任澤恒，皮雪磊，夏安然，孫 悅，胡昌輝，任桂萍

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物制藥實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus，CPV)引起的一種急性病毒性傳染類疾病[1],其主要特征為犬出血性腸炎和非化膿性心肌炎，臨床表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、發(fā)熱和排便帶血等癥狀[2]，具有高度傳染性和致死性。研究表明，不同年齡不同性別犬均能感染，主要以幼犬最為嚴(yán)重，致死率極高[3]。CPV是一種無囊膜單鏈DNA病毒[4]，含有2個(gè)開放閱讀框(ORF)，分別編碼結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2)和非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2)，其中VP2是最主要的結(jié)構(gòu)蛋白[5-6]，能夠誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。目前，犬細(xì)小病毒病以接種疫苗為主要預(yù)防方式[7]，但疫苗和臨床治療制劑存在許多缺陷，如弱毒疫苗存在毒株變異和毒力返強(qiáng)以及散毒的風(fēng)險(xiǎn)，母源抗體的影響會(huì)導(dǎo)致免疫失敗[8-10]。單克隆抗體為鼠源抗體，存在免疫排斥反應(yīng)[11]等問題。因此，亟需研制治療效果顯著又安全可控的藥物。

1993年Hamers在駱駝科動(dòng)物及軟骨魚類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)存在一種缺失輕鏈和重鏈第一恒定區(qū)(CH1)的抗體，被稱為重鏈抗體(HCAbs)[12]。經(jīng)過基因編輯技術(shù)克隆重鏈抗體的可變區(qū)，得到只由1個(gè)重鏈可變區(qū)組成的單域抗體(VHH)，也被稱為納米抗體(Nb)[13]。與傳統(tǒng)抗體相比，Nb具有免疫原性弱、生產(chǎn)成本低、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，且犬源抗體相比于鼠源抗體，在治療時(shí)不需要擔(dān)心免疫排斥等副作用。因此為制備犬源抗CPV的Nb，建立犬源抗CPV pBSD-Nb抗體庫對(duì)犬細(xì)小病毒病的治療十分重要。王天宇等[14]通過建立納米抗體庫成功篩選出抗豬流行性腹瀉病毒S蛋白Nb并進(jìn)行了中和效價(jià)鑒定，抗體效價(jià)可達(dá)1∶256 000。細(xì)菌展示是利用基因工程技術(shù)將外源基因與細(xì)胞間質(zhì)分泌型信號(hào)肽(NlpA)進(jìn)行融合表達(dá)，將外源蛋白表達(dá)在細(xì)菌內(nèi)膜上[15]。N1PA信號(hào)肽可以介導(dǎo)外源蛋白穿過細(xì)胞，并且在穿越細(xì)胞膜的過程中，N1PA信號(hào)肽會(huì)被降解，最終留下6個(gè)氨基酸(CDQSSS)將外源蛋白錨定在細(xì)菌內(nèi)膜外表面[16-17]。本研究旨在建立犬源抗CPV pBSD-Nb庫，并通過細(xì)菌展示結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)篩選出具有高親和力的Nb，為抗CPV基因工程抗體藥物篩選提供依據(jù)，也為研制中和活性全長(zhǎng)抗體奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌Rosetta(DE3)PlysS感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；CPV、CPV高免比格犬脾臟、血清、Fitc標(biāo)記的VP2蛋白、pBSD展示載體均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥教研室制備并保存。貓腎細(xì)胞(F81)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫(保藏號(hào)：19375.09.3101MAMGNO13)。RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司;pMD19-T、pET-27b載體均購自Novagen公司；SfiⅠ、NdeⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、PCR試劑、T4 DNA連接酶、DL2000 DNA Marker、IPTG、溶菌酶、抗生素均購自TaKaRa公司；HRP-Sheep Anti-Dog IgG(H+L)購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 pBSD-Nb庫構(gòu)建 取CPV高免比格犬的脾臟剪成小塊至預(yù)冷的研磨管中，每管1 mg，按照動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒說明書提取RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中犬重鏈可變區(qū)(VH)基因的序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1。引物均由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。以cDNA為模板擴(kuò)增抗體庫VH基因，引入SfiⅠ酶切位點(diǎn)，分別對(duì)VH和pBSD載體進(jìn)行SfiⅠ單酶切。利用T4 DNA連接酶將VH和pBSD載體片段4 ℃過夜連接。將PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB固體培養(yǎng)基(含有50 μg/mL氯霉素)，在37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，構(gòu)建pBSD-Nb庫。

