徐圣潔 吳濤 郭子正 王中琳

癲癇是一種突發(fā)性大腦神經(jīng)元高度同步化反復異常過度放電引起短暫性腦功能失調(diào)的慢性大腦疾病[1]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)內(nèi)特定區(qū)域的炎癥反應是癲癇的共同特征之一[2]。由于癲癇發(fā)作時，谷氨酸受體過度激活、氧化應激、促炎細胞因子升高等均可破壞血-腦屏障(blood brain barrier，BBB)，故CNS內(nèi)部的炎癥反應以及外周循環(huán)中的炎癥反應均可誘發(fā)癲癇。外泌體作為介導細胞間通訊的一種新載體，已被大量研究證實其能通過抑制膠質(zhì)細胞激活、參與免疫應答等途徑減輕炎癥反應，降低神經(jīng)元敏感性，控制癲癇發(fā)作。此外，外泌體所獨有的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)和穿越BBB的能力，可成為給藥載體，在癲癇的治療中發(fā)揮作用[3]。

盡管目前癲癇的診治途徑有多種，但仍有25%的患者被誤診[4]，約30%的患者癲癇發(fā)作難以得到良好的控制[5]，因此尋求新的診治方案具有重要意義。外泌體成為近年來研究癲癇診治的熱點。現(xiàn)就外泌體在癲癇炎癥反應中的作用研究進展進行綜述。

1 外泌體概述

外泌體是一類直徑約50～150 nm的細胞外囊泡(圖1)，其內(nèi)包含多種遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，可在血液、尿液、腦脊液[6]等體液中被檢測到。大量研究表明，外泌體可通過促進細胞間信號傳遞和調(diào)節(jié)細胞對外部環(huán)境的反應參與許多生理病理活動[7]，并在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。Ge等[8]研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞外泌體 miR-124-3p 通過靶向 Rela/ApoE 信號通路減輕神經(jīng)變性；Kuwano等[9]研究認為神經(jīng)源性外泌體中的IL34/CD81可能是重度抑郁癥患者的重要生物標志物；Zhang等[10]在大鼠局灶性腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)外源性外泌體可與受體細胞相互作用，間接促進受損神經(jīng)修復；Thomi等[11]研究結(jié)果提示外泌體在圍生期腦損傷中具有抗炎作用。此外，亦有研究發(fā)現(xiàn)采用腦轉(zhuǎn)移細胞的外泌體預調(diào)節(jié)腦微環(huán)境可增強癌細胞的生長[12]。

圖1 外泌體的形成以及介導細胞間聯(lián)系的方式

2 外泌體與癲癇炎癥反應

外泌體作為一種新型的細胞通訊載體，可以抑制炎癥反應，調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達，包括促炎細胞因子如白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和抗炎細胞因子等，外泌體通過與神經(jīng)系統(tǒng)靶細胞特異性結(jié)合，減少神經(jīng)元脫失等方式參與CNS神經(jīng)炎癥調(diào)控[13]。另外，外泌體能夠穿過BBB，直接將微小核糖核酸(microRNA)、藥物、蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)遞送到大腦，可能成為治療癲癇的潛在遞送系統(tǒng)。

2.1 抑制膠質(zhì)細胞激活膠質(zhì)細胞激活是癲癇炎癥反應的主要特征。多項研究證實外泌體可以抑制膠質(zhì)細胞的激活。

2.1.1星形膠質(zhì)細胞與外泌體：星形膠質(zhì)細胞增生比小膠質(zhì)細胞更持久，因此在炎癥反應中造成的危害更大。星形膠質(zhì)細胞具有營養(yǎng)神經(jīng)、保護神經(jīng)、維持細胞外離子平衡、跨突觸傳遞信號以及參與形成BBB等作用[14]，而CNS受損后，星形膠質(zhì)細胞大量增生，隨之出現(xiàn)谷氨酸興奮性毒性、細胞縫隙連接改變和線粒體功能障礙等異常表現(xiàn)。

