李 芬，劉木清，祝劍峰

（湖北生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，武漢 430200）

月季（Rosa chinensisJacq.）原產(chǎn)于中國，是中國傳統(tǒng)的十大名花之一［1］，素有花中皇后之美稱［2］。17世紀(jì)月季被引種傳入歐洲，在歐洲經(jīng)過了幾百年的繁育，產(chǎn)生了與傳統(tǒng)月季不一樣的特征［3］。歐月泛指2000年以后由歐美、日本等地引進(jìn)的月季新品種。相較于傳統(tǒng)月季，歐月觀賞性狀更為突出：花色豐富、花瓣數(shù)量多、花型多樣獨(dú)特、香味多樣而強(qiáng)烈、株型多樣等［4］。歐月應(yīng)用廣泛，可盆栽、制作切花，也可用作花境和綠籬，深受人們的喜愛，無論從商業(yè)還是文化的角度，都是極具潛力的花卉品種［3，4］，在中國的河北、浙江、重慶等地區(qū)大量引進(jìn)種植。

中國月季育苗技術(shù)較為落后，生產(chǎn)上仍以傳統(tǒng)的扦插和嫁接方式為主，限制了優(yōu)良品種育苗的速度，難以滿足市場的需求［1，5］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，葉貽勛等［6］、于非等［7］先后成功建立了月季組織培養(yǎng)技術(shù)體系，歐月品種紅寶石冰屬微型豐花月季，扦插不易生根，嫁接繁殖系數(shù)太低，難以進(jìn)行大規(guī)模育苗，因此采用組織培養(yǎng)工廠化育苗是最有效的方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

歐月品種紅寶石冰來自湖北生態(tài)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院大冶試驗(yàn)林場苗圃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體取材 在4—5月，選擇連續(xù)晴朗天氣，生長健壯的紅寶石冰植株，取當(dāng)年生半木質(zhì)化的枝條中部作為外植體［8］。將枝條去刺、剝?nèi)ト~片，用手術(shù)刀將每個帶芽莖段切割成長為3 cm左右的外植體，切割時注意芽上部留0.5 cm，下部留2.5 cm。

1.2.2 外植體滅菌 將莖段外植體置于燒杯中，蓋上紗布，自來水流水沖洗30 min，吸干表面水分。先用75%的乙醇滅菌30 s［9］，期間不斷搖動瓶身使乙醇與外植體充分接觸，然后用無菌水沖洗1次，再分別使用0.1% HgCl2和2%NaClO滅菌，最后用無菌水沖洗4～5次待用。其中，0.1% HgCl2滅菌時間設(shè)5個處理，分別為4、6、8、10、12 min；2%NaClO滅菌時間設(shè)5個處理，分別為7、10、12、15、18 min。滅菌期間每30 s振搖瓶身數(shù)次。

1.2.3 初代培養(yǎng) 每個滅菌處理接種30瓶（每配方接種5瓶），每瓶接種2個莖段。7 d后統(tǒng)計(jì)污染率，15 d后統(tǒng)計(jì)成活率，通過比較不同處理的滅菌效率以確定最佳的滅菌方案。計(jì)算公式如下。

采用以上最佳滅菌處理，每個培養(yǎng)基配方接種30瓶，每瓶培養(yǎng)基接種2個莖段，30 d后計(jì)算萌發(fā)率，通過比較不同配方的萌發(fā)率以確定最佳的培養(yǎng)基配方。

1.2.4 繼代增殖培養(yǎng) 腋芽萌發(fā)至1～2 cm時即可轉(zhuǎn)入繼代增殖培養(yǎng)。將腋芽從莖段上切取下來，切割成單芽，注意芽的基部保留一部分莖段組織，有利于形成叢芽。每配方接種30瓶，每瓶接種3個單芽，40 d后計(jì)算增殖系數(shù)。公式如下。

