劉喬斐，周自云

（1.安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

柴胡為傘形科（Umbelliferae）柴胡屬（Bupleurum）多年生草本植物，主要以干燥的根入藥，是中國(guó)和亞洲諸多國(guó)家常用的大宗中藥材?，F(xiàn)有研究表明一年生柴胡根中皂苷含量比二年生的高，某些產(chǎn)區(qū)也可當(dāng)年入藥［1］。柴胡味苦、辛，性微寒，具退熱解表、升舉陽(yáng)氣、疏肝解郁之功效，多用于治療感冒發(fā)熱、頭痛目眩、月經(jīng)不調(diào)、子宮下垂等癥狀［2］。柴胡皂苷是柴胡最主要的藥效成分，其中以柴胡皂苷a、d的含量較高、活性較強(qiáng)［3］，被廣泛用于臨床。

隨著全球氣候干暖化的持續(xù)加劇，水分已成為世界干旱半干旱地區(qū)植物生長(zhǎng)發(fā)育的首要限制因子之一。中國(guó)多數(shù)地區(qū)降水年際分布不均，藥用植物在自然條件下生長(zhǎng)，難免會(huì)面臨水分不足（干旱脅迫）和水分過(guò)多（澇漬）等不同生長(zhǎng)環(huán)境［4］。水分過(guò)少或過(guò)多均可引起植物細(xì)胞生理脫水或缺氧，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化，打破滲透平衡，影響次生代謝產(chǎn)物的合成，進(jìn)而影響藥用植物的生長(zhǎng)發(fā)育和藥材質(zhì)量［5］。黃璐琦等［6］研究發(fā)現(xiàn)水分脅迫能促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物的合成，更有利于道地藥材的形成。次生代謝產(chǎn)物的積累是道地藥材研究的熱點(diǎn)之一，也是中藥材生產(chǎn)的目的所在［7］。近些年，中藥材在生長(zhǎng)過(guò)程中頻繁遭受干旱的危害，而研究藥用植物對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答機(jī)制會(huì)為解決中藥材問(wèn)題提供一個(gè)嶄新的途徑。

柴胡耐寒且耐旱，忌高溫和澇洼積水，主產(chǎn)于甘肅、山西、河北、陜西等干旱半干旱地區(qū)［8］。柴胡栽培過(guò)程中常遇到干旱或者澇漬的情況，生長(zhǎng)發(fā)育與水分密切相關(guān)［9］；水分過(guò)多會(huì)導(dǎo)致根系多分布于淺層，容易爛根，誘發(fā)疾病；水分過(guò)少抑制柴胡生長(zhǎng)，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)［10］。因此，探索柴胡生長(zhǎng)過(guò)程的需水規(guī)律對(duì)柴胡提質(zhì)增效人工栽培技術(shù)具有重要的促進(jìn)作用。本研究針對(duì)中國(guó)柴胡主產(chǎn)區(qū)土壤水分狀況，采用盆栽模擬控水條件，通過(guò)對(duì)柴胡根冠比、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和柴胡皂苷的測(cè)定，從生理角度開(kāi)展柴胡水分逆境研究，旨在為柴胡種植中科學(xué)的水分管理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用二年生北柴胡（Bupleurum chinenseDC.），在陜西省寶雞市陳倉(cāng)區(qū)拓石鎮(zhèn)孟家塬村陜西博仁藥業(yè)柴胡基地開(kāi)展盆栽試驗(yàn)。選用上口徑25 cm、高20 cm的塑料花盆，每盆裝土2.5 kg，供試土壤為沙壤土，其田間持水量為20.42%。于2019年4月1日將柴胡幼苗移栽入塑料盆中，每盆3穴，每穴1株。移栽后正常澆水，緩苗7 d后進(jìn)行水分脅迫處理。為避免柴胡根系伸出土壤、保持盆內(nèi)水分恒定，在每個(gè)塑料盆下面墊一張塑料紙。

