吳宙光，王 斌，左桃燕，陳思琦，付靜茹，張文杰

(廣東省深圳市兒童醫(yī)院普外科，廣東 深圳 518026)

膽道閉鎖(biliary astresia，BA)以肝內(nèi)外膽管進行性炎癥和膽汁淤積性黃疸為特點，可導(dǎo)致嬰幼兒出現(xiàn)進行性肝纖維化和肝硬化，甚至出現(xiàn)肝衰竭。肝門-空腸吻合術(shù)(kasai portoenterostomy, kasai)是治療BA的主要手術(shù)方式，研究表明，BA患兒kasai術(shù)后易出現(xiàn)肝功能損傷、膽管炎、持續(xù)性黃疸等并發(fā)癥，其中膽管炎是BA患兒kasai術(shù)后最為常見的并發(fā)癥，多于術(shù)后1年內(nèi)發(fā)生[1]，術(shù)后膽管炎的發(fā)生多與術(shù)后食物反流、膽道梗阻、腸道微生物遷移、腸道黏膜功能紊亂和免疫功能、患兒營養(yǎng)狀態(tài)等因素密切相關(guān)[2]。因此，尋找減少kasai術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生的有效治療方法顯得尤為重要。營養(yǎng)支持治療對BA患兒kasai術(shù)后具有重要作用，分為腸外營養(yǎng)(parenteral nutrition,PN)和腸內(nèi)營養(yǎng)(enteral nutrition,EN)。EN具有價格更為低廉、符合生理需求等優(yōu)勢，在保護腸道黏膜、調(diào)節(jié)免疫功能等方面更優(yōu)于PN，主要通過改善腸道黏膜穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)腸道菌群等發(fā)揮重要作用[3-5]。目前尚無充分基礎(chǔ)實驗數(shù)據(jù)支持EN治療對BA改善患兒腸黏膜結(jié)構(gòu)及微生態(tài)保護方面的作用。本研究擬探討EN治療對BA幼鼠腸道黏膜結(jié)構(gòu)改善及微生態(tài)保護等方面的作用，為今后開展臨床營養(yǎng)治療BA患兒提供充分的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1BA幼鼠模型構(gòu)建 雄性Wistar大鼠(3～4周)80～100 g，術(shù)前禁食12 h，禁水4 h，氯胺酮20 mg/kg腹腔注射麻醉，取上腹正中切口，顯露肝十二指腸韌帶，于近肝門處游離并結(jié)扎膽總管。假手術(shù)組僅做游離但不結(jié)扎膽總管。模型制作成功標準：術(shù)后3 d采靜脈血檢查血總膽紅素和直接膽紅素，超出正常值5倍為造模成功。將幼鼠置于22～26 ℃，相對濕度40%～70%，通風、安靜的環(huán)境中分籠喂養(yǎng)。PN模型：幼鼠取右頸外側(cè)2 cm長切口，游離頸外靜脈，用20針頭于頸前切口作一通向肩胛區(qū)的隧道，將靜脈導(dǎo)管20號針頭自背部引至頸前部，1號線結(jié)扎頸外靜脈遠心端，近心端剪一V字形切口將導(dǎo)管向心臟方向插入1.0～1.5 cm，避免過深而進入右心房，抽吸回血后，結(jié)扎固定導(dǎo)管，縫合切口，把從肩胛區(qū)引出的靜脈導(dǎo)管順序穿過背扣、保護彈簧及旋轉(zhuǎn)裝置，與限速輸液泵連接。若造模和治療過程中，幼鼠出現(xiàn)死亡再次利用新的BA幼鼠模型補充，進行后續(xù)治療。

本研究通過醫(yī)院動物倫理委員會批準。

1.2分組及治療方案 將40只BA幼鼠采用隨機法分為假手術(shù)組、PN組、EN組、抗生素組，每組10只，所有幼鼠手術(shù)后12 h均予以常規(guī)自由水治療，假手術(shù)組和抗生素組用普通飼料打成勻漿后灌胃治療，抗生素組予以氨芐青霉素治療(1 g/L，溶于普通飼料中，美國sigma公司)，PN組和EN組分別予以PN和EN治療。PN營養(yǎng)制劑(遼寧海思科制藥有限公司)，100%由靜脈營養(yǎng)液提供熱、氮量，微量泵輸注，3.3 mL/h，EN組予以百普素(德國 Milupa GmbH公司)灌胃治療；所有組幼鼠均等熱、等氮治療，保證熱量610 kJ·kg-1·d-1，氮量1.0 g/d；所有組幼鼠于實驗第10天處死。

