秦華珍，鐘 貴，陳俊其，何瑞坤，戴慶玲，柳俊輝

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530200）

高良姜、大高良姜、紅豆蔻均屬山姜屬（AlpiniaRoxb.）中藥，具有溫中散寒、溫胃止嘔等功效［1］，黃酮類成分為其主要活性成分之一，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗?jié)?、抗腫瘤、抗氧化等藥理活性［2-4］。胃潰瘍寒證屬于中醫(yī)學(xué)“胃痛”“胃脘痛”范疇，患者常見胃黏膜損傷，產(chǎn)生胃痛、脹氣等癥狀［5］。有研究［6，7］表明，山姜屬中藥對(duì)胃潰瘍寒證有藥效作用，其中黃酮類成分在體外表現(xiàn)出良好的抗氧化能力。為此，本研究通過制備3味山姜屬中藥黃酮類成分，以大鼠復(fù)制胃潰瘍寒證模型，測定胃組織中SOD活力及MDA、bFGF、PDGF含量，以探討3味山姜屬中藥黃酮類成分對(duì)胃潰瘍寒證大鼠胃黏膜修復(fù)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥材與藥品 高良姜、大高良姜、紅豆蔻均購自安國市冷背藥材有限公司，批號(hào)：20181018，產(chǎn)地：廣西；干姜提取物購自西安寶益豐生物科技有限公司，批號(hào)：20190912；95%乙醇（AR）購自西隴化工股份有限公司，批號(hào)：20190316；氫氧化鈉（AR）購自上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10492126；鹽酸（AR）購自西隴化工股份有限公司，批號(hào)：20190507；冰乙酸（AR）購自西隴化工股份有限公司，批號(hào)：20190507。

1.1.2 動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠，每只180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥物制備

1）造模藥物。冰知母水制備：取知母8 kg，加10倍量的純水浸泡1 h，煮沸后保持微沸1 h，過濾，再加8倍量水煎40 min，過濾，合并2次濾液，加熱濃縮至0.5 g/mL生藥濃度，靜置冷卻，分裝，保存于4℃冰箱備用。

冰乙酸溶液制備：取一定量的99.5%冰乙酸，加純水稀釋成15%冰乙酸溶液。

2）受試藥物制備。取適量高良姜、大高良姜、紅豆蔻中藥飲片分別粉碎成粗粉，依次加入40倍量95%、60%乙醇，每次回流提取4 h，過濾，合并所得濾液，減壓濃縮，回收乙醇至無醇味。將粗提物加適量的水混勻，煮沸，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至10～11，煮沸1 h，過濾，重復(fù)2次，合并濾液，濾液加入1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至1～2，水浴保溫30 min，放置24 h，析出沉淀，離心，棄去上清液，沉淀用去離子水抽洗2～3次，40℃真空干燥，得到3味山姜屬中藥黃酮提取物，備用，用時(shí)以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配成相應(yīng)濃度。

3）陽性藥物制備。以0.5%羧甲基纖維素鈉將干姜姜辣素配制成相應(yīng)濃度，備用。

1.2.2 藥效試驗(yàn)

1）分組與造模。取90只SPF級(jí)SD大鼠，隨機(jī)抽取10只大鼠作為空白組，其余大鼠進(jìn)行胃潰瘍寒證造模，每天早上灌服冰知母水（劑量10.44 g/kg，生藥濃度0.5 g/mL，給藥量2 mL/100 g，溫度4℃），下午灌服15%冰乙酸水溶液1 mL，每天1次，連續(xù)4 d［5］。末次造模結(jié)束后隨機(jī)分為空白組，模型組，陽性組，高良姜高、低劑量組，大高良姜高、低劑量組，紅豆蔻高、低劑量組，共9組。