試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)置4個(gè)水分梯度：田間持水量的30%、50%、70%和90%，分別對(duì)應(yīng)土壤含水量的6.13%、10.21%、14.29%和18.56%，其中以田間持水量的70%作為對(duì)照（CK）。各水分梯度分別對(duì)應(yīng)柴胡幼苗4種生長(zhǎng)條件：重度干旱脅迫、輕度干旱脅迫、適宜水分、澇漬。4月7日開(kāi)始采用稱(chēng)重法進(jìn)行水分控制?？厮陂g每天下午18：00定時(shí)稱(chēng)盆重量，以盆質(zhì)量的減少量為柴胡的當(dāng)日耗水量，并加水補(bǔ)充至設(shè)定土壤含水量，并設(shè)置對(duì)照盆（裸土），以扣除土面蒸發(fā)。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，稱(chēng)重控水一個(gè)月后采集樣品測(cè)定各指標(biāo)。

1.2 主要儀器與試劑

Waters高效液相系統(tǒng)配有：Waters1525二元泵，Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器，Waters sun-fire C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），Empower 2色譜分析軟件；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；3K15型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（SIGMA）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（PerkinElmer Lambda 35）。柴胡皂苷對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院（柴胡皂苷a批號(hào)110777-201309，柴胡皂苷d批號(hào)110778-201409），乙腈為色譜純（美國(guó)Tedia公司），氨水、甲醇等均為分析純。

1.3 測(cè)試項(xiàng)目與方法

1.3.1 柴胡根冠比和相對(duì)含水量的測(cè)定 從每組處理中隨機(jī)選取3株長(zhǎng)勢(shì)一致的柴胡植株，分別稱(chēng)量地上鮮重、地下鮮重；迅速將樣品放入鋁盒中浸水直至樣品飽和重量近似，稱(chēng)量地上飽和鮮重、地下飽和鮮重；之后將樣品放入105℃烘箱殺青30 min后80℃烘干至恒重，稱(chēng)量地上干重、地下干重；根據(jù)上述指標(biāo)計(jì)算柴胡的根冠比（Root/top，R/T）和相對(duì)含水量（Relative water content，RWC）［11］。

水分脅迫結(jié)束后，采用NMI20-015V-I核磁共振成像分析儀（上海紐邁電子科技有限公司）測(cè)定柴胡葉片水分子動(dòng)力學(xué)特征。測(cè)定時(shí)磁體箱溫度設(shè)定為32℃，磁感應(yīng)強(qiáng)度為0.5 T，1H核磁共振主頻率為23.04 MHz；核磁共振T2弛豫譜檢測(cè)采用（Carr Purcell Meiboom Gill）CPMG脈沖序列，參數(shù)設(shè)定和測(cè)定方法參考牟紅梅等［12］的方法，根據(jù)信號(hào)值計(jì)算樣品中自由水、結(jié)合水和吸附水的百分比含量。

1.3.2 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的測(cè)定 參考高俊鳳［11］的方法，可溶性糖含量（Soluble sugar）的測(cè)定采用蒽酮比色法；可溶性蛋白質(zhì)含量（Soluble protein）的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法；脯氨酸含量（Proline）的測(cè)定采用酸性茚三酮比色法；丙二醛含量（Malonaldehyde）的測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法。

