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        N-糖蛋白去糖基化酶(PNGase)的研究進展*

        2022-09-22 02:41:38陳妍雯袁舒穎劉瑞杰張紹興鄒琳蘆鑫榮孔維溧陳力孫桂芹
        關(guān)鍵詞:糖鏈原核糖蛋白

        陳妍雯 袁舒穎 劉瑞杰 張紹興 鄒琳 蘆鑫榮 孔維溧 陳力** 孫桂芹**

        (1)浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與信息工程學(xué)院,杭州 310053;2)復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系,醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)教育部/衛(wèi)生健康委員會重點實驗室,上海 200032)

        N-糖蛋白去糖基化酶(peptide∶N-glycanase,簡寫為PNGase),又稱為N-糖肽酶、N-糖酰胺酶、肽-N-糖苷酶,廣泛分布于原核和真核生物中,可以水解多肽上天冬酰胺(Asn)連接的寡糖,并釋放出完整寡糖鏈[1]。不同物種來源的PNGase,基因長度及氨基酸序列不同,生物學(xué)功能上也有一定差異性。PNGase參與秀麗線蟲的生殖,并與果蠅生長、小鼠胚胎發(fā)育有關(guān)[2-3]。人體內(nèi)的PNGase NGLY1(N-glycanase 1)缺陷,會引起罕見遺傳性疾病先天性去糖基化障礙,患者出現(xiàn)發(fā)育遲緩、運動障礙等癥狀[4];對出現(xiàn)運動障礙的Ngly1缺陷小鼠模型補充其表達,模型小鼠的運動功能得到一定恢復(fù)[5]。NGLY1在人黑色素瘤細胞中高表達,下調(diào)黑色素瘤細胞NGLY1,腫瘤細胞生長受到抑制[6]。上述研究結(jié)果提示,PNGase可能在生物生長發(fā)育過程中有重要意義。本文闡述了PNGase在不同物種中的分布、酶的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能,為PNGase的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究提供依據(jù)。

        1 PNGase的分布

        PNGase在真核生物(真菌、線蟲、哺乳動物等)和原核生物(細菌)中均有分布,本文對已報道的不同物種來源PNGase進行統(tǒng)計(表1)。

        1.1 真核生物的PNGase

        PNGase在真核生物廣泛存在,包括真菌、植物、線蟲、哺乳動物等[7-10]。1977年,Takahashi等[9]在杏仁(Almond)中首次發(fā)現(xiàn)PNGase,命名為糖胺酶A,即PNGase A。之后陸續(xù)在大豆[11]、水 稻[12]、擬 南 芥[13]和 番 茄[14]等 植 物 中 發(fā) 現(xiàn)PNGase。1997年,真菌塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)中 發(fā) 現(xiàn)PNGase,命 名 為PNGase At[7]。Suzuki等[15]在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)第二個真菌PNGase YPNG1。裂殖酵母中也發(fā)現(xiàn)有SpPNGase[16]。

        無脊椎動物秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅(線蟲和果蠅的壽命短、繁殖速度快)中發(fā)現(xiàn)的PNGase[17-18],多用于PNGase體內(nèi)功能研究。1991年Seko等[19]在脊椎動物青鳉魚(Medaka fish)的卵中發(fā)現(xiàn)PNGase。1993年,小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)Ngly1、人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)NGLY1(N-glycanase 1,又稱為Nglycanase,PNGase)[10];后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)人NGLY1的缺陷會導(dǎo)致遺傳性疾病NGLY1型先天性去糖基化 障 礙(NGLY1-related congenital disorder of deglycosylation,NGLY1-CDDG)[4]。

        1.2 原核生物的PNGase

        目前,原核生物的PNGase僅在腦膜炎敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica,縮寫為EM;又稱為腦膜炎膿毒黃桿菌,F(xiàn)lavobacteriummeningosepticum)中發(fā)現(xiàn),共兩種PNGase,分別命名為PNGase F和PNGase F-Ⅱ。

        1984年,Plummer等[20]在EM中發(fā)現(xiàn)了第一個細菌來源的PNGase并命名為PNGase F,PNGase F能完整水解并釋放糖蛋白上的N-糖鏈,但不能作用于含有α-1,3核心巖藻糖基化的N-糖蛋白。2015年,孫桂芹等[3]在EM中發(fā)現(xiàn)了第二個細菌來源的PNGase F-Ⅱ,PNGase F-Ⅱ在具有PNGase F功能的同時,還可水解并釋放植物和昆蟲來源的含有α-1,3核心巖藻糖基化N-糖蛋白的完整糖鏈。

        Table 1 Basic information statistics table of N-glycosidase from different species表1 不同物種PNGase的基本信息統(tǒng)計表