表1 pBSD-Nb庫引物

1.2.2 pBSD-Nb庫篩選 挑取1.2.1中的單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至D600nm值約0.4后，加0.25 mmol/L IPTG，37 ℃、120 r/min誘導(dǎo)4 h。誘導(dǎo)結(jié)束后，取1 mL培養(yǎng)物12 000 r/min離心1 min，棄上清；加入1 mL PBS洗滌，12 000 r/min離心1 min，棄上清；用350 μL Tris蔗糖溶液(含蔗糖0.26 μmol，Tris 0.04 mol)重懸菌體；加入35 μL新配制的溶菌酶至終濃度1 mg/mL；在渦旋振蕩儀上緩慢滴加700 μL預(yù)冷的EDTA溶液(1 mmol/L)，混勻后冰上靜置15 min；加入50 μL預(yù)冷的MgCl2溶液(0.5 mol/L)，混勻后冰上靜置10 min；12 000 r/min離心3 min，棄上清；加入1 mL PBS溶液洗滌原生質(zhì)體，4 ℃、8 000 r/min離心3 min收集菌體。取90 μL的PBS重懸原生質(zhì)體。向制備的原生質(zhì)體中依次加入9 μL 1%牛血清白蛋白(BSA)溶液，1 μL熒光標(biāo)記的VP2蛋白(FITC-VP2)，冰上避光孵育1 h，8 000 r/min離心3 min，離心后收集菌體，用PBS洗滌3次，離心后棄上清，用PBS重懸沉淀。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)陰性對(duì)照在488 nm波長(zhǎng)激光下激發(fā)的熒光強(qiáng)度，收集樣品中熒光強(qiáng)度大于陰性對(duì)照的部分。提取所篩選細(xì)菌的質(zhì)粒，將質(zhì)粒進(jìn)行電轉(zhuǎn)，完成抗體庫的構(gòu)建。繼續(xù)按照上述方法對(duì)抗體庫進(jìn)行2輪、3輪、4輪篩選，直至抗體庫陽性率達(dá)到80%以上。此時(shí)即可挑取固體培養(yǎng)基平板上的單菌落，將所挑取的單菌落分別培養(yǎng)，用流式細(xì)胞術(shù)逐一檢測(cè)單菌落，將獲得的陽性克隆送北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.3 pET27b-Nb重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)測(cè)序結(jié)果，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)測(cè)序結(jié)果正確的Nb基因的上、下游引物，上游引入NdeⅠ酶切位點(diǎn)，下游引入XhoⅠ酶切位點(diǎn)，引物序列及酶切位點(diǎn)序列信息見表2，引物均由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。對(duì)FCM檢測(cè)為陽性克隆的質(zhì)粒中Nb基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將大小約380 bp的片段切下進(jìn)行膠回收。將pET27b載體和Nb基因用NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切，獲得酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶4 ℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落鑒定正確的質(zhì)粒送北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。取10 ng測(cè)序正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)PlysS感受態(tài)細(xì)胞。涂布于LB固體培養(yǎng)基上(含50 μg/ mL 卡那霉素)，37 ℃培養(yǎng)12 h。