1.3.3 HPLC測(cè)定柴胡根中皂苷a、d的含量 參考張宇等［9］的方法，取干燥至恒重的柴胡根研磨成粉末，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.2 g于10 mL離心管中，加含5%濃氨水的甲醇溶液8 mL，密閉，超聲提取30 min，取出，濾過(guò)，并用10 mL甲醇分2次洗滌離心管和殘?jiān)? 000 r/min離心10 min，取上清，洗液和濾液合并，回收溶劑至干。殘?jiān)眠m量甲醇溶解，并定量轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，定容至刻度。上樣前用0.45 μm濾膜濾過(guò)，作為樣品溶液。HPLC條件參照2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》［13］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Empower 2色譜分析軟件導(dǎo)出柴胡皂苷a、d的峰面積，分別帶入回歸方程Y=5 853 177.018 2X＋144 215.517 1，R2=0.999；Y=6 601 254.089 9X＋30 563.820 8，R2=0.999，計(jì) 算 柴 胡 皂 苷a、d的 含量［14］。采用核磁儀器自帶的反演軟件T_InvfitGeneral對(duì)CPMG回波的峰值點(diǎn)進(jìn)行Laplace反演分析，獲得核磁共振T2弛豫譜。柴胡幼苗核磁共振T2弛豫譜中不同相態(tài)水分峰面積即T2弛豫譜幅值的提取采用Matlab編程處理。數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用LSD和Duncan多重比較法進(jìn)行顯著差異性檢驗(yàn)；采用SigmaPlot 12.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分脅迫對(duì)柴胡幼苗根冠比和水分的影響

由圖1可知，水分脅迫對(duì)柴胡植株根冠比（R/T）的影響顯著。30%田間持水量、90%田間持水量下柴胡R/T分別較CK顯著降低了21.60%和37.30%，50%田間持水量下柴胡R/T反而較CK顯著提高了23.76%。各處理下柴胡R/T呈50%田間持水量＞CK＞30%田間持水量、90%田間持水量的趨勢(shì)，說(shuō)明土壤水分過(guò)少或過(guò)多均不利于柴胡根冠比的提高。

圖1 水分脅迫對(duì)柴胡根冠比的影響

由圖2可知，水分脅迫對(duì)柴胡葉片相對(duì)含水量（RWC）的影響顯著。葉片相對(duì)含水量反映植物在遭受干旱脅迫后的水分虧缺狀況，與CK相比，水分脅迫下柴胡葉片RWC有所降低，30%田間持水量下柴胡葉片RWC較CK顯著降低了3.26%，50%田間持水量和90%田間持水量下柴胡葉片RWC稍有降低，但與CK差異不顯著。

圖2 水分脅迫對(duì)柴胡葉片相對(duì)含水量的影響

由圖3可知，水分脅迫對(duì)柴胡葉片自由水與結(jié)合水的比值（Free water/bound water，F(xiàn)W/BW）的影響顯著。隨著田間持水量的降低，F(xiàn)W/BW逐漸降低。30%田間持水量、50%田間持水量下柴胡葉片F(xiàn)W/BW分別較CK顯著降低了47.36%和29.47%，90%田間持水量下柴胡葉片F(xiàn)W/BW較CK顯著提高了57.32%。說(shuō)明隨著田間持水量的降低，柴胡葉片自由水含量逐漸降低，結(jié)合水含量相對(duì)增加，柴胡細(xì)胞代謝逐漸減慢。

圖3 水分脅迫對(duì)柴胡葉片F(xiàn)W/BW的影響

2.2 水分脅迫對(duì)柴胡體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖4可知，水分脅迫對(duì)柴胡可溶性糖含量的影響顯著。水分脅迫顯著提高柴胡可溶性糖含量。30%田間持水量、50%田間持水量和90%田間持水量下柴胡可溶性糖含量分別較CK顯著提高了149.78%、40.96%和30.95%。50%田間持水量下柴胡可溶性糖含量與90%田間持水量下柴胡可溶性糖含量的差異不顯著。各處理下柴胡可溶性糖含量呈30%田間持水量＞50%田間持水量、90%田間持水量＞CK的趨勢(shì)，表明水分脅迫有利于提高柴胡體內(nèi)可溶性糖含量。