2）給藥。造模結(jié)束后第2天開始給藥，空白組和模型組灌服0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液，陽性組灌服干姜提取物水溶液，受試藥物高、低劑量組分別灌服相應(yīng)樣品，根據(jù)前期研究［3］，以黃酮得率為基礎(chǔ)（高良姜黃酮得率為124.1g/kg、大高良姜黃酮得率為98.1 g/kg、紅豆蔻黃酮得率為118.5 g/kg），給藥劑量為臨床用量的4倍與16倍，給藥體積均為1 mL/100 g，每隔12 h給藥1次，共給藥4次。

3）大鼠胃組織SOD活力及MDA、bFGF、PDGF含量測定。處死大鼠，沿腹腔剪開，剝離胃，沿胃大彎剪開，用生理鹽水洗去胃內(nèi)食物殘?jiān)羧∥笣儾≡罴爸車M織約1 g，加入冰生理鹽水，制備10%組織勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液，備用，參照試劑盒方法測定大鼠胃組織SOD活力及MDA、bFGF、PDGF含量。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)比較采用方差分析；以P＜0.05認(rèn)為有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 3味山姜屬中藥黃酮類成分對(duì)胃潰瘍寒證大鼠胃組織MDA含量與SOD活力的影響

3味山姜屬中藥黃酮類成分對(duì)胃潰瘍寒證大鼠胃組織MDA含量與SOD活力的影響見表1。從表1可以看出，與空白組大鼠比較，模型組大鼠胃組織MDA含量極顯著增加（P＜0.01），SOD活力極顯著降低（P＜0.01）。與模型組大鼠比較，干姜姜辣素組、高良姜高和低劑量組、大高良姜高劑量組、紅豆蔻高劑量組大鼠胃組織MDA含量顯著或極顯著減少（P＜0.05或P＜0.01）；干姜姜辣素組、高良姜高劑量組、大高良姜高劑量組、紅豆蔻高劑量組大鼠胃組織SOD活力顯著或極顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。各給藥同劑量組間比較，各給藥組間MDA含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，紅豆蔻高劑量組與大高良姜、高良姜高劑量組間SOD活力差異極顯著（P＜0.01）。

表1 3味山姜屬中藥黃酮類成分對(duì)胃潰瘍寒證大鼠胃組織MDA含量與SOD活力的影響（，n=10）

表1 3味山姜屬中藥黃酮類成分對(duì)胃潰瘍寒證大鼠胃組織MDA含量與SOD活力的影響（，n=10）

注：與空白組比較，“Δ Δ ”表示差異極顯著（P＜0.01）；與模型組比較，“*”表示差異顯著（P＜0.05），“**”表示差異極顯著（P＜0.01）；與高良姜組比較，“▲”表示差異顯著（P＜0.05），“▲▲”表示差異極顯著（P＜0.01）；與大高良姜組比較，“○”表示差異顯著（P＜0.05），“○○”表示差異極顯著（P＜0.01）；與紅豆蔻組比較，“●”表示差異顯著（P＜0.05），“●●”表示差異極顯著（P＜0.01）。下同

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組干姜姜辣素組高良姜高劑量組高良姜低劑量組大高良姜高劑量組大高良姜低劑量組紅豆蔻高劑量組紅豆蔻低劑量組劑量g/kg--0.045 1.072 0.268 0.848 0.212 1.024 0.256 MDA含量nmol/g 38.28±5.60 67.04±6.63ΔΔ 46.34±5.64**49.64±4.55**●●59.26±3.98*50.80±4.30**●●61.67±3.28 51.15±4.17**▲▲○○62.71±5.44 SOD活力U/mgprot 241.25±8.08 161.21±23.02ΔΔ 232.11±11.15**217.15±10.64**○○●●177.46±4.72 220.24±8.36**▲▲●●170.90±1.77 202.18±12.34**▲▲○○182.08±2.52*