1.3觀察指標 體重：于造模前、造模后1、5、10 d稱量3次，取平均值作為當日BA幼鼠的體重；營養(yǎng)指標：血清總蛋白(total protein, TP)、白蛋白(albumin, ALB)于造模后10 d測量，取幼鼠靜脈血，采用血生化儀測量；腸黏膜形態(tài)：造模后飼養(yǎng)10 d處死幼鼠，分離組織取小腸組織進行蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色，顯微鏡下觀察小腸黏膜形態(tài)變化，采用顯微測量尺測定黏膜厚度、腺隱窩深度、絨毛高度；造模10 d后進行細菌培養(yǎng)：取幼鼠腸系膜淋巴結(jié)組織，粉碎后與LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落并計數(shù)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗和重復(fù)測量的方差分析、LSD-q檢驗、Mann-WhitneyU檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1BA幼鼠模型不同時間點體重 造模成功后，各組幼鼠的體重均先減輕后增長，與假手術(shù)組比較，抗生素組、EN組和PN組體重減輕后增長的較為緩慢，4組組間、時點間、組間與時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同組別BA幼鼠不同時間點體重比較

2.2BA幼鼠模型營養(yǎng)狀態(tài) 治療10 d后，與假手術(shù)組比較，抗生素組和PN組TP、ALB水平下降，與PN組、抗生素組比較，EN組TP、ALB水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同組別BA幼鼠營養(yǎng)狀況比較

2.3BA幼鼠模型腸黏膜形態(tài) 治療10 d后，與假手術(shù)組比較，抗生素組和PN組黏膜厚度、腺隱窩深度、絨毛高度下降；與抗生素組比較，PN組黏膜厚度、腺隱窩深度、絨毛高度上升；與PN組、抗生素組比較，EN組黏膜厚度、腺隱窩深度、絨毛高度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 不同組別幼鼠腸道黏膜厚度、腺隱窩深度、絨毛高度比較

2.4BA幼鼠模型腸道微生態(tài)分析 治療10 d后，與假手術(shù)組比較，抗生素組和PN組大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌數(shù)量升高，與抗生素組和PN組比較，EN組大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌數(shù)量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同組別幼鼠腸道細菌培養(yǎng)比較

3 討 論

BA是新生兒梗阻性黃疸的主要原因之一，為小兒最常見的嚴重肝膽外科疾病，早期手術(shù)治療改善梗阻情況及手術(shù)方式的改良、術(shù)后常規(guī)給予抗生素、類固醇藥物等均是以延長BA患兒生存期、減少術(shù)后并發(fā)癥為目的[2,5]。膽管炎是BA患兒kasai術(shù)后最主要的并發(fā)癥。目前膽管炎的發(fā)生主要與膽汁淤積及排泄障礙、腸道微生物遷移及患兒免疫功能下降有關(guān)，可能機制是kasai術(shù)后膽汁排泄障礙，膽汁在肝內(nèi)外淤積，細菌通過血液和淋巴液循環(huán)到達吻合口及肝內(nèi)時，淤積的膽汁使得細菌更為順利地定植并繁殖，從而誘發(fā)膽管炎的發(fā)生[6-8]。引發(fā)膽管炎的致病菌多為腸道菌群，以大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌等革蘭陰性桿菌為主。腸道黏膜功能受損易引起菌群失調(diào)及菌群的遷移，這些變化可觸發(fā)膽管炎的發(fā)生[9-11]。BA患兒常伴有營養(yǎng)不良、免疫力低下和發(fā)育遲滯，術(shù)后消化道功能異常可進一步加重營養(yǎng)吸收障礙、免疫功能低下，從而加重細菌遷移感染的易感性，這些因素都與術(shù)后不良預(yù)后相關(guān)。美國危重癥協(xié)會和美國腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)學(xué)協(xié)會指南中建議胃腸道術(shù)后應(yīng)早期(術(shù)后24～48 h)進行EN治療，對早期恢復(fù)術(shù)后消化道功能具有重要意義[5,11]。