圖4 水分脅迫對(duì)柴胡可溶性糖含量的影響

由圖5可知，水分脅迫對(duì)柴胡可溶性蛋白質(zhì)含量的影響顯著。隨著田間持水量的降低，柴胡可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸減少。30%田間持水量、50%田間持水量下柴胡可溶性蛋白質(zhì)含量分別較CK顯著降低了45.07%和25.68%，90%田間持水量下柴胡可溶性蛋白質(zhì)含量較CK顯著提高了39.79%。各處理下柴胡可溶性蛋白質(zhì)含量呈30%田間持水量＜50%田間持水量＜CK＜90%田間持水量的趨勢(shì)。

圖5 水分脅迫對(duì)柴胡可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由圖6可知，水分脅迫對(duì)柴胡脯氨酸含量的影響顯著。30%田間持水量、50%田間持水量下柴胡脯氨酸含量分別較CK顯著增加了176.10%和49.10%，90%田間持水量下柴胡脯氨酸含量較CK有所提高，但差異不顯著。各處理下柴胡脯氨酸含量呈30%田間持水量＞50%田間持水量＞90%田間持水量＞CK的趨勢(shì)，表明水分脅迫有利于提高柴胡體內(nèi)脯氨酸含量。

圖6 水分脅迫對(duì)柴胡脯氨酸含量的影響

2.3 水分脅迫對(duì)柴胡膜脂過(guò)氧化作用的影響

丙二醛通常作為膜脂過(guò)氧化指標(biāo)，可反映植物受傷害程度。由圖7可知，水分脅迫對(duì)柴胡丙二醛含量的影響顯著。與CK相比，30%田間持水量下柴胡丙二醛含量顯著提高了89.56%，50%田間持水量、90%田間持水量下柴胡丙二醛含量與CK無(wú)顯著差異。各處理下柴胡丙二醛含量呈30%田間持水量＞50%田間持水量、90%田間持水量、CK的趨勢(shì)，表明重度干旱脅迫加劇了柴胡細(xì)胞膜脂過(guò)氧化作用。

圖7水分脅迫對(duì)柴胡丙二醛含量的影響

2.4 水分脅迫對(duì)柴胡皂苷的影響

圖8 為水分脅迫對(duì)柴胡皂苷a含量的影響。由圖8可知，50%田間持水量下柴胡皂苷a含量較CK顯著增加了28.67%，30%田間持水量、90%田間持水量下柴胡皂苷a含量與CK差異不顯著。各處理下柴胡皂苷a含量呈50%田間持水量＞30%田間持水量、CK、90%田間持水量的趨勢(shì)，說(shuō)明輕度干旱脅迫有利于柴胡皂苷a的積累。

圖8 水分脅迫對(duì)柴胡皂苷a含量的影響

圖9為干旱脅迫對(duì)柴胡皂苷d含量的影響。由圖9可知，隨著田間持水量的降低，柴胡皂苷d含量逐漸增加。與CK相比，30%田間持水量下柴胡皂苷d含量顯著增加了24.78%，90%田間持水量下柴胡皂苷d含量顯著降低了14.98%，50%田間持水量下柴胡皂苷d含量與CK差異不顯著。各處理下柴胡皂苷d含量呈30%田間持水量＞50%田間持水量、CK＞90%田間持水量的趨勢(shì)，表明重度干旱脅迫有利于柴胡皂苷d的積累。

圖9水分脅迫對(duì)柴胡皂苷d含量的影響

圖10 為水分脅迫對(duì)柴胡皂苷（a＋d，Saikosaponins）含量的影響。由圖10可知，干旱脅迫顯著提高柴胡皂苷的含量。30%田間持水量、50%田間持水量下柴胡皂苷含量分別較CK顯著提高了17.36%和19.75%，90%田間持水量下柴胡皂苷含量與CK無(wú)顯著差異。各處理下柴胡皂苷含量呈30%田間持水量、50%田間持水量＞CK、90%田間持水量的趨勢(shì)。