表2 Nb引物信息

1.2.4 Nb基因蛋白的表達(dá)與純化 挑取鑒定正確的大腸桿菌Rosetta(DE3)PlysS菌落接種到LB培養(yǎng)基中(含有50 μg/mL卡那霉素)，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)4～6 h，當(dāng)菌液D600 nm值達(dá)到0.4時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)劑，37 ℃、120 r/min誘導(dǎo)4 h，收集誘導(dǎo)菌，經(jīng)超聲破碎后離心，分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。取1 mL上述菌液擴(kuò)大培養(yǎng)。4 ℃、4 000 r/min離心30 min收集誘導(dǎo)后菌體，用適量PBS重懸菌體，加入溶菌酶至終濃度為1 mg/mL，冰上靜置1 h后超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，棄上清，利用包涵體洗滌液(尿素濃度為2 mol/L)對(duì)包涵體進(jìn)行洗滌，洗滌2次后，用包涵體變性液(尿素濃度為8 mol/L)重懸包涵體蛋白，將變性蛋白逐滴加入復(fù)性液(尿素濃度為2 mol/L)中。將復(fù)性后的蛋白置4 ℃ PBS溶液中透析18 h，分裝后―80 ℃保存?zhèn)溆?。將透析后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，計(jì)算蛋白濃度。

1.2.5 ELISA法檢測(cè)Nb對(duì)CPV的親和力 用包被液將Nb分別稀釋至100、50、20、10、1、0.1 μg/mL，包被于96孔板，每孔100 μL，置4 ℃過夜。包被過夜后用PBST洗滌5次，每次3 min。使用5%脫脂奶粉37 ℃封閉3 h，洗滌5次后，加入CPV稀釋液100 μL，置于37 ℃孵育1 h，洗滌5次后，加入1∶9 000稀釋的抗CPV陽性血清作為一抗，37 ℃孵育1 h，洗滌5次，1∶7 500稀釋的HRP-Sheep Anti-Dog IgG(H+L)二抗中37 ℃孵育1 h，洗滌5次，加入100 μL TMB底物液避光顯色15 min，每孔加入50 μL終止液，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔D450 nm值。設(shè)置只加底物的PBS組為空白對(duì)照(N1)、未加CPV的為陰性對(duì)照(N2)、用小鵝瘟病毒(GPV)代替CPV的為條件對(duì)照(N3)。樣品及對(duì)照均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.6 CPV滴度測(cè)定及Nb中和活性檢測(cè) 將96孔板中的F81細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度達(dá)80%，吸去上清，用DMEM將CPV按101～108梯度稀釋后加入F81細(xì)胞中，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)平行孔。同時(shí)設(shè)置只加入100 μL DMEM培養(yǎng)液的正常細(xì)胞為對(duì)照組，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天觀察記錄細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。利用Reed-Muench法測(cè)定病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)。

將Nb按照21～29的梯度用DMEM進(jìn)行稀釋，分別與100 TCID50CPV混合后37 ℃孵育1 h。將F81細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)至匯合度達(dá)80%，吸去上清，加入Nb-CPV混合液，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度設(shè)4個(gè)平行孔。同時(shí)設(shè)置DMEM代替混合液的空白組(C1)，只加CPV病毒液代替混合液的病毒組(C2)，加抗GPV-Nb代替CPV-Nb的GPV-Nb組(C3)。將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每天觀察并記錄CPE，連續(xù)7 d。利用Reed-Muench法對(duì)Nb的中和效價(jià)進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 pBSD-Nb庫的鑒定

由圖1A可知，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小384 bp，與VH片段預(yù)期大小相符。由圖1B可知，利用PCR對(duì)構(gòu)建的pBSD-Nb庫進(jìn)行鑒定，獲得384 bp的VH片段，證明pBSD-Nb抗體庫構(gòu)建成功。

