康宇暉，周洪善，金文杰,2,3，秦愛建,2,3

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225000；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225000；3.教育部禽類預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225000)

類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)是腸桿菌科鄰單胞菌屬成員，廣泛分布于自然界，已從水生環(huán)境[1-3]、野生動物、家養(yǎng)動物[1,3-4]和人類[3,5-6]中分離到該菌，特別是水源和動物體中更為常見。該菌可存在于健康動物體內(nèi)，但作為一種條件致病菌也會引發(fā)動物的敗血癥、腸道感染、膿腫、皮膚潰瘍性損傷等疾病[7]。在人醫(yī)上，類志賀鄰單胞菌同樣被認(rèn)為是許多疾病的致病因子，如角膜炎、肺炎、骨髓炎、敗血癥和腦膜炎等[5,8-10]。已有許多國家從散發(fā)或暴發(fā)的急性腹瀉病人糞便、血液和腦脊液中分離到該菌，且分離率有日益增多的趨勢[11]。人類因類志賀鄰單胞菌引發(fā)的腸炎發(fā)病情況存在較明顯的地域差異，人類的感染很多是由于食入生魚或被水污染的食物引起[5]，在東南亞地區(qū)和非洲地區(qū)的發(fā)病率較高，而在北美地區(qū)和歐洲地區(qū)的發(fā)病率相對較低[7]。

2020年10月，江蘇宿遷某鵝場270日齡鵝發(fā)生了大批發(fā)病及死亡的情況，給鵝場帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究對發(fā)病原因進(jìn)行了探究，對病死鵝進(jìn)行剖檢及病原分離鑒定，并對分離菌株進(jìn)行了一系列探究，以期減少鵝的死亡，降低經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 材料

病死鵝來源于江蘇某養(yǎng)殖場，270日齡，常用疫苗免疫齊全。20只6周齡健康BALB/c雄性小鼠購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。血瓊脂培養(yǎng)基購自長沙比克曼生物有限公司；MH培養(yǎng)基購自青島海博生物科技有限公司；細(xì)菌生化反應(yīng)管、藥敏紙片均購自杭州天和微生物試劑有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；Bruker質(zhì)譜儀購自布魯克公司。

1.2 細(xì)菌分離純化

解剖送檢病死鵝，檢查內(nèi)臟器官病變情況，并做好記錄。在超凈臺內(nèi)，對病死鵝肝臟進(jìn)行表面無菌處理，用無菌接種環(huán)蘸取肝臟內(nèi)部組織，接種于血瓊脂培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h[12]，選取單菌落接種于新的血瓊脂平板，于37 ℃溫箱中倒置培養(yǎng)12 h[13]，得到純化的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色[14]，油鏡觀察。

1.3 分離菌生化試驗(yàn)鑒定

將純化的單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，置于37 ℃、175 r/min搖床中過夜培養(yǎng)12 h，用接種針蘸取菌液后接種于8個微量生化反應(yīng)管中，其中，葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、硫化氫的生化反應(yīng)管37 ℃溫箱中反應(yīng)24 h；枸櫞酸鈉、尿素的生化反應(yīng)管37 ℃溫箱中反應(yīng)72 h。通過觀察微量生化反應(yīng)管的顏色變化，對分離細(xì)菌的生化特性進(jìn)行判定。

1.4 分離菌基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)鑒定

使用Bruker質(zhì)譜儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定，并使用Brucker細(xì)菌檢測標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)。采用布魯克MBT_FC.par方法自動采集數(shù)據(jù)。將純化的細(xì)菌薄涂于靶板，先用移液槍滴加1 μL甲酸用來破碎細(xì)菌的細(xì)胞壁，干燥后再滴加1 μL的α-氰-4-羥基肉桂酸(HCCA)，等待完全干燥，將MALDI靶板放入MALDI-TOF質(zhì)譜儀中進(jìn)行鑒定。當(dāng)質(zhì)譜鑒定得分在2.300～3.000時，鑒定結(jié)果可完全可靠地鑒定到種；得分在2.000～2.299之間時，結(jié)果鑒定到種；得分在1.700～1.999之間時，結(jié)果可鑒定到屬；當(dāng)?shù)梅衷?～1.699之間，則無可信結(jié)果。

1.5 細(xì)菌16S rDNA序列分析

取1 mL菌液，根據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA，用酶標(biāo)儀測定DNA濃度。用細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA，選用試劑盒自帶的引物(5′-GAGCGGATAACATTT-CACACAGG-3′；5′-CGC-CAGGGTTTTCCCAG-TCACGAC-3′)。PCR反應(yīng)體系50 μL：PCR Premix 25 μL，DNA模板 2 μL，上、下游引物(20 pmol/μL)各0.5 μL，滅菌ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序結(jié)果對比NCBI現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫，從而確定細(xì)菌種類，上傳序列，獲取登錄號，最后運(yùn)用軟件Mega 7.0將獲取的序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6 藥敏試驗(yàn)