2.2 3味山姜屬中藥黃酮類成分對(duì)胃潰瘍寒證大鼠胃組織bFGF、PDGF含量的影響

3味山姜屬中藥黃酮類成分對(duì)胃潰瘍寒證大鼠胃組織bFGF、PDGF含量的影響見表2。從表2可以看出，與空白組大鼠比較，模型組大鼠胃組織bFGF、PDGF含量極顯著增加（P＜0.01）。與模型組大鼠比較，干姜姜辣素組、高良姜高和低劑量組、大高良姜高劑量組、紅豆蔻高劑量組大鼠胃組織bFGF含量極顯著增加（P＜0.01）；干姜姜辣素組、高良姜高劑量組、大高良姜高和低劑量組、紅豆蔻高和低劑量組大鼠胃組織PDGF含量顯著或極顯著增加（P＜0.05或P＜0.01）。各給藥同劑量組間比較，高良姜高劑量組與紅豆蔻高劑量組間bFGF含量有極顯著差異（P＜0.01），紅豆蔻低劑量組與高良姜低劑量組、大高良姜低劑量組間bFGF含量有極顯著差異（P＜0.01）；高良姜高劑量組與大高良姜高劑量組間PDGF含量有顯著差異（P＜0.05）。

表2 3味山姜屬中藥黃酮類成分對(duì)胃潰瘍寒證大鼠胃組織bFGF、PDGF含量的影響（，n=10）

表2 3味山姜屬中藥黃酮類成分對(duì)胃潰瘍寒證大鼠胃組織bFGF、PDGF含量的影響（，n=10）

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組干姜姜辣素組高良姜高劑量組高良姜低劑量組大高良姜高劑量組大高良姜低劑量組紅豆蔻高劑量組紅豆蔻低劑量組劑量g/kg--0.045 1.072 0.268 0.848 0.212 1.024 0.256 bFGF pg/g 132.82±16.20 193.79±16.68ΔΔ 269.76±28.97**246.62±19.16**●●219.37±13.55**●●234.62±16.70**208.91±15.58●●218.17±19.80*▲▲180.98±15.58▲▲○○PDGF ng/g 385.79±41.12 514.32±62.50ΔΔ 711.60±70.67**668.27±57.10**○557.79±36.94 602.44±61.19**▲558.12±46.19*607.74±49.43**584.25±48.71*

3 小結(jié)與討論

胃潰瘍的產(chǎn)生過程與氧自由基密切相關(guān)，氧自由基與膜內(nèi)不飽和脂肪酸結(jié)合形成多種脂質(zhì)過氧化物（LPO），影響細(xì)胞膜流動(dòng)性與通透性，破壞膜上酶與受體功能，致使大量Ca2+內(nèi)流，線粒體與溶酶體破壞，細(xì)胞死亡，同時(shí)，氧自由基還能與含巰基的蛋白結(jié)合，使蛋白變性失活，破壞酶活性，或是破壞上皮間質(zhì)中的透明質(zhì)酸和膠原纖維網(wǎng)，促使黏膜損傷［8］。氧自由基再與細(xì)胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸結(jié)合形成LPO的終末代謝產(chǎn)物為丙二醛（MDA），其含量直接反映了機(jī)體脂質(zhì)過氧化速率與強(qiáng)度，也可以間接反映組織氧化損傷的程度［9］。同時(shí)有學(xué)者提出，MDA也是胃黏膜攻擊因子之一，具有細(xì)胞毒性，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等大分子交合，致使細(xì)胞代謝紊亂，失去活性，造成細(xì)胞死亡［10］。超氧化物歧化酶（SOD）在生物體內(nèi)的自我保護(hù)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)中具有極為重要的作用，是生物體內(nèi)氧自由基清除的第一道防線［11］。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，SOD在胃黏膜的自我保護(hù)功能中發(fā)揮重要作用，SOD能夠清除胃黏膜上的氧自由基，減少氧自由基對(duì)胃黏膜的損傷，維持胃黏膜的防御功能。在胃潰瘍形成的過程中，會(huì)產(chǎn)生一系列炎癥反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生大量的氧自由基，SOD活力下降，胃黏膜對(duì)氧自由基清除能力減弱，胃黏膜受到大量氧自由基攻擊，形成過氧化損傷，導(dǎo)致潰瘍形成［12］。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，胃潰瘍寒證模型大鼠胃組織中MDA含量顯著增加，SOD活力顯著降低，表明其胃組織抗氧化能力下降，氧自由基對(duì)黏膜攻擊作用增強(qiáng)，胃組織過氧化損傷加劇。給藥治療后，3味山姜屬中藥黃酮類成分高劑量組及高良姜黃酮類成分低劑量組大鼠胃組織中MDA含量顯著減少，高劑量組大鼠胃組織SOD活力顯著增加，表明3味山姜屬中藥黃酮類成分能降低MDA含量，提高SOD活力，推測其能通過提高胃黏膜抗氧化能力，消除氧自由基，降低胃黏膜組織過氧化損傷的作用，達(dá)到保護(hù)胃黏膜、促進(jìn)潰瘍面愈合的作用。