M，DL2000 DNA Marker；1～8，PCR擴(kuò)增pBSD-Nb庫；9、10，PCR鑒定pBSD-Nb庫

2.2 pBSD-Nb庫的篩選

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照的峰(圖2A)相比，含有抗CPV-Nb菌有明顯的陽性峰，陽性菌所占的比例為23.8%(圖2B)，說明部分陽性菌表達(dá)的Nb能與VP2蛋白特異性結(jié)合。2輪、3輪、4輪篩選結(jié)果顯示，陽性菌的百分比不斷增加(圖2C～2E)。第2輪篩選，陽性原生質(zhì)體比例升至41.9%(圖2C)；第3輪篩選，陽性率升至61.7%(圖2D)；第4輪篩選，陽性率達(dá)到80.1%(圖2E)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，從50株抗體中獲得9株陽性峰偏移率較高的抗體，分別命名為Nb1、Nb2、Nb3、Nb4、Nb5、Nb6、Nb7、Nb8和Nb9(圖3)，將抗體對(duì)應(yīng)的菌株進(jìn)行測(cè)序后，將測(cè)序結(jié)果于NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Nucleotide BLAST分析，發(fā)現(xiàn)測(cè)序所得9個(gè)Nb序列均與GenBank上已發(fā)表的犬抗體VH具有90%的相似性。

A，陰性對(duì)照；B～E，第1～4輪篩選

A，陰性對(duì)照；B～J，Nb1～Nb9

2.3 Nb基因的克隆

由圖4可知，以篩選出的表達(dá)9株抗體的質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增出大小為384 bp的Nb基因特異性目的條帶，與預(yù)期的大小相符。Nb基因與pET-27b連接后，測(cè)序結(jié)果顯示與Nb原始核苷酸序列一致。

M，DL2000 DNA Marker；1～9，質(zhì)粒

2.4 Nb蛋白的表達(dá)和純化

對(duì)重組質(zhì)粒pET27b-Nb進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，結(jié)果顯示目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，Nb蛋白分子質(zhì)量約14 ku(圖5)。對(duì)包涵體變性、復(fù)性、純化及透析，成功獲得并表達(dá)了目的蛋白(圖6)，純化后Nb1～Nb9蛋白的濃度依次為1.65、1.38、1.85、1.60、1.65、1.55、1.46、1.75和1.39 mg/mL。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、5，未誘導(dǎo)陽性菌；2～4、6～11，Nb(Nb1～Nb9)誘導(dǎo)后的沉淀

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～9，純化后Nb蛋白(Nb1～Nb9)

2.5 Nb對(duì)CPV的親和力檢測(cè)

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，9株抗體的親和力均極顯著高于各對(duì)照組 (P<0.01)。隨著Nb濃度的增加，反應(yīng)的光密度值也呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。說明這9個(gè)Nb均具有與CPV結(jié)合的能力，其中Nb1、Nb2、Nb4、Nb5、N6和Nb9對(duì)CPV的親和力較強(qiáng)(圖7)。

與對(duì)照組N3相比，**，差異極顯著(P<0.01)

2.6 CPV滴度測(cè)定和Nb中和活性檢測(cè)

根據(jù)Reed Muench法計(jì)算得到CPV的TCID50為10―6.4/0.1 mL。中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，9株Nb中有1株具有中和活性，最低有效濃度為0.05 mg/mL(表4)。

表4 Nb中和活性的測(cè)定

3 討 論

CPV于1978年在美國出現(xiàn)[18]，并在世界各地犬類中迅速傳播，抗CPV抗體的制備一直以來都是研究的熱點(diǎn)。本研究建立了pBSD-Nb庫，通過細(xì)菌展示技術(shù)結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其進(jìn)行了4輪篩選，成功篩選出9株可以與CPV-VP2結(jié)合的Nb。細(xì)菌展示技術(shù)利用信號(hào)肽將外源基因展示在細(xì)菌內(nèi)膜外側(cè)[19]，而且錨定外源蛋白的信號(hào)肽只有6個(gè)氨基酸，對(duì)外源蛋白的構(gòu)象幾乎沒有影響。細(xì)菌周質(zhì)腔內(nèi)的氧化性環(huán)境，保證了外源蛋白的正確折疊[20]，且可以保證蛋白的穩(wěn)定性，這有利于抗原抗體的結(jié)合，保證了抗體篩選的準(zhǔn)確性。由于細(xì)菌體積比較大，可以通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行高通量的分析和篩選，可以快速的富集陽性菌株并篩選出陽性單克隆菌株。