        2 PNGase的結(jié)構(gòu)

        不同物種PNGase是均具有去糖基化功能的同工酶,其基因序列、酶結(jié)構(gòu)等各有特點。

        2.1 不同物種PNGase的同源性

        PNGase在不同物種內(nèi)雖然具有相似功能,但其氨基酸長度和序列有較大差異。根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的PNGase相關(guān)氨基酸序列,進行序列比對,本文繪制了部分PNGase的進化樹(圖1)。由圖可知,原核、真核生物PNGase有較大的遺傳距離,但在真核生物中有一定的保守性,人與黑猩猩的PNGase同源性最近。

        2.2 PNGase的結(jié)構(gòu)

        2.2.1 真核來源的PNGase

        Fig.1 Phylogenetic tree analysis of PNGase圖1 部分PNGase的進化樹分析

        目前,真菌、植物和動物來源的PNGase分子結(jié)構(gòu)僅有部分得到解析。人NGLY1蛋白含有PUB、PNG Core、PAW 3個保守結(jié)構(gòu)域[24](圖2a),其中PUB區(qū)域的結(jié)構(gòu)已被解析,該結(jié)構(gòu)域由5個α螺旋和3個反平行的β折疊構(gòu)成。PUB是蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的區(qū)域;PNG Core是NGLY1催化N-糖蛋白去糖基化的區(qū)域;PAW參與NGLY1與寡糖結(jié)合[25]。通過AlphaFold2模擬了NGLY1蛋白的三級結(jié)構(gòu)(圖2b),根據(jù)模擬結(jié)果,PUB結(jié)構(gòu)域有一長臂狀結(jié)構(gòu),可能與幫助蛋白質(zhì)結(jié)合相關(guān)。釀酒酵母YPNG1分子結(jié)構(gòu)已得到解析,分為兩個結(jié)構(gòu)域;小鼠Ngly1僅有PUB結(jié)構(gòu)域得到解析。

        Fig.2 Structure of human PNGase圖2 人PNGase的結(jié)構(gòu)

        2.2.2 原核來源的PNGase

        PNGase F的保守結(jié)構(gòu)域包括PNG-N與PNG-C(圖3)。PNGase F的活性中心,是兩個8字反向β折疊形成的結(jié)構(gòu)域,底物在活性中心內(nèi)與3個酸性氨基酸結(jié)合,結(jié)合位點分別為Asp60、Glu118和Glu206。Kuhn等[26]認(rèn)為Asp60位點起催化作用,Glu118位點主要參與底物的識別與結(jié)合,Glu206位點主要穩(wěn)定底物分子與酶的結(jié)合。

        PNGase F-Ⅱ的N端為GLPGLi結(jié)構(gòu)、C端為PNG-N和PNG-C結(jié)構(gòu)域(圖3),后兩個結(jié)構(gòu)域之間由10個氨基酸組成的α螺旋連接。GLPGLi結(jié)構(gòu)域由10個β折疊和兩個α螺旋組成,與Glu82和Asp189結(jié)合,帶正電荷。PNGase F-Ⅱ靠近C端的PNG-N和PNG-C與PNGaseF的相似,但PNGaseF-Ⅱ沒有Glu118位點,比PNGase F多了3個與底物識別相關(guān)的loop環(huán)[3]。

        Fig.3 Structure of prokaryotic PNGase[3]圖3 原核生物PNGase的結(jié)構(gòu)[3]

        3 PNGase的功能研究

        3.1 PNGase的酶學(xué)功能研究

        PNGase能夠裂解N-連接糖肽或糖蛋白上天冬酰胺殘基與N-乙酰葡糖胺與之間的酰胺鍵,使天冬酰胺轉(zhuǎn)化為天冬氨酸,生成含有天冬氨酸的多肽鏈并釋放完整的N-糖鏈[27-28]。根據(jù)糖蛋白糖鏈外層鏈結(jié)構(gòu)的不同,糖蛋白可分為高甘露糖型(high-mannose,含有多個α-連接的甘露糖殘基)、復(fù)雜型(hybrid,含有以巖藻糖、半乳糖和唾液糖為組分的糖鏈殘基)與雜合型(complex,兼有高甘露糖型、復(fù)雜型特點)。PNGase對復(fù)合型、雜合型、高甘露糖型糖鏈均可切除;能水解的N-糖蛋白或N-糖肽的氨基酸序列為Ser/Thr-X-Asn(Ser:絲氨酸,Thr:蘇氨酸,X:除脯氨酸以外的任何氨基酸)[1]。PNGase的酶切位點示意圖見圖4。