生長因子是一類由多種細(xì)胞分泌，作用于特定的靶細(xì)胞，能夠特異、高親和與細(xì)胞膜受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長與其他細(xì)胞功能的多肽類物質(zhì)。bFGF是人體內(nèi)存在的一種多功能細(xì)胞生長因子，廣泛存在于人體中，主要在損傷組織及細(xì)胞周圍大量分泌，在創(chuàng)傷面愈合的過程中發(fā)揮極其重要的作用，能夠特異性識(shí)別損傷細(xì)胞及組織，推動(dòng)損傷細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管新生，修復(fù)損傷組織［13］。PDGF是貯存于血小板α顆粒中的一種堿性蛋白質(zhì)，具有趨化活性，能夠促進(jìn)創(chuàng)傷面血小板凝聚，起到止血作用，同時(shí)能夠促進(jìn)上皮細(xì)胞分裂，促進(jìn)血管再生，刺激前列腺素生成，擴(kuò)張血管。胃潰瘍瘡面的形成刺激bFGF及PDGF等生長因子的大量分泌，推動(dòng)胃黏膜細(xì)胞增值，修復(fù)受損胃黏膜組織與屏障［14］。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，胃潰瘍寒證模型組大鼠的胃組織bFGF、PDGF含量顯著增加，表明其胃黏膜屏障受到破壞，胃黏膜屏障內(nèi)外離子失衡，胃黏膜細(xì)胞受損凋亡，胃組織受到胃酸、胃蛋白酶等攻擊因子直接影響，產(chǎn)生組織損傷，刺激機(jī)體分泌bFGF及PDGF，修復(fù)損傷組織。給藥治療后，3味山姜屬中藥黃酮類成分高劑量組及大高良姜黃酮類成分低劑量組大鼠胃組織bFGF含量顯著增加，高劑量組及大高良姜、紅豆蔻黃酮類成分低劑量組大鼠胃組織PDGF含量顯著增加，表明3味山姜屬中藥黃酮類成分能夠促進(jìn)bFGF及PDGF的分泌，推測其通過加快胃黏膜細(xì)胞的增殖，加快損傷組織及血管的修復(fù)，減少創(chuàng)傷面出血，促進(jìn)胃黏膜上皮細(xì)胞分裂，恢復(fù)胃黏膜屏障的保護(hù)作用。

試驗(yàn)結(jié)果表明，3味山姜屬中藥黃酮類成分能夠通過降低MDA含量，增加SOD活力，提高bFGF、PDGF含量，增強(qiáng)胃黏膜抗氧化能力，降低胃黏膜過氧化損傷，促進(jìn)損傷部位的上皮細(xì)胞增殖，修復(fù)損傷組織，從而發(fā)揮胃黏膜修復(fù)作用。