王帥杰，譚子涵，李晗博，孫香雪，艾思含，王 蕾,2，趙 迪,2，侯永清,2

(1.武漢輕工大學(xué)，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室，武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)，動物營養(yǎng)與飼料安全湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430023)

豬流行性腹瀉病毒(PEDV)是冠狀病毒的一種，感染仔豬后會導(dǎo)致豬流行性腹瀉(PED)，主要癥狀表現(xiàn)為嘔吐、泄瀉和脫水[1]。所有年齡階段的豬都可能感染PEDV，其中幼齡仔豬由于發(fā)育不完全而最容易被感染，且感染后的仔豬發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率更是超過了80%[2]。在中國，從20世紀(jì)80年代后期以來，由于PEDV感染死亡的仔豬已經(jīng)超過了一百萬頭，對養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的負(fù)面影響[3]。PEDV主要在小腸絨毛的細(xì)胞漿中復(fù)制，在隱窩和腸系膜淋巴結(jié)中也有少數(shù)增殖。PEDV感染增殖會導(dǎo)致細(xì)胞變性和絨毛萎縮，進(jìn)而引起腹瀉，使小腸的吸收面積減少，導(dǎo)致小腸吸收功能損傷進(jìn)而引起機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收障礙[4]。

槲皮素又名櫟精，是自然界中最豐富的飲食類黃酮類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含5個羥基，可以與機(jī)體中代謝產(chǎn)生的自由基中和，具有很強(qiáng)的抗氧化作用[5]。黃思瑩等[6]研究發(fā)現(xiàn),添加高劑量的桑葉槲皮素可以顯著提高小鼠血漿中的抗氧化酶活性，顯著降低小鼠血漿中丙二醛(MDA)等氧化產(chǎn)物的含量。槲皮素也有一定的抗病毒作用，有研究表明，在單層細(xì)胞培養(yǎng)中，添加槲皮素可抑制多種病毒對細(xì)胞的感染，并且可以抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制[7]。作者所在研究團(tuán)隊同期研究發(fā)現(xiàn)，在仔豬飼糧中添加槲皮素能夠緩解因PEDV感染導(dǎo)致的平均日增重下降，降低仔豬糞便形態(tài)評分及仔豬腹瀉率[8]。本試驗旨在研究槲皮素對PEDV感染仔豬腸道的保護(hù)作用，為槲皮素在早期斷奶仔豬生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

PEDV(YN株)，由武漢輕工大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點實驗室保存；槲皮素購自MCE公司(純度>98%)；奶粉購自紐瑞滋食品(上海)有限公司，其營養(yǎng)水平見表1。

表1 奶粉營養(yǎng)水平

1.2 試驗動物與試驗設(shè)計

試驗選用18頭平均體重為(2.67±0.15)kg的7日齡(杜×長×大)健康仔豬，將仔豬隨機(jī)分入3個處理組:對照組、PEDV組和槲皮素+PEDV組(Que+PEDV)，每個處理組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。試驗期8 d，各組仔豬均自由采食人工奶(將奶粉與45～55 ℃溫水按照1∶5的比例沖泡混勻)，于每天08:00、11:00、15:00、18:00和21:00飼喂。于試驗第1～7天，每晚19:30給槲皮素+PEDV組仔豬口腔灌服槲皮素(溶于人工奶中，劑量為10 mg/kg BW[9-10])，對照組和PEDV組仔豬灌服同等體積的人工奶。于試驗第5天早上06:00稱重，晚上20:30向PEDV組和槲皮素+PEDV組仔豬口腔灌服PEDV(毒價為104.5TCID50，溶于PBS溶液中)，對照組仔豬灌服同等體積的PBS溶液。于試驗第7天晚上22:00斷水?dāng)嗔希?天早上06:00空腹稱重，然后用戊巴比妥鈉(50 mg/kg BW)肌肉注射麻醉并屠宰取樣。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗在武漢市畜牧獸醫(yī)研究所的三級生物安全實驗室進(jìn)行，試驗開始前對豬舍豬籠及墻面地面進(jìn)行徹底清洗和消殺，并對整個空間進(jìn)行熏蒸消毒。試驗期間保持溫度穩(wěn)定在26～28 ℃，使用動物房的通風(fēng)系統(tǒng)保持空氣流動,對照組仔豬與PEDV感染仔豬分豬舍飼養(yǎng)，嚴(yán)格控制對照組和攻毒組之間的接觸，保證不會出現(xiàn)交叉感染。每個組的豬籠配有單獨的保溫?zé)艉筒讳P鋼料盆，每次進(jìn)出喂食和觀察之后都要進(jìn)行消毒且每天早晚對豬舍各進(jìn)行1次清洗，并使用戊二醛癸甲溴銨、聚維酮碘、百毒殺等消毒液進(jìn)行交替消殺。每天觀察和記錄仔豬的采食情況、精神狀態(tài)及腹瀉狀況。