Xian等[15]采用間充質(zhì)干細胞來源的外泌體治療毛果蕓香堿誘發(fā)的癲癇小鼠模型時發(fā)現(xiàn)，與脂多糖組比較，外泌體處理組小鼠雙側(cè)海馬組織中膠質(zhì)纖維酸性蛋白和補體3相對表達水平降低，TNF-α和IL-1β的分泌顯著減弱，且Ca2+內(nèi)流顯著減少，小鼠空間和記憶障礙得到恢復，提示外泌體能夠改善反應性星形膠質(zhì)增生、炎癥反應、異常鈣信號和線粒體功能障礙，并減輕癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)誘發(fā)的學習和記憶障礙。間充質(zhì)干細胞來源外泌體能夠通過調(diào)節(jié)核因子-E2相關(guān)因子2(Nrf2)-核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號通路，抑制星形膠質(zhì)細胞激活，以減輕炎癥損傷。Nrf2與NF-κB相互作用會導致神經(jīng)炎癥和氧化應激。Nrf2是一種由炎癥作用引發(fā)的氧化損傷的調(diào)節(jié)因子，在炎癥或氧化應激下，可以啟動抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄和相應蛋白質(zhì)的合成[16]。NF-κB激活能夠驅(qū)動免疫反應，包括膠質(zhì)細胞增生、白細胞浸潤和促炎細胞因子的產(chǎn)生。有研究認為，外泌體通過上調(diào)Nrf2表達和核易位，以及降低NF-κB活性阻止星形膠質(zhì)細胞的激活[15]；靶向反應性星形膠質(zhì)細胞是控制癲癇發(fā)作的潛在治療方案[17]，在炎癥過程中外泌體可誘導兩種不同類型的反應性星形膠質(zhì)細胞(即A1和A2)，反應性星形膠質(zhì)細胞持續(xù)增生會刺激促炎細胞因子產(chǎn)生和釋放，并促進炎癥刺激后膠質(zhì)細胞增生和神經(jīng)元脫失的擴散[18]。與正常星形膠質(zhì)細胞比較，A1星形膠質(zhì)細胞具有破壞突觸[19]以及神經(jīng)元毒性的作用。在調(diào)節(jié)Nrf2-NF-κB信號通路的過程中，外泌體不僅可抑制反應性星形膠質(zhì)細胞的增生，甚至還可將A1催化轉(zhuǎn)變?yōu)樵錾暗男切文z質(zhì)細胞。線粒體功能障礙是眾多神經(jīng)變性疾病的基礎(chǔ)[20]，主要表現(xiàn)為線粒體鈣離子處理異常。間充質(zhì)干細胞來源的外泌體通過恢復線粒體膜電位而改善線粒體功能障礙，減少星形膠質(zhì)細胞Ca2+內(nèi)流，逆轉(zhuǎn)海馬結(jié)構(gòu)區(qū)星形膠質(zhì)細胞的異常鈣信號。

相對于間充質(zhì)干細胞，間充質(zhì)干細胞來源的外泌體能攜帶mRNA、microRNA和蛋白質(zhì)等抗炎因子，免疫原性較低，更易儲存和管理，外泌體或外泌體裝載藥物靶向海馬結(jié)構(gòu)的星形膠質(zhì)細胞或可能成為癲癇新的治療方案。

2.1.2小膠質(zhì)細胞與外泌體：研究證明[21]小膠質(zhì)細胞激活的程度與癲癇的持續(xù)時間呈正相關(guān)。小膠質(zhì)細胞作為大腦中重要的免疫細胞，在調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥的過程中起著舉足輕重的作用[22]。SE會導致神經(jīng)變性、海馬組織炎癥、BBB破壞等，這與多種促炎細胞因子濃度增加和小膠質(zhì)細胞激活密切相關(guān)。