1.2.5 生根培養(yǎng) 待試管苗高度達(dá)3 cm左右即可進(jìn)行生根培養(yǎng)。將叢芽沿縱向切割成單苗，接種到生根培養(yǎng)基中，每配方接種30瓶，每瓶培養(yǎng)基接種3株，30 d后計(jì)算每個配方的生根率。公式如下。

1.2.6 煉苗移栽 待試管苗長出3～4條主根，苗高達(dá)4 cm時，即可進(jìn)行煉苗移栽。移栽前2 d，打開瓶口加入少許水進(jìn)行煉苗，讓試管苗適應(yīng)外界的環(huán)境。移栽時要洗去根部多余的培養(yǎng)基，防止?fàn)€根。移栽后7 d內(nèi)需進(jìn)行精細(xì)管理，10 d后進(jìn)行常規(guī)水肥管理。栽培基質(zhì)分別為D1：河沙、D2：河沙+草炭（1∶1）、D3：珍珠巖+草炭+蛭石（1∶1∶1），以上基質(zhì)比例均為體積比，各基質(zhì)均需滅菌。每種基質(zhì)移栽90株，30 d后計(jì)算移栽成活率。

1.2.7 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 以MS為基本培養(yǎng)基［10］，初代培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)階段細(xì)胞分裂素選用6-BA，生長素選用NAA，采用雙因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，各選擇6個配方；生根階段只添加生長素NAA［11］，選擇6個配方。瓊脂7.5 g/L，pH 5.8，蔗糖用量初代培養(yǎng)和繼代增殖培養(yǎng)階段為30 g/L，生根階段為10 g/L。培養(yǎng)溫度為25℃，濕度60%，光照時間為14 h/d，光照度2 500 lx［2］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌劑、不同滅菌時間對紅寶石冰外植體成活率的影響

2%NaClO滅菌效果見表1，0.1%HgCl2滅菌效果見表2。從表1、表2可以看出，在污染率方面，2種滅菌劑表現(xiàn)一致，即隨著滅菌時間的延長，污染率明顯降低。當(dāng)使用2%NaClO滅菌時間超過18 min后，外植體成活率明顯降低；0.1%HgCl2類似，滅菌時間超過8 min后，雖然污染率有所下降，但外植體成活率也呈明顯下降的趨勢。這與李坤峰等［12］關(guān)于滅菌劑在進(jìn)行外植體表面滅菌時具有兩面性，在殺菌的同時對外植體也會造成一定的傷害的結(jié)論一致。使用0.1%HgCl2滅菌最佳的時間為8 min，滅菌效率為75.5%，使用2%NaClO滅菌的最佳時間為18 min，滅菌效率為51.9%。綜合比較，初代培養(yǎng)外植體最佳的滅菌方式是先用75%的乙醇滅菌30 s，然后用0.1%HgCl2滅菌8 min。

表1 2%NaClO對紅寶石冰外植體滅菌效果

表2 0.1%HgCl2對紅寶石冰外植體滅菌效果

2.2 不同培養(yǎng)基配方對紅寶石冰初代培養(yǎng)腋芽萌發(fā)的影響

不同培養(yǎng)基配方下紅寶石冰腋芽萌發(fā)情況統(tǒng)計(jì)見表3。從表3可以看出，不同培養(yǎng)基配方腋芽萌發(fā)率的差異較大，當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時，腋芽萌發(fā)率非常低，當(dāng)6-BA濃度高于1 mg/L時腋芽萌發(fā)率明顯提高，但當(dāng)6-BA濃度達(dá)到2.5 mg/L和NAA濃度達(dá)到0.3 mg/L時，則腋芽萌發(fā)率又呈明顯下降，雖然6-BA對腋芽的萌發(fā)起促進(jìn)作用，但并不是6-BA濃度越高腋芽萌發(fā)率越高，NAA和6-BA二者的比例影響腋芽萌發(fā)率。其中配方A4的萌發(fā)率明顯優(yōu)于其他配方，達(dá)到95.1%，因此初代培養(yǎng)最佳培養(yǎng)基配方為MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA。