        目前平臺已承接全國用戶規(guī)模達10 000個,300家企業(yè)及代理商接入系統(tǒng)平臺,8個區(qū)域數(shù)據(jù)中心;全國合作運營光纖傳輸網(wǎng)絡(luò)范圍達到14 000多公里,覆蓋全國200多個城市,目前是裝備制造業(yè)中最大的分布云網(wǎng)絡(luò)平臺綜合服務(wù)提供商和運營商。

        Fig.4 Schematic diagram of the restriction site of PNGase圖4 PNGase的酶切位點示意圖

        Suzuki等[24]報道,人NGLY1的主要作用底物為高甘露糖型N-糖蛋白。原核來源的PNGase F具有廣泛的底物特異性,可以酶切RNase B、Ova、IgG等底物,但不能切除帶有α-1,3-核心巖藻糖N-糖蛋白上的寡糖鏈,例如辣根過氧化物酶(HRP,植物來源蛋白)[2];而同為原核來源的PNGase F-Ⅱ,除了具有PNGase F的功能,可水解釋放含有α-1,3核心巖藻糖N-糖蛋白的完整糖鏈[3]。其余物種來源的PNGase具有相似的酶學(xué)功能。

        3.2 PNGase的生物學(xué)功能研究

        已有研究顯示,PNGase在真核生物中發(fā)揮一定的生物學(xué)功能,如器官發(fā)育、個體生長等[4,29-30]。當(dāng)人NGLY1缺陷時,會導(dǎo)致先天性去糖基化障礙[4,6]。PNGase在原核生物中的生物學(xué)功能尚未明確,本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn),PNGase F在炎癥機體中可能促進細胞因子風(fēng)暴,從而加重EM感染宿主的炎癥反應(yīng)[31]。

        3.2.1 PNGase與人類疾病

        人體內(nèi)蛋白質(zhì)糖基化修飾作用缺陷,會導(dǎo)致疾病發(fā)生,如糖基化障礙(congenital disorder of glycosylation,CDG)。N-糖基化缺陷是CDG糖基化缺陷類型之一,與PNGase缺陷相關(guān)[32]。由NGLY1缺陷引起的NGLY1-CDDG,患者出現(xiàn)發(fā)育遲緩、智力缺陷、運動功能障礙等臨床癥狀[4]。本課題組于2020年報道了6例中國NGLY1-CDDG患者,并對NGLY1-CDDG的臨床及基礎(chǔ)研究進行了綜述[33-34]。

        另外,Zolekar等[6]對人皮膚黑色素瘤細胞進行研究,發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細胞相比正常黑色素細胞NGLY1高表達;體外敲除黑色素瘤細胞NGLY1基因,黑色素瘤細胞的生長受到抑制、死亡,提示NGLY1與黑色素瘤的高度相關(guān)性,抑制NGLY1可能作為新的黑色素瘤治療策略。

        3.2.2 PNGase與鼠模型疾病

        Fujihira等[30]敲除C57BL/6品系小鼠的Ngly1基因,觀察發(fā)現(xiàn)C57BL/6Ngly1+/-缺陷的雌雄小鼠配交后,Ngly1-/-后代在胚胎發(fā)育過程出現(xiàn)心室間隔缺損,個體在出生前胚胎全部死亡,但C57BL/6品系小鼠與ICR品系小鼠雜交,Ngly1-/-小鼠胚胎部分死亡,Ngly1-/-小鼠的致死表型可以通過敲除內(nèi)切N-糖苷酶基因(Engase)得到糾正。

        Kong等[35]敲除小鼠胚胎成纖維細胞MEFs的Ngly1,發(fā)現(xiàn)Ngly1-/-MEFs線粒體膜電位降低50%,線粒體活性氧負荷上升40%,線粒體呼吸鏈功能缺陷;回補Ngly1后,線粒體功能恢復(fù)正常。Asahina等[5]報道,Ngly1缺陷鼠模型出現(xiàn)運動功能障礙,使用腺相關(guān)病毒(AAV-9)與人NGLY1 cDNA重組載體對小鼠進行單次腦室內(nèi)注射,恢復(fù)大腦(神經(jīng)元)和脊髓中的NGLY1表達,大腦神經(jīng)元中NGLY1的酶活性增加,模型鼠的運動功能得到一定恢復(fù)。上述結(jié)果提示,小鼠體內(nèi)PNGase缺陷可導(dǎo)致部分品系小鼠胚胎致死;PNGase可能與維持線粒體功能和機體運動功能有關(guān);補充NGLY1表達,可能對相關(guān)疾病有治療意義。