圖10 水分脅迫對(duì)柴胡皂苷含量的影響

3 討論

植物在應(yīng)對(duì)干旱脅迫時(shí)會(huì)啟動(dòng)多種生理反應(yīng)來(lái)增強(qiáng)自身的抗逆性能［15］。研究表明，水分脅迫時(shí)，植物細(xì)胞會(huì)積累可溶性糖、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來(lái)提高細(xì)胞液濃度，降低滲透勢(shì)，防止水分流失［16］。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下柴胡幼苗的可溶性糖和脯氨酸含量均顯著提高，且隨著干旱脅迫程度的增強(qiáng)，可溶性糖和脯氨酸含量不斷增加，而可溶性蛋白質(zhì)含量卻隨著土壤含水量的減少而減少，這與前人的研究結(jié)果一致［17］。干旱時(shí)植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)分解加速，合成減少，與之相適應(yīng)的是植物體內(nèi)游離氨基酸，特別是脯氨酸含量大幅度增加。脯氨酸作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在含水量很低的細(xì)胞內(nèi)通過(guò)與蛋白質(zhì)相互作用來(lái)增強(qiáng)蛋白質(zhì)的水合作用，也可與胞內(nèi)一些化合物形成類(lèi)似親水膠體的聚合物，防止水分散失［16］?？扇苄蕴窃龆嘤欣诩?xì)胞從外界水勢(shì)高的地方吸水，保護(hù)細(xì)胞不受干旱的損傷，有利于提高柴胡幼苗的抗旱性能。植物在遭受干旱和澇漬脅迫時(shí)，植物體內(nèi)氧代謝失調(diào)，保護(hù)酶防御系統(tǒng)遭到破壞，大量的活性氧在植物體內(nèi)積累，引起生物膜脂的脫酯化和膜脂的過(guò)氧化，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物如丙二醛累積［18］。本研究表明，重度干旱脅迫下柴胡體內(nèi)丙二醛含量顯著增加，而輕度干旱脅迫和澇漬脅迫下柴胡丙二醛含量與對(duì)照均無(wú)顯著差異。丙二醛含量的升高表明重度干旱脅迫造成柴胡體內(nèi)酶保護(hù)反應(yīng)和自由基生成的動(dòng)態(tài)平衡失衡，進(jìn)而導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化程度升高。

土壤水分對(duì)植物根系生長(zhǎng)發(fā)育具有直接調(diào)控作用。根類(lèi)中藥材作為一類(lèi)特殊的植物，其生長(zhǎng)和藥效成分的合成積累與環(huán)境水分密切相關(guān)［19］。適宜水分條件下，藥用植物根系生長(zhǎng)良好，構(gòu)型合理，產(chǎn)量高，但不利于藥效成分的合成［20］。研究表明，適度干旱脅迫可以調(diào)節(jié)植物地上、地下生物量的分配，促進(jìn)根系生長(zhǎng)，增加根冠比［21］，增強(qiáng)植物體內(nèi)次生代謝，促進(jìn)藥效成分的合成與積累［22］，從而提高中藥材的產(chǎn)量與品質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，輕度干旱脅迫下柴胡根冠比顯著增大，而重度干旱脅迫和澇漬下柴胡根冠比均顯著減小，說(shuō)明柴胡可以通過(guò)調(diào)節(jié)自身的生長(zhǎng)來(lái)應(yīng)對(duì)水分脅迫，土壤水分嚴(yán)重虧缺和過(guò)多都不利于柴胡根系建成，而輕度干旱脅迫可以促進(jìn)柴胡根系生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)量的提高。隨著水分虧缺，植株含水量逐漸減少，特別是自由水與結(jié)合水的相對(duì)比值減小，植物組織自由水相對(duì)含量降低，細(xì)胞代謝減慢，結(jié)合水相對(duì)含量增加，抗逆性能增強(qiáng)［16］。干旱脅迫顯著降低柴胡幼苗的RWC和FW/BW，其中重度干旱脅迫下柴胡幼苗的RWC和FW/BW最低，這與前人的研究結(jié)果一致［23］。而90%田間持水量下柴胡幼苗的FW/BW反而最大，這一結(jié)果正解釋了植物體內(nèi)自由水含量受環(huán)境影響較大，可參與代謝活動(dòng)，而結(jié)合水含量較為穩(wěn)定。