1.4 樣品采集與處理

于試驗第8天屠宰取樣，將仔豬麻醉后置于冰板上解剖，取出十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸，用生理鹽水將每段腸道清洗干凈并用濾紙吸干，每個腸段剪取3和10 cm左右的相鄰兩小段，3 cm腸段放入4%的甲醛溶液中固定，經(jīng)過石蠟包埋和HE染色后制成病理切片待后續(xù)腸絨毛形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察；10 cm腸段沿腸系膜縱向剪開，用生理鹽水清洗干凈，將洗凈的腸段放置于冰板上用濾紙吸干并剪碎，用滅菌錫箔紙包裝3～5包并放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃凍存待測。

1.5 測定指標(biāo)與方法

1.5.1 小腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu) 參照Frankel等[11]方法測量腸絨毛的相關(guān)數(shù)據(jù)，每張腸道切片選取8根長度最長、輪廓清晰且結(jié)構(gòu)完整的腸絨毛，采用OLYMPSBX-41TF型顯微鏡和千屏高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)[12]測量仔豬小腸的絨毛高度、隱窩深度以及絨毛高度與隱窩深度的比值。

1.5.2 腸道抗氧化指標(biāo) 測定十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸的過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、髓過氧化物酶(MPO)活性和MDA含量，以上指標(biāo)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5.3 空腸脂質(zhì)代謝功能相關(guān)基因相對表達(dá)量 各檢測基因的引物序列見表2。用核糖體蛋白L4(RPL4)基因作為內(nèi)參，檢測載脂蛋白A1(APOA1)、載脂蛋白B(APOB)、載脂蛋白C2(APOC2)、脂肪酸結(jié)合蛋白2(FABP2)、酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員3(ACSL-3)和脂肪酸合酶(FASN)基因的相對表達(dá)量。將空腸組織樣品于液氮中研磨，用RNAiso Plus試劑提取總RNA，并使用微量核酸蛋白測定儀(NanoDrop 2000)測定RNA的濃度和純度。根據(jù)PrimeScript?RT Reagent Kit with gDNA Eraser操作步驟將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseHPlus)試劑盒方法配制實時熒光定量PCR反應(yīng)體系(以上試劑盒均購自TaKaRa公司)，反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。參照Fu等[13]方法計算、分析檢測結(jié)果。

表2 引物信息

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，探究槲皮素對PEDV感染仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、腸道抗氧化能力以及空腸脂代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響，差異顯著時采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，以P<0.01作為差異極顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素對PEDV感染仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

由圖1可知，與對照組相比，PEDV組仔豬空腸和回腸的絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度比值極顯著降低(P<0.01)；與PEDV組相比，槲皮素+PEDV組仔豬空腸和回腸的絨毛高度及絨毛高與隱窩深度比值極顯著提高(P<0.01)。

與對照組相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01);無*表示差異不顯著(P>0.05)。與PEDV組相比，#，差異顯著(P<0.05)；##，差異極顯著(P<0.01);無#表示差異不顯著(P>0.05)。下同

通過觀察仔豬小腸光學(xué)切片圖像發(fā)現(xiàn)，對照組仔豬小腸絨毛相對比較整齊規(guī)則，隱窩較淺、結(jié)構(gòu)清晰；與對照組相比，PEDV組空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重，絨毛基本全部脫落，隱窩較深、輪廓欠清晰；與PEDV組相比，槲皮素+PEDV組空腸絨毛損傷程度較輕，部分絨毛結(jié)構(gòu)相對完整。圖2為選取的各組仔豬空腸光學(xué)切片圖像。

圖2 各組仔豬空腸光學(xué)切片圖像(100×)