對于BA幼鼠，同樣常伴有營養(yǎng)不良、腸屏障功能障礙、免疫功能低下等狀況，這些狀況易引起腸道細菌移位，甚至發(fā)生腸源性感染。在大鼠膽總管結(jié)扎的BA模型中，腸道呈水腫和炎癥性病變，可形成腸上皮間隙，腸黏膜緊密連接降低，分泌性免疫蛋白下降，黏膜上細菌附著增加，營養(yǎng)吸收障礙，這些均可誘導(dǎo)腸道炎癥，進而誘發(fā)BA術(shù)后膽管炎發(fā)生[7]。既往動物實驗研究提示高脂EN可減輕腹膜空氣暴露后腸黏膜屏障損傷，其機制可能與其抗氧化作用有關(guān)[12]。亦有研究指出在大鼠腸缺血/再灌注損傷模型中，富含脂質(zhì)的腸內(nèi)營養(yǎng)可以控制腸道炎癥，改善腸道運動和黏膜屏障損傷[13]。但EN治療能否改善BA幼鼠模型伴發(fā)的腸道屏障功能障礙、營養(yǎng)不良等病變目前尚無動物實驗研究。本研究通過分析早期EN治療對BA幼鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)改善及微生態(tài)保護方面的作用，本研究顯示，BA造模成功后，與假手術(shù)組比較，BA幼鼠模型術(shù)后體重明顯下降，營養(yǎng)狀況更差，腸黏膜損害嚴重(黏膜厚度、腺隱窩深度、絨毛高度下降)，腸道菌群感染增多，考慮BA易引起腸道黏膜結(jié)構(gòu)稀疏，造成膜屏障的損害，可促進細菌移位及大量繁殖，這些變化與既往BA幼鼠模型較為一致[8]。既往研究提示，短期預(yù)防性靜脈注射抗生素可能導(dǎo)致早期膽管炎，這可能導(dǎo)致較高的膽管炎發(fā)生率[11]。在本研究中，與PN組比較，抗生素組腸道黏膜功能下降，腸道致病菌群稍升高，考慮長時間抗生素治療可引起腸道菌群紊亂，PN營養(yǎng)治療可能改善腸道黏膜屏障和調(diào)節(jié)腸道菌群有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，與抗生素組和PN組比較，EN治療能夠明顯改善BA幼鼠TP、ALB等營養(yǎng)狀態(tài)指標，明顯增加幼鼠體重。在改善腸道黏膜結(jié)構(gòu)方面，BA組動物腸黏膜厚度、腺隱窩深度、絨毛高度水平均有明顯升高，這些改變可能與早期EN治療刺激胃腸激素合成和釋放，有利于腸道營養(yǎng)吸收，促進腸蠕動和黏膜增生，維持黏膜完整性，利于營養(yǎng)物質(zhì)吸收有關(guān)[12-13]?？梢?，腸內(nèi)營養(yǎng)制劑在改善BA幼鼠腸道黏膜結(jié)構(gòu)、功能和營養(yǎng)狀況方面發(fā)揮著重要作用。

微生態(tài)在BA幼鼠的腸道功能維持中亦發(fā)揮著中重要作用，細菌遷移可引起腸道菌群失調(diào)，參與了BA幼鼠kasai術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生[14-15]。本研究分析顯示，與抗生素組和PN組比較，EN組大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌數(shù)量明顯下降，提示EN治療能夠有效抑制大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌等致病菌的繁殖，EN治療抑制致病菌繁殖的原因可能是由于EN治療改善了BA幼鼠的營養(yǎng)狀態(tài)，通過有效地營養(yǎng)免疫調(diào)節(jié)作用穩(wěn)定了腸道微生態(tài)，使腸道菌群維持平衡。有學(xué)者通過人群試驗研究結(jié)果顯示，早期EN支持可以有效降低腸道黏膜損傷程度，調(diào)節(jié)腸道菌群失衡，降低感染及死亡風險[16]。另有研究證明，EN治療的胰腺炎患者腸道中的乳酸桿菌、雙歧桿菌水平明顯高于對照組[17]。上述研究均表明EN治療在抑制致病菌、增加有益菌方面起到了重要作用。本研究尚未對幼鼠腸道營養(yǎng)治療后的炎性指標檢測，由于抗生素治療可能對其炎性指標的影響，尚未對組間的炎性指標進行分析，今后會進一步分析早期EN治療對BA幼鼠的炎性指標的影響，為指導(dǎo)BA的治療提供重要參考依據(jù)。目前只是初步評價早期腸內(nèi)營養(yǎng)治療對BA小鼠的腸道微生態(tài)研究，尚未對腸黏膜屏障分子的檢測，今后需進一步檢測腸道組織中GFAP、S100β、ZO-1、claudin-1等腸黏膜相關(guān)指標，更為精準判斷早期腸內(nèi)營養(yǎng)治療的療效。

綜上所述，對于BA幼鼠，EN治療能夠有效改善胃腸道黏膜結(jié)構(gòu)、功能，有效改善BA幼鼠營養(yǎng)狀況，穩(wěn)定腸道微生態(tài)，為EN治療BA患兒提供了重要的參考依據(jù)。