許多研究表明，干旱脅迫可以增加植物次生代謝產(chǎn)物的生成和積累。曾智等［24］研究發(fā)現(xiàn)，適度干旱和適量鉀肥有利于厚樸中主要藥效成分厚樸酚與和厚樸酚的積累。孔德鑫等［25］研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)母珊得{迫有利于2種雞骨草中皂苷含量的積累。鄧婉月等［26］研究發(fā)現(xiàn)，用濃度為50～100 g/L的PEG-6000溶液模擬輕度和中度干旱脅迫，有利于丹參中酚酸和丹參酮類(lèi)活性成分的積累，為丹參生產(chǎn)中科學(xué)控水、提質(zhì)增效提供理論參考。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫可顯著促進(jìn)柴胡皂苷的積累。輕度干旱脅迫對(duì)柴胡皂苷a的積累影響顯著，而重度干旱脅迫對(duì)柴胡皂苷d的積累影響顯著，而土壤水分過(guò)多時(shí)2種皂苷含量都顯著降低。這主要是由于水分適宜或過(guò)多時(shí)，柴胡體內(nèi)主要通過(guò)初生代謝合成糖、蛋白質(zhì)、核酸等維持生命活動(dòng)的必需物質(zhì)，只產(chǎn)生少量的次生代謝物滿(mǎn)足日常需要；當(dāng)環(huán)境水分虧缺至干旱脅迫時(shí)，柴胡幼苗生長(zhǎng)受到抑制，同化產(chǎn)物減少，次生代謝增強(qiáng)，次生代謝產(chǎn)物積累用于抵御逆境脅迫［9］；但若干旱脅迫持續(xù)加劇，柴胡自身生長(zhǎng)受阻，次生代謝產(chǎn)物合成最終也會(huì)減少。類(lèi)似的結(jié)果前人研究也有報(bào)道，梁建萍等［27］研究發(fā)現(xiàn)，輕度水分脅迫能有效啟動(dòng)黃芪體內(nèi)次生代謝，通過(guò)降低地上部分的生長(zhǎng)，將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)優(yōu)先運(yùn)往根部，促進(jìn)根產(chǎn)量及藥材質(zhì)量的提高；胡婭婷等［19］研究發(fā)現(xiàn)，輕度干旱脅迫能夠有效促進(jìn)黃芪幼苗生長(zhǎng)并提高黃芪藥材品質(zhì)，但重度干旱脅迫超過(guò)了黃芪所能承受的抗逆能力，次生代謝物含量降低。

4 小結(jié)

輕度干旱脅迫顯著增加柴胡根冠比、柴胡皂苷a和總皂苷的含量，重度干旱脅迫顯著增加柴胡體內(nèi)可溶性糖、脯氨酸、丙二醛、柴胡皂苷d和總皂苷的含量，可溶性蛋白質(zhì)和FW/BW隨著干旱脅迫程度的增加逐漸減小。綜上，柴胡具有一定的耐旱性；干旱脅迫有利于柴胡生物量向地下部轉(zhuǎn)移，可以促進(jìn)柴胡有效成分的積累，而土壤水分過(guò)多不利于柴胡根系生長(zhǎng)和柴胡皂苷的積累。因此，在人工栽培柴胡時(shí)，要避免低洼易積水地塊，采用科學(xué)合理的控水方式，在保障植物正常生長(zhǎng)時(shí)也能促進(jìn)柴胡皂苷等次生代謝產(chǎn)物的積累，提高柴胡的產(chǎn)量和品質(zhì)。