采用K-B藥敏紙片擴(kuò)散法[15]，取50 μL對數(shù)生長期菌液涂于新鮮配制的MH瓊脂培養(yǎng)基，選取20種臨床常見的藥敏紙片間隔均勻地貼在平板上(紙片間至少保持2 cm間距)，于37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測量各抑菌圈直徑，最終對比美國臨床與實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，評估分離菌對各抗菌藥的敏感程度[16-17]。

1.7 小鼠致病性試驗(yàn)

取純培養(yǎng)菌落置于LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃搖床150 r/min震蕩培養(yǎng)12 h，取出菌液，將菌液濃度調(diào)整至D600nm為1，此時菌液濃度為1.0×109CFU/mL，再做10倍梯度稀釋，使菌液終濃度分別為1.0×106～1.0×109CFU/mL。將20只6周齡雄性健康BALB/c小鼠均分為5個組，其中4組作為感染組，分別腹腔注射不同濃度的菌液，0.5 mL/只，1組作為對照組，腹腔注射等體積LB培養(yǎng)基。每12 h觀察小鼠一次，若有死亡，立即解剖并觀察病變，且從小鼠肝臟再次進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，同時根據(jù)小鼠死亡情況計算細(xì)菌的半數(shù)致死量(LD50)。

2 結(jié) 果

2.1 病死鵝剖檢與細(xì)菌分離純化結(jié)果

剖檢結(jié)果顯示，病死鵝肝臟腫大淤血，腺胃乳頭黏膜出血，腸道黏膜出血，卵母細(xì)胞變形變性，腹腔內(nèi)有卵黃碎片，喉頭氣管黏膜充血、有黏液性分泌物。純化后的細(xì)菌菌落在血平板上光滑濕潤，呈灰白色，菌落直徑大小約1 mm(圖1A)。油鏡下觀察，可見此菌呈短桿狀，革蘭氏染色陰性，多成對排列，也有短鏈狀排列或成叢排列(圖1B)。

圖1 分離菌血瓊脂培養(yǎng)菌落形態(tài)(A)及革蘭氏染色鏡檢圖(B，1 000×)

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，此細(xì)菌可發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、枸櫞酸鹽、尿素，而接種于乳糖、甘露醇、蔗糖、硫化氫的未出現(xiàn)任何變化(表1)。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》，生化結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，分離菌與類志賀鄰單胞菌的生化特性相符合。

表1 分離菌生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果

為降低質(zhì)譜儀出現(xiàn)錯誤判斷的概率，本次試驗(yàn)利用MALDI-TOF MS對該細(xì)菌進(jìn)行了2次鑒定，兩次質(zhì)譜鑒定得分分別是2.356和2.420，得分均高于2.300，表示鑒定結(jié)果可靠，可以完全精確到種的水平，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索，認(rèn)為此菌為類志賀鄰單胞菌。

2.4 細(xì)菌16S rDNA序列分析

16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,純培養(yǎng)菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為500 bp左右(圖2)，與預(yù)期片段大小一致。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，分離菌與已公開發(fā)表的多株類志賀鄰單胞菌的序列相似度達(dá)到98%以上，具有高度同源性(圖3)，與其他鑒定試驗(yàn)結(jié)果一致。將該分離株命名為SQ20201005,16S rDNA序列上傳至GenBank，獲取登錄號為OM883834。進(jìn)一步確定該分離株為類志賀鄰單胞菌。

M，1 kb DNA Ladder；1，待檢樣品；2，陰性對照

圖3 基于16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，在受試的20種臨床常用抗菌藥中，分離菌株對左氧氟沙星、美羅培南、頭孢西丁、慶大霉素等10種抗菌藥敏感，對四環(huán)素、頭孢吡肟、頭孢他啶、頭孢唑林中介，對阿奇霉素、復(fù)方新諾明、氨芐西林等6種抗菌藥耐藥(表2)。

表2 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表

2.6 小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

觀察感染組小鼠發(fā)現(xiàn)，5.0×108和5.0×107CFU組小鼠在注射細(xì)菌后24 h內(nèi)全部死亡，5.0×106CFU組在感染后24 h內(nèi)表現(xiàn)出明顯的精神不佳、毛發(fā)蓬亂、不喜運(yùn)動等，5.0×105CFU組和空白對照組無明顯眼觀改變。及時剖檢死亡小鼠，可觀察到小鼠肝臟腫大且有大面積點(diǎn)狀出血，脾臟腫大發(fā)黑，腸腔積液嚴(yán)重，腸道內(nèi)容物呈膠凍樣。注射后72 h，5.0×106CFU組小鼠精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，所有小鼠均可在注射后15 d正常存活且表現(xiàn)健康。小鼠致病性試驗(yàn)具體結(jié)果見表3。用改良寇氏法計算，得知此細(xì)菌的LD50為5.0×106.5CFU。