傳統(tǒng)方法制備的單克隆抗體，往往在蛋白質(zhì)的N-端或C-端加入用于鑒定或純化的標(biāo)志物，如His標(biāo)簽等。由于其為抗體以外的短肽片段，也許會(huì)影響抗體的折疊及功能。本研究直接用無標(biāo)簽的pET-27b載體在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)Nb，經(jīng)簡(jiǎn)單處理后，得到純度和濃度均較高的目的蛋白，減少了去標(biāo)簽純化的步驟，節(jié)約時(shí)間，降低純化損失，并且保證了蛋白能夠免受標(biāo)簽的影響，正確折疊[21-23]。

雖然傳統(tǒng)單鏈抗體(scFv)的VH和輕鏈可變區(qū)(VL)片段在連接時(shí)的組合是隨機(jī)的，增加了抗體庫的多樣性，但也有可能由于VH和VL錯(cuò)配導(dǎo)致scFv活性降低。同時(shí)在構(gòu)建抗體文庫的時(shí)候scFv經(jīng)過3次酶切和3次連接,這很有可能使產(chǎn)物在此過程中造成損失。本研究篩選的Nb在結(jié)構(gòu)上比scFv簡(jiǎn)單很多，它們被單基因編碼，不存在由于錯(cuò)配導(dǎo)致活性降低的風(fēng)險(xiǎn)，并且Nb僅經(jīng)過1次酶切和連接，大大降低了抗體文庫在構(gòu)建過程中抗體的損失，保證了抗體文庫的多樣性。同時(shí)，Nb由于具有較小的分子結(jié)構(gòu)[24]，穿透能力強(qiáng)，可以進(jìn)入致密的組織，使其有可能結(jié)合常規(guī)抗體不能接近的抗原位點(diǎn)[25]。本試驗(yàn)建立的pBSD-Nb庫相比于Pi等[26]建立的pBSD-scFv庫，篩選出的Nb的氨基酸序列比scFv的重復(fù)率更低，說明pBSD-Nb庫相比pBSD-scFv庫具有更高的多樣性，有更高的幾率篩選出具有中和活性的抗體，為日后篩選出更高水平抗CPV的中和抗體奠定基礎(chǔ)。

對(duì)比ELISA和中和試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)病毒具有高親和力的抗體并不一定具有中和活性。這可能是部分Nb與VP2蛋白非中和抗原表位區(qū)段結(jié)合導(dǎo)致的。由于無法保證抗體對(duì)病毒的親和力與中和活性的統(tǒng)一，這會(huì)使中和活性抗體的篩選效率降低。如果將VP2上中和抗原表位以人工合成的多肽形式進(jìn)行表達(dá)并以其為“誘餌”[27]，代替本研究篩選中所使用的VP2蛋白，直接篩選出結(jié)合中和表位的高親和力抗體，即有可能實(shí)現(xiàn)抗體對(duì)病毒的親和力與中和活性的統(tǒng)一，CPV中和活性抗體的篩選效率將有可能得到提高。相比于目前一些抗CPV抗體的研究[28]，本研究成功獲得了1株高親和力且中和活性更好的抗體，其最低有效濃度為0.05 mg/mL，結(jié)果可為抗CPV Nb的制備提供理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了抗CPV pBSD-Nb庫，篩選出9株對(duì)VP2具有高親和力的Nb，且9株Nb均可特異性結(jié)合CPV，6株親和力較強(qiáng)。其中1株可以阻斷CPV對(duì)F81細(xì)胞的CPE作用，其最低有效濃度為0.05 mg/mL，結(jié)果可為構(gòu)建全長(zhǎng)抗體提供參考。