(cè)時(shí)更接近于生產(chǎn)生理狀態(tài)，但是，曲面的顱窗給成像帶來更多像差，并且會(huì)限制小景深成像系統(tǒng)的應(yīng)用。在未來，可以通過自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)［112-113］，為基于顱骨光透明的成像進(jìn)行波前矯正，同時(shí)期待大視場(chǎng)、高分辨且同時(shí)擁有大焦深的成像技術(shù)（比如光場(chǎng)顯微鏡［114］）與光透明顱窗的結(jié)合。