2.2 槲皮素對PEDV感染仔豬腸道抗氧化指標(biāo)的影響

由表3可知，與對照組相比，PEDV組仔豬空腸、回腸和結(jié)腸中GSH-Px和T-SOD活力均顯著降低(P<0.05)，十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸中CAT活力顯著降低(P<0.05)，回腸和結(jié)腸中MDA含量顯著增加(P<0.05)。

表3 各組仔豬腸道抗氧化指標(biāo)測定結(jié)果

續(xù)表

與PEDV組相比，槲皮素+PEDV組仔豬空腸、回腸和結(jié)腸中GSH-Px和T-SOD活力顯著提高(P<0.05)，十二指腸、空腸和結(jié)腸中CAT活力顯著提高(P<0.05)，回腸和結(jié)腸中MDA含量顯著減少(P<0.05)。

2.3 槲皮素對PEDV感染仔豬空腸脂質(zhì)代謝功能相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

由表4可知，與對照組相比，PEDV組仔豬空腸中APOA1、APOB、APOC2、FABP2、ACSL-3和FASN基因的相對表達(dá)量均極顯著下調(diào)(P<0.01)；與PEDV組相比，槲皮素+PEDV組仔豬空腸中APOB、FABP2和FASN基因的相對表達(dá)量均極顯著上調(diào)(P<0.01)。

表4 各組仔豬空腸脂代謝相關(guān)基因表達(dá)量測定結(jié)果

3 討 論

3.1 槲皮素對PEDV感染仔豬腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

保持腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性對維持仔豬的腸道屏障功能十分重要。腸道屏障不僅是動物機(jī)體自身免疫系統(tǒng)的一個主要組成部分，還是動物機(jī)體防御外來病菌侵襲皮膚黏膜時的第一道天然有效的防護(hù)屏障[14]。新生仔豬由于腸道結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育并不完全，容易受到外界因素的刺激而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，因此極易被PEDV感染，進(jìn)而導(dǎo)致仔豬腸道受損以及腸絨毛萎縮脫落并引發(fā)腹瀉。槲皮素屬于黃酮類物質(zhì)，有研究表明，在日糧中添加適量黃酮類物質(zhì)，可以有效改善仔豬的腸道環(huán)境，緩解因斷奶等引起的應(yīng)激反應(yīng)，提高畜禽的生產(chǎn)性能。大豆異黃酮可以維持腸道中微生物的平衡，提高機(jī)體對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，改善仔豬斷奶期間的應(yīng)激狀況[15]。竹葉黃酮可以有效地緩解仔豬的腹瀉癥狀，促進(jìn)腸道的自我修復(fù)，提高仔豬對飼料的吸收利用和平均日增重，從而改善仔豬的生產(chǎn)性能[16]。絨毛高度、隱窩深度和絨毛高度與隱窩深度比值是衡量腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)，已有研究表明，在仔豬飼料中添加槲皮素可以促進(jìn)仔豬腸上皮細(xì)胞的增殖，增加豬腸上皮絨毛的數(shù)量，維持腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性[17]。其途徑可能是由于黃酮類化合物可以抑制細(xì)胞的凋亡，降低機(jī)體腫瘤壞死因子α的表達(dá)，從而促進(jìn)損傷部位愈合[18]。

本試驗結(jié)果顯示，PEDV組仔豬空腸、回腸的絨毛高度以及絨毛高度與隱窩深度的比值顯著降低，這表明PEDV感染破壞了仔豬正常的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。而口腔灌服槲皮素緩解了因PEDV感染引起的仔豬空腸、回腸的絨毛高度以及絨毛高度與隱窩深度比值的降低，表明槲皮素可以緩解因PEDV感染引起的腸道損傷，對仔豬維持正常的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)有一定的作用。