表3 不同培養(yǎng)基配方下紅寶石冰腋芽萌發(fā)情況

2.3 不同培養(yǎng)基配方對紅寶石冰繼代增殖系數(shù)的影響

從表4可以看出，不同培養(yǎng)基配方下增殖系數(shù)差別較大，隨著6-BA濃度的增加，增殖系數(shù)也隨之增大，證明6-BA能有效地促進(jìn)不定芽增殖，當(dāng)NAA濃度超過0.3 mg/L時，雖然6-BA用量在增加，但是增殖系數(shù)卻反而降低，因此，NAA僅在一定濃度范圍內(nèi)對增殖率起促進(jìn)作用。根據(jù)觀察，當(dāng)NAA濃度過高時，在芽的基部容易產(chǎn)生愈傷組織，反而不利于不定芽的增殖。B3配方增殖系數(shù)較其他配方優(yōu)勢明顯，因此繼代增殖最佳培養(yǎng)基配方為MS+0.2 mg/L NAA+2.5 mg/L 6-BA。

表4 不同培養(yǎng)基配方下紅寶石冰繼代增殖情況

2.4 不同培養(yǎng)基配方對紅寶石冰試管苗生根的影響

紅寶石冰試管苗生根情況見表5。從表5可以看出，隨著培養(yǎng)基中NAA含量的增加，生根率也相應(yīng)提高，但當(dāng)NAA濃度達(dá)到0.3 mg/L時，生根率反而下降，試管苗基部產(chǎn)生了較大的愈傷組織塊，由此可見，培養(yǎng)基中低濃度的NAA對歐月試管苗生根能起到很好的促進(jìn)作用。在相同生長調(diào)節(jié)劑水平下，采用1/2 MS生根率高于MS，因此降低營養(yǎng)元素有利于生根。C4配方生根率比其他配方有明顯優(yōu)勢，因此試管苗生根階段最佳培養(yǎng)基配方為1/2 MS+0.2 mg/L NAA。

表5 不同培養(yǎng)基配方下紅寶石冰試管苗生根情況

2.5 不同栽培基質(zhì)對紅寶石冰移栽成活率的影響

不同栽培基質(zhì)對紅寶石冰移栽情況見表6。表6結(jié)果顯示，歐月紅寶石冰在D3珍珠巖+草炭+蛭石的混合基質(zhì)移栽成活率最高，在D1河沙中，試管苗容易出現(xiàn)爛根，成活率最低。成活的試管苗在不同基質(zhì)中的生長速度不同，在D3中生長速度最快，D2草炭+河沙次之，在D1中生長最慢，因此D3珍珠巖+草炭+蛭石（1∶1∶1）混合基質(zhì)最有利于試管苗的移栽成活。

表6 不同栽培基質(zhì)下紅寶石冰移栽成活情況

3 小結(jié)與討論

以歐月品種紅寶石冰為試驗(yàn)材料，取其半木質(zhì)化的中部莖段作為外植體，研究了2種滅菌劑、不同滅菌時間對外植體污染率和成活率的影響，不同生長調(diào)節(jié)劑水平對腋芽萌發(fā)、繼代增殖、試管苗生根的影響，3種不同移栽基質(zhì)對試管苗移栽成活率的影響，成功建立了組織培養(yǎng)技術(shù)體系，并篩選出了最佳的滅菌方法、組培各階段最佳的培養(yǎng)基配方以及移栽的最佳基質(zhì)。