Long等[23]研究發(fā)現(xiàn)小鼠SE后給予骨髓間充質(zhì)干細胞來源A1外泌體治療可有效減少神經(jīng)變性疾病的發(fā)生，減輕慢性期海馬組織炎癥，維持正常神經(jīng)發(fā)生和認知記憶功能。SE后谷氨酸水平升高及其引發(fā)的持續(xù)的神經(jīng)炎癥[24]是導致認知和記憶功能障礙的主要原因，大量谷氨酸作用于突觸后膜的谷氨酸受體，引發(fā)興奮性神經(jīng)毒性，導致神經(jīng)元細胞凋亡[25]。同時在癲癇發(fā)作過程中γ-氨基丁酸(GABA)受到抑制。維持谷氨酸與GABA之間的平衡是控制癲癇發(fā)作的潛在方案，A1外泌體可保護海馬結(jié)構(gòu)區(qū)的谷氨酸能神經(jīng)元(興奮性)和GABA能中間神經(jīng)元(抑制性)，使谷氨酸與GABA維持相對平衡，控制癲癇發(fā)作。小膠質(zhì)細胞能吞噬、清除細胞碎片，釋放抗炎因子和神經(jīng)生長因子，減輕神經(jīng)損傷、促進修復。然而小膠質(zhì)細胞高度活化時，會釋放促炎因子及細胞毒性物質(zhì)，造成神經(jīng)元脫失。SE小鼠經(jīng)A1外泌體介導治療后其海馬組織小膠質(zhì)細胞激活受到抑制，多種促炎細胞因子如TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1等表達水平降低，抗炎細胞因子如IL-10、IL-6等表達增強。炎癥及其介導的氧化應激與神經(jīng)元脫失關(guān)系密切，海馬結(jié)構(gòu)區(qū)持續(xù)放大的炎癥反應使機體氧化應激水平升高，而活性氧自由基又可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元之間的突觸與非突觸通訊，導致神經(jīng)炎癥和細胞凋亡，使機體出現(xiàn)認知障礙和記憶喪失。SE后，新生的顆粒細胞異常遷移到齒狀回的門區(qū)，而Reelin(一種分泌型細胞外基質(zhì)糖蛋白)可以介導其向顆粒層遷移。A1外泌體通過保護Reelin中間神經(jīng)元，減少異常神經(jīng)網(wǎng)絡的形成[23]?？傊?，A1外泌體可通過維持谷氨酸與GABA之間的平衡、抑制小膠質(zhì)細胞激活、保護Reelin中間神經(jīng)元等途徑減少SE引起的神經(jīng)變性、神經(jīng)炎癥以及認知和記憶障礙；SE終止后的短時間內(nèi)給予A1外泌體有利于阻止SE向慢性癲癇轉(zhuǎn)變。

2.1.3少突膠質(zhì)細胞與外泌體：少突膠質(zhì)細胞是一種重要的CNS髓鞘形成細胞，在脫髓鞘疾病中，少突膠質(zhì)細胞受炎癥微環(huán)境的影響會大量凋亡，嚴重影響髓鞘再生[26]。癲癇發(fā)作常與CNS脫髓鞘病變同時出現(xiàn)[27]，其原因主要與脫髓鞘病變導致自主神經(jīng)功能異常有關(guān)。

Pusic等[28]采用用低水平的干擾素-γ刺激樹突狀細胞發(fā)現(xiàn)，其釋放的外泌體含有能夠增加基線髓鞘形成、降低氧化應激和恢復脫失髓鞘的微RNA，如miR-219(影響髓鞘生成)、miR-17-92(恢復脫失髓鞘)、miR-181a(抑制促炎信號)、miR-124(促進抗炎信號)等，外泌體內(nèi)多種miRNA的協(xié)同作用是髓鞘形成以及再髓鞘化的必要條件；此外，研究發(fā)現(xiàn)該外泌體優(yōu)先被少突膠質(zhì)細胞(72%)攝取，其次是被小膠質(zhì)細胞(34%)和星形膠質(zhì)細胞(12%)攝取，提示IFN-γ刺激樹突狀細胞后釋放的外泌體主要通過靶向少突膠質(zhì)細胞以減輕脫髓鞘病變[28]。樹突狀細胞釋放的外泌體中含有大量miR-219，并通過靶向調(diào)控NeuroD1、PDGFRa、ELOVL7等參與調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細胞的分化以及髓鞘再生[29]。進一步探索此類外泌體與少突膠質(zhì)細胞之間的作用機制，使其特異性靶向于少突膠質(zhì)細胞，有利于實現(xiàn)少突膠質(zhì)細胞最大限度地再髓鞘化。

2.2 參與免疫應答免疫反應與癲癇的發(fā)生、進展有密切關(guān)系[30]。炎癥反應實際上是免疫應答中的一個暫時狀態(tài)，免疫細胞和炎性因子在炎癥反應中發(fā)揮關(guān)鍵作用：一方面，炎癥局部有大量免疫細胞的浸潤，激活后的免疫細胞會釋放某些促炎癥因子(如TNF-α、IL-1β等)，加重炎癥反應；另一方面，免疫細胞也會釋放抗炎因子(如IL-10等)，促進炎癥反應消退。