3.2 槲皮素對PEDV感染仔豬腸道抗氧化指標(biāo)的影響

PEDV感染仔豬后會激活腸道上皮細(xì)胞合成和釋放細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，抑制抗氧化酶類的活性，導(dǎo)致機(jī)體脂質(zhì)過氧化并產(chǎn)生大量氧自由基，進(jìn)而對細(xì)胞造成氧化損傷[19-20]。槲皮素屬于黃酮類化合物，富含酚羥基，能夠提供大量的氫離子與機(jī)體代謝產(chǎn)生的氧自由基相結(jié)合進(jìn)而有效清除自由基，還可以通過有效控制氧化酶的活性和有效提高抗氧化酶的氧化活力來進(jìn)一步發(fā)揮其抗氧化作用[19]。黃思瑩等[6]通過探索桑葉槲皮素對D-半乳糖衰老小鼠抗氧化能力的研究發(fā)現(xiàn)，高劑量桑葉槲皮素組小鼠血清中T-AOC水平、GSH-Px和SOD活性顯著提高，MDA含量顯著減少;另有研究表明，在冷凍保護(hù)劑中添加槲皮素能夠提高羊卵巢組織的CAT活性[21];占今舜等[22]研究發(fā)現(xiàn)，添加槲皮素能夠顯著提高LPS刺激下山羊瘤胃細(xì)胞T-AOC、CAT、SOD和GSH-Px的活性。這些研究表明槲皮素能夠通過提高抗氧化酶類活性來緩解氧化損傷。

本試驗發(fā)現(xiàn)，PEDV組仔豬腸道氧化產(chǎn)物MDA的含量顯著增加，仔豬腸道CAT、T-SOD、GSH-Px等氧化相關(guān)酶的活性顯著降低。說明PEDV感染降低了仔豬腸道抗氧化能力，造成了機(jī)體的氧化損傷?？谇还喾纹に啬軌蚓徑釶EDV感染導(dǎo)致的仔豬腸道MDA含量增加和CAT、T-SOD、GSH-Px活性降低，說明槲皮素對PEDV感染導(dǎo)致的仔豬腸道氧化損傷有緩解作用，能夠提高仔豬腸道的抗氧化能力。

3.3 槲皮素對PEDV感染仔豬空腸脂質(zhì)代謝功能相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

已有研究證明，PEDV感染會引起仔豬嚴(yán)重腹瀉甚至死亡，也會造成小腸絨毛損傷，導(dǎo)致仔豬腸道吸收功能出現(xiàn)障礙。脂質(zhì)是機(jī)體重要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，脂質(zhì)的吸收以及脂肪酸的運輸對機(jī)體的生長至關(guān)重要。載脂蛋白(APO)是一類能夠結(jié)合和運輸血脂到機(jī)體各組織進(jìn)行代謝及利用的蛋白質(zhì)，在脂質(zhì)的儲存與轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要作用[23]。脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)的主要功能是參與長鏈脂肪酸的攝取、細(xì)胞內(nèi)的代謝和運輸，同時也參與細(xì)胞生長與增殖過程[24]。FASN可以催化乙酰輔酶A和丙二酸單酰輔酶A合成脂肪酸，在脂肪的代謝過程中發(fā)揮著重要作用[25]。有研究表明，在肉雞飼糧中添加槲皮素可以通過影響脂肪消化和吸收、脂肪酸代謝、AMPK信號通路來調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，進(jìn)而提高肉品質(zhì)[26]。此外，已有研究證明槲皮素能夠促進(jìn)畜禽對蛋白質(zhì)、脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[27-28]，也能夠提高雞蛋中蛋白質(zhì)含量[29]。而槲皮素對PEDV感染仔豬造成的脂質(zhì)代謝功能障礙是否有緩解作用還未見報道。

本課題組前期通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)PEDV感染仔豬后差異表達(dá)蛋白(DEPs)參與的通路富集主要集中在氨基酸及其衍生物代謝和脂質(zhì)代謝等。本試驗結(jié)果顯示，PEDV組仔豬脂質(zhì)吸收代謝相關(guān)基因的表達(dá)量顯著下調(diào)，說明病毒感染破壞了仔豬腸道的脂代謝通道，這與前期研究結(jié)果一致，而添加槲皮素緩解了因PEDV感染導(dǎo)致的仔豬空腸APOB、FABP2和FASN基因相對表達(dá)量的下調(diào)，促進(jìn)了機(jī)體對脂肪的代謝和吸收，說明槲皮素對PEDV感染導(dǎo)致的脂代謝功能損傷有緩解作用。

4 結(jié) 論

槲皮素能夠緩解仔豬因PEDV感染導(dǎo)致的腸道損傷，改善了小腸的吸收功能；緩解因PEDV感染造成的氧化損傷，提高了機(jī)體的抗氧化能力；緩解因PEDV感染導(dǎo)致的脂代謝功能損傷，促進(jìn)機(jī)體對脂肪的吸收與代謝。