結(jié)果表明，采用0.1% HgCl2滅菌8 min效果最佳，與袁婉君等［13］研究結(jié)果一致，該配方不僅能對外植體表面附著的微生物進(jìn)行有效殺滅，且對外植體材料損傷較小，少有外植體因滅菌發(fā)生褐變死亡。初代培養(yǎng)階段最佳培養(yǎng)基配方為MS+0.2 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA，腋芽萌發(fā)率為95.1%；繼代培養(yǎng)階段最佳培養(yǎng)基配方為MS+0.2 mg/L NAA+2.5 mg/L 6-BA，增殖系數(shù)為4.09；生根培養(yǎng)階段最佳培養(yǎng)基配方為1/2 MS+0.2 mg/L NAA，生根率為85.6%；移栽最佳基質(zhì)為珍珠巖+草炭+蛭石（1∶1∶1），移栽成活率為91.1%。目前，月季組織培養(yǎng)研究較多，但歐月組織培養(yǎng)育苗研究報(bào)道較少，本研究成功建立了歐月品種紅寶石冰的組織培養(yǎng)技術(shù)體系，為其大規(guī)模育苗提供了技術(shù)支撐，也為歐月其他品種的組織培養(yǎng)育苗技術(shù)的建立提供了參考。

外植體滅菌方面，目前已發(fā)表的相關(guān)研究大多只選用了一種滅菌劑［14-17］，本研究在歐月外植體滅菌方面選用了2%NaClO、0.1% HgCl22種滅菌劑進(jìn)行對比試驗(yàn)，擴(kuò)大了滅菌劑的選擇范圍。在確定最佳滅菌方案時，以滅菌效率為最終的評判指標(biāo)，即綜合比較污染率和成活率2個因素，更有利于篩選最佳的滅菌方案。

關(guān)于細(xì)胞分裂素對腋芽萌發(fā)的影響，本研究結(jié)果與葉貽勛等［18］的研究結(jié)果一致，即6-BA在一定濃度范圍內(nèi)能起到促進(jìn)作用，但當(dāng)6-BA用量過大時反而不利于腋芽萌發(fā)，李坤峰等［12］認(rèn)為6-BA用量過大還會導(dǎo)致試管苗玻璃化，本研究也發(fā)現(xiàn)在增殖階段當(dāng)6-BA達(dá)到3.0 mg/L時，確實(shí)有少數(shù)瓶苗出現(xiàn)了不同程度的玻璃化現(xiàn)象。關(guān)于腋芽著生的位置對叢生芽增殖的影響，鄭萍等［19］認(rèn)為枝條中間部位的最佳，本研究發(fā)現(xiàn)枝條不同部位的腋芽在誘導(dǎo)叢生芽時并無明顯差別，可能與外植體取材有關(guān)，研究材料為半木質(zhì)化帶芽莖段，陳蘭芬［8］也認(rèn)為最適宜作為微型月季的外植體材料為半木質(zhì)化帶芽莖。關(guān)于移栽基質(zhì)方面，本研究發(fā)現(xiàn)珍珠巖+草炭+蛭石（1∶1∶1）最有利于移栽成活，且在該基質(zhì)中組培苗生長最快，因此混合基質(zhì)有利于移栽，與劉子平等［14］研究結(jié)論一致。

關(guān)于培養(yǎng)條件，本研究在各個階段都采用同樣的溫度、光照度、光照時間等。腋芽萌發(fā)階段光照度的問題，有研究曾報(bào)道月季在萌芽階段適當(dāng)給予弱光培養(yǎng)會促進(jìn)月季腋芽萌發(fā)［20］，本研究并未采用先弱光、后正常光照度交替試驗(yàn)，下一步需要做光照對比試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件。關(guān)于生長調(diào)節(jié)劑選擇方面，本試驗(yàn)與前人的報(bào)道類似，腋芽增殖方式選擇6-BA和NAA進(jìn)行配比［1，21-24］，對KT、IAA等生長調(diào)節(jié)劑研究較少，下一步需要擴(kuò)大生長調(diào)節(jié)劑的選擇范圍，進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基配方。關(guān)于移栽成活后歐月組培苗的生長情況，本試驗(yàn)未做研究，需要進(jìn)一步進(jìn)行栽培試驗(yàn)，研究試管苗與常規(guī)嫁接苗在生長勢、觀賞性狀和抗性方面的差異性。