正常情況下BBB可以隔離腦組織與免疫系統(tǒng)。在免疫應答的過程中，炎癥反應通過多種機制破壞內(nèi)皮細胞使BBB通透性改變，導致神經(jīng)元細胞敏感性提高，癲癇發(fā)生閾值降低[31]，適度的炎癥反應會促進CNS的代謝以及神經(jīng)元突觸重建，而當炎癥反應進一步加劇時，可導致癲癇發(fā)作。神經(jīng)興奮性增加，BBB受損，可誘發(fā)癲癇發(fā)作。外泌體在調(diào)節(jié)免疫反應中發(fā)揮重要作用，如抗原呈遞[32]、免疫抑制[33]、免疫監(jiān)視[34]、免疫活化以及調(diào)控細胞間信息傳遞等。如間充質(zhì)干細胞來源的外泌體能上調(diào)IL-10等炎癥和免疫抑制因子的表達，促進調(diào)節(jié)性T細胞增殖，產(chǎn)生免疫抑制作用。

3 外泌體及其內(nèi)容物可能成為癲癇的生物標志物

不同細胞來源的外泌體大約包含11261種蛋白質(zhì)、2375種mRNA和764種miRNA[35]，其內(nèi)容物的多樣性與復雜性為外泌體成為癲癇的生物標志物奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果顯示，某些miRNA的缺失會導致癲癇的發(fā)生，如miR-128是神經(jīng)元興奮性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，其表達的減少可引起致命性癲癇的發(fā)生[36]。

癲癇發(fā)生時，外泌體miRNA在血清中的表達發(fā)生變化。Wang等[37]通過對117例癲癇患者和112名健康人群進行分析發(fā)現(xiàn)，癲癇患者血清中有6種miRNA顯著失調(diào)，即let-7d-5p、miR-15a-5p、-194-5p、-106b-5p、-130a-3p和-146a-5p。在諸多miRNA中，miR-106b-5p敏感度高達80.3%，特異度達81.2%，有望成為新的生物標志物。另外，Batool等[38]研究發(fā)現(xiàn)SE 2周后，癲癇小鼠外泌體分泌仍處于較高水平。

4 外泌體與癲癇的治療

目前癲癇的治療以抗癲癇藥物治療為主，例如苯妥英鈉、卡馬西平和丙戊酸鈉等。盡管目前已有約30種不同分子靶點的抗癲癇藥物可用，但在癲癇治療中仍然面臨許多挑戰(zhàn)，如耐藥性[39]、副作用[40]等，近1/3的癲癇患者病情得不到完全控制。

BBB是影響抗癲癇藥物作用的一個巨大障礙。在腦靶向遞送[41]中，外泌體既可通過自身參與神經(jīng)細胞間信息傳遞影響炎癥反應與免疫應答，又可通過內(nèi)吞或受體介導與藥物結(jié)合，使其高效滲透BBB，繞過P-糖蛋白藥物泵出系統(tǒng)，實現(xiàn)藥物的穩(wěn)定長效。既往研究主要集中在外泌體自身及其攜帶的miRNA在癲癇炎癥反應的作用[15，23]，目前尚未檢索到有關(guān)外泌體作為給藥載體治療癲癇的臨床研究，但可以從其他CNS變性疾病中獲得啟發(fā)，如Haney等[42]采用鼻腔給藥的方式將裝載過氧化氫酶的外泌體注入小鼠體內(nèi)，并在小鼠腦內(nèi)成功檢測到大量裝載過氧化氫酶的外泌體。這些外泌體不僅能有效避免免疫排斥反應，還展現(xiàn)出保護神經(jīng)的作用。姜黃素的主要作用是清除自由基、抗炎、降血脂和抗聚集[43]，但其吸收差、代謝快，生物利用度很低。Kalani等[44]將姜黃素裝載進小鼠胚胎干細胞來源的外泌體中，發(fā)現(xiàn)姜黃素的生物利用度明顯提高，并且可通過降低小鼠大腦中膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達以減少星形膠質(zhì)細胞增生。

綜上所述，目前盡管針對外泌體的研究尚處于起步階段，但已有研究證實外泌體能通過抑制膠質(zhì)細胞激活、參與免疫應答等途徑有效減輕癲癇炎癥反應，從而控制癲癇發(fā)作。但此過程所涉及的一些信號通路較為復雜，具體機制仍有待研究。從研究現(xiàn)狀來看，外泌體廣泛應用于癲癇的診斷與治療仍存在較大困難，如何大規(guī)模開發(fā)和高效利用外泌體[45]是一個亟待解決的問題，如何保證外泌體攜帶的有利蛋白、miRNA以及藥物能夠定向、定量地到達受損組織也是一個巨大挑戰(zhàn)。理論與臨床應用之間是反復的實踐過程，大量研究證實外泌體是診斷和治療癲癇的潛在方案，因此深入研究外泌體減輕炎癥反應的機制，對于控制癲癇發(fā)作具有重要意義。