        3.2.3 PNGase與酵母

        PNGase缺陷的酵母突變株,與野生型相比,突變株中錯誤折疊的突變糖蛋白的降解速率變慢,但png1基因的缺失未影響酵母細胞的生存和生長,與酵母生存無明顯關(guān)聯(lián)[17]。Hirsch等[36]報道,酵母YPNG1在體外也可以區(qū)分正確與非正確的糖蛋白。上述結(jié)果提示,YPNG1可能與酵母細胞內(nèi)糖蛋白質(zhì)量控制有關(guān)。

        3.2.4 PNGase與線蟲

        秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的PNGase PNG-1由png-1基因編碼[17]。Habibi-Babadi等[29]研究發(fā)現(xiàn),png-1能夠限制神經(jīng)元和上皮細胞軸突分支,png-1缺陷后其產(chǎn)卵器官發(fā)育過程中軸突分支增加,導(dǎo)致其產(chǎn)卵行為下降。Kong等[35]敲除秀麗線蟲的png-1基因,發(fā)現(xiàn)png-1敲除個體壽命降低為野生型的53%。上述結(jié)果提示,PNGase可能參與維持線蟲的生殖功能,并延長線蟲個體壽命。

        3.2.5 PNGase與果蠅

        Galeone等[37]研 究 果 蠅PNGase相 關(guān) 基 因Pngl,發(fā)現(xiàn)其與果蠅骨骼形態(tài)生成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信 號 通 路 有 關(guān),BMP參與果蠅胚胎期消化道形成;當(dāng)Pngl缺陷,果蠅發(fā)育遲緩且幼蟲消化道畸形。Owings等[38]干擾果蠅Pngl表達,發(fā)現(xiàn)PNGase缺陷個體生長發(fā)育遲緩,在部分個體中有致死性;熱休克基因表達增加,熱沖擊作用可延長缺陷個體的壽命,對治療有一定的參考意義。結(jié)果提示PNGase缺陷可能導(dǎo)致果蠅生長發(fā)育延遲、器官畸形。

        4 展 望

        糖組學(xué)是繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后的研究熱點。糖基化和去糖基化是影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的重要修飾,研究此類修飾需要具有相關(guān)酶學(xué)功能的工具酶。PNGase酶學(xué)功能的研究可以通過質(zhì)譜、核磁共振波譜等技術(shù)開展。PNGase F是目前應(yīng)用最多的糖生物學(xué)分析工具酶,N-糖蛋白經(jīng)PNGase F水解,獲得的寡糖鏈可通過質(zhì)譜、毛細管電泳等技術(shù)分析鑒定糖鏈結(jié)構(gòu)及豐度,已在腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病與糖基化研究中得到應(yīng)用[39-41]。

        PNGase的酶學(xué)及生物學(xué)功能已有一定的研究,但生物體內(nèi)的生理病理機制還未明確。研究表明,人NGLY1缺陷可引起罕見遺傳性疾病NGLY1-CDDG,臨床表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、智力缺陷、運動障礙等[4],該疾病目前無有效的治療方法。AAV9-NGLY1 cDNA重組載體,能補充Ngly1缺陷小鼠神經(jīng)元細胞的NGLY1,使模型小鼠的運動功能障礙恢 復(fù)[5],結(jié)果提示NGLY1可 能 為NGLY1-CDDG患者治療的潛在藥物靶點,提高NGLY1蛋白表達水平或其酶活性,可能有助于減輕患者癥狀,針對NGLY1篩選酶激活劑是該類疾病藥物的研發(fā)目標(biāo)。NGLY1在黑色素瘤細胞中高表達,降低NGLY1表達水平能抑制黑色素瘤細胞生長[6],為NGLY1酶抑制劑相關(guān)藥物的研發(fā)提供新的思路。另外,NGLY1-CDDG患者成纖維細胞存在線粒體功能損傷,影響能量產(chǎn)生,回補NGLY1表達恢復(fù)線粒體功能,NGLY1或能應(yīng)用于線粒體相關(guān)藥物的研發(fā)。

        孫桂芹等[3]發(fā)現(xiàn)的PNGase F-Ⅱ能水解植物、昆蟲來源帶有α-1,3核心巖藻糖的蛋白質(zhì)寡糖,而植物[42]、昆蟲[43]來源的α-1,3核心巖藻糖結(jié)構(gòu)參與人IgE識別花粉、蜂毒等過敏原。李天勝等[44]用核心巖藻糖苷酶(cFase I)處理過敏原,發(fā)現(xiàn)過敏病人的血清對處理后過敏原的反應(yīng)下降。因此,糖苷酶在過敏原的基礎(chǔ)與應(yīng)用研究與中藥糖生物學(xué)研究等領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價值。

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