表3 分離菌小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

鄰單胞菌屬中僅有類志賀鄰單胞菌一個成員，其在2005年之前一直被劃分于弧菌科，后被劃分于腸桿菌科，且于《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(第2版)中正式改為腸桿菌科。人醫(yī)對于類志賀鄰單胞菌的研究最早始于1972年，動物醫(yī)學(xué)研究者也相繼在魚、麻鴨、犬、灰狼等體內(nèi)分離到此細(xì)菌，并多次報道其可引起動物發(fā)病死亡。由于類志賀鄰單胞菌主要生活于淡水水體中[18]，所以目前獸醫(yī)界對于類志賀鄰單胞菌的報道多集中于各種水產(chǎn)動物，如草魚[19]、鱘魚[20]等，對于哺乳動物及禽類感染類志賀鄰單胞菌的報道則相對較少。本研究在江蘇宿遷某鵝場發(fā)病死亡的鵝肝臟中分離到1株類志賀鄰單胞菌，通過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)此前尚未有過類志賀鄰單胞菌可引起鵝發(fā)病死亡的報道，此發(fā)現(xiàn)豐富了鵝致病性微生物的種類，也豐富了類志賀鄰單胞菌的宿主范圍。

病死鵝剖檢結(jié)果顯示，此菌對鵝的肝臟、胃腸、卵巢等均有不同的侵害，且病變明顯，對比陳維剛等[21]在對赤麻鴨感染類志賀鄰單胞菌導(dǎo)致死亡的報道中對剖檢病變的描述，死亡赤麻鴨肝臟腫大、有深色瘀斑，腸管腫大，發(fā)現(xiàn)鵝在感染后與赤麻鴨感染后有諸多相似的病變，據(jù)此推測，類志賀鄰單胞菌對不同水禽的致病方式及危害可能存在較高的相似度。由于類志賀鄰單胞菌適宜在夏秋季較高溫度的水源中生長，使得在水中自由活動的水禽及水產(chǎn)品易被感染；此外，由于類志賀鄰單胞菌的常見宿主是魚[22]，水禽多以魚類為食，故在捕食魚類的同時也極易通過消化道感染類志賀鄰單胞菌。針對本次鵝感染類志賀鄰單胞菌的病例推測其最初的感染途徑，由于發(fā)病鵝數(shù)量多，且發(fā)病時間較集中，故認(rèn)為由消化道感染的可能性最大，鵝群食入被污染的水或飼料或遭受水體污染的帶菌魚蝦導(dǎo)致細(xì)菌進(jìn)入消化道，細(xì)菌由消化道穿透腸黏膜免疫屏障抵達(dá)機(jī)體各處，對機(jī)體造成損傷。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離的類志賀鄰單胞菌具有多重耐藥性，對比張效平等[23]從江鱈中分離到的類志賀鄰單胞菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2株細(xì)菌都具有多重耐藥的特性，其中，江鱈中分離到的菌株對復(fù)方新諾明表現(xiàn)中度敏感，而本研究中的分離菌株對復(fù)方新諾明表現(xiàn)耐藥，提示了復(fù)方新諾明在養(yǎng)殖中的使用很可能存在長期過量的情況，導(dǎo)致類志賀鄰單胞菌逐漸對其耐藥。在養(yǎng)殖過程中長期使用多種抗生素抑制細(xì)菌生長，造成了環(huán)境污染及細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)，因此，應(yīng)在養(yǎng)殖過程中輪換用藥或穿梭用藥，避免某一種或幾種抗生素長期使用對細(xì)菌造成的壓力，從而減緩細(xì)菌耐藥基因的進(jìn)化。在藥物的選擇問題上，一方面要考慮到藥物的敏感性，另一方面還要考慮到所涉及的藥物是否為獸醫(yī)臨床禁用藥。在用藥期間，可采取全群拌料飼喂的方式[21]，以確保對群體內(nèi)每只鵝都有藥物攝入，同時對養(yǎng)殖場環(huán)境要進(jìn)行徹底地清掃消毒，防止細(xì)菌反復(fù)滋生。

小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究分離的類志賀鄰單胞菌有較強(qiáng)的致病性，在動物醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生方面都意義重大，2021年，韓國學(xué)者Kyoo等[24]報道了1起7歲灰狼因感染類志賀鄰單胞菌而死亡的病例，對死亡的灰狼進(jìn)行剖檢發(fā)現(xiàn)，其肝臟、脾臟腫大、腹腔積液等許多病理變化都與感染小鼠的癥狀極其相似，由此可推測，類志賀鄰單胞菌在不同哺乳動物體內(nèi)的致病途徑及機(jī)理大體相似，且對不同哺乳動物都具有較強(qiáng)的致病性，因此，不論是在獸醫(yī)臨床還是人醫(yī)臨床中，都應(yīng)該加強(qiáng)對其的重視與防范。

4 結(jié) 論

本研究從鵝肝臟中分離到1株多重耐藥的類志賀鄰單胞菌，首次報道了類志賀鄰單胞菌可造成鵝感染發(fā)病及死亡，豐富了鵝的致病微生物；鵝源類志賀鄰單胞菌同樣可引起小鼠死亡，半數(shù)致死量為5.0×106.5CFU，有較強(qiáng)的致病性，應(yīng)加強(qiáng)防范。