高也凡，宋哈楠，王育南，吳 月，牛銳利，宗憲春，關偉軍

(1.中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193；2.佳木斯大學，佳木斯 154007；3.牡丹江師范學院生命科學與技術學院，牡丹江 157011)

角膜緣干細胞(LSCs)在未分化的狀態(tài)下具有無限自我更新的特性[1]。Dua等[2]研究發(fā)現(xiàn)，LSCs具有較長的存活時間并表現(xiàn)出高度的自我更新和增殖能力。但由于種屬差異、動物年齡及培養(yǎng)基和生長微環(huán)境不同，LSCs增殖潛能和維持干燥度也有所不同。對于分離的LSCs多選擇DMEM/F12培養(yǎng)基，其中的鈣離子有利于干細胞的貼壁生長[3]。此外，研究發(fā)現(xiàn)胎牛血清(FBS)能促進干細胞的生長，抑制角膜上皮細胞的增殖；10-9～10-7mmol/L視黃酸(RA)能促進LSCs的克隆形成率，表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、神經生長因子(NGF)、霍亂毒素等多種生長因子能調節(jié)干細胞的生長與分化[4]。對于不同物種來源的LSCs，所使用的分離方法和培養(yǎng)體系也有所不同。殷吉慶[5]以分散酶聯(lián)合胰酶法獲得山羊角膜緣干細胞(GLSCs)，使用添加20%條件培養(yǎng)基、10% FBS、20 ng/mL EGF及谷氨酰胺、胰島素、氫化可的松、腺嘌呤和三碘甲腺原氨酸的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)GLSCs。馮雪倩[6]研究發(fā)現(xiàn)，2～6月齡貓角膜緣上、下象限是體外分離貓LSCs最佳取樣點；使用混合酶消化法聯(lián)合組織塊貼壁法分離貓LSCs效果最好，使用含20 ng/mL EGF、10 μg/mL胰島素及10% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)貓LSCs，細胞可保持高活性、高增殖率。顧國貞等[7]通過胰蛋白酶消化法分離得到兔LSCs，用含15% FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)液進行體外培養(yǎng)。

迄今為止，已經報道了許多LSCs標志物，陽性標志物有細胞周期調控蛋白ΔNp63a、ATP結合盒轉運蛋白(ABCG2)和整合素α9，而陰性標志物有巢蛋白、E-鈣黏蛋白、連接蛋白43、外皮蛋白分化相關的蛋白(細胞角蛋白3(CK3)、CK12等)[8-9]。郭志侯[10]首次揭示了小鼠LSCs標志物表達的時間光譜，證明其標志物表達所特有的時間性。LSCs在不同誘導條件下可分化為軟骨細胞、骨細胞、脂肪細胞、肝樣細胞、上皮細胞和胰島細胞。嚴會文等[11]通過分散酶聯(lián)合胰酶法分離得到大鼠LSCs，并發(fā)現(xiàn)在20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF細胞因子作用下，LSCs具有分化為神經干細胞樣細胞的能力，同時聯(lián)合使用RA可促進LSCs向神經干細胞樣細胞分化。因此，LSCs可作為組織工程創(chuàng)傷修復、細胞移植、支持造血、基因治療等研究的前體細胞，具有廣闊的臨床應用前景[12]。此外，試驗研究和臨床觀察表明，當角膜緣上皮部分缺失[13-14]或完全缺失[15-16]時，角膜上皮傷口愈合異常，會出現(xiàn)結膜化、血管化和慢性炎癥，造成嚴重的視力障礙[17]。LSCs可以進一步分化為角膜上皮細胞，在臨床上可用于重建角膜緣干細胞缺陷患者的整個角膜上皮[18-19]﹐然而角膜緣移植存在供體短缺的問題，因此，如何用體外培養(yǎng)的LSCs構建組織工程化的人工角膜上皮，并通過移植治療嚴重的眼表疾病成為近年來研究的熱點[20-21]。目前對于LSCs的研究以人源LSCs為主[22]，也有少量羊[23]、兔[24]、鼠[11]和貓[6]等來源。北京油雞是一種優(yōu)秀的中國本土品種，2001年被農業(yè)部列為國家級畜禽品種資源重點保護品種[25]。本試驗用10胚齡北京油雞雞胚角膜緣組織分離培養(yǎng)細胞，探究北京油雞LSCs體外分離培養(yǎng)、成骨、成軟骨分化潛能等生物學特性，以期為角膜損傷的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 10胚齡健康北京油雞雞胚由中國農業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平實驗基地種禽場提供。

1.1.2 主要試劑 bFGF、EGF、胰島素-轉鐵蛋白-硒(ITS-G)、分散酶Ⅱ(dispaseⅡ)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、胰蛋白酶、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、谷氨酰胺(Gln)均購自Sigma公司；FBS、GlutaMAXTM添加劑、DMEM/F12培養(yǎng)基、乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA二鈉鹽)均購自Gibco公司；茜素紅、阿利新藍、油紅染色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；p63、ABCG2、CK19和CK3/CK12單克隆抗體均購自Abcam公司；山羊抗兔FITC標記二抗、山羊血清均購自北京中山金橋生物技術有限公司；多聚甲醛來自北京化工廠；Trizol購自Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、PCR MasterMix均購自TaKaRa公司。

1.2 細胞的分離培養(yǎng)和傳代

取10胚齡北京油雞雞胚，鈍性剝離眼周皮肉及筋膜組織，取出完整眼球后用含青-鏈霉素的PBS清洗。沿角膜緣環(huán)形剪開結膜和結膜下筋膜后﹐沿角膜緣內外各1 mm環(huán)形剪取角膜緣組織，將剪下的角膜緣組織放入含青-鏈霉素的PBS中。將剪下的角膜緣組織剪成1 mm3的組織塊，用含青-鏈霉素的PBS反復沖洗，加1.2 U/mL分散酶Ⅱ，37 ℃消化1 h，然后用0.25%胰酶消化10 min，用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。1 200 r/min離心10 min，棄上清，沉淀加培養(yǎng)基反復吹打混勻，過200目篩，將細胞密度調整為1×106/mL，接種到60 mm培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞匯合至80%時，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化，觀察細胞形態(tài)，當有大量細胞收縮變圓發(fā)亮時，用完全培養(yǎng)基(DMEM/F12+10% FBS+1% Gln+1% ITS-G+10 ng/mL bFGF+20 ng/mL EGF)終止消化，按1∶2的比例進行傳代，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.3 生長曲線繪制

取培養(yǎng)至第5、15、25代生長狀態(tài)良好的細胞，用0.25%的胰酶消化后用完全培養(yǎng)基配成單細胞懸液，按1×104/mL接種于24孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天隨機取3孔細胞計數并計算均值，連續(xù)7 d。以培養(yǎng)時間為橫軸，細胞數為縱軸，繪制生長曲線。根據曲線計算可得細胞的群體倍增時間(population doubling time,PDT)。

PDT=(t-t0) lg2/(lgNt-lgN0)

式中，t為對數生長期結束時間；t0為對數生長期開始時間；Nt為對數生長期結束時細胞數量；N0為對數生長期開始時的細胞數量。

1.4 免疫熒光檢測表面標記物

取培養(yǎng)至第2代的細胞，當細胞匯合度達60%時，棄培養(yǎng)基，PBS洗3次。用4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次。用0.25% Triton X-100通透15 min，PBS洗2次。10%山羊血清封閉1 h。棄封閉液，加入兔抗雞ABCG2(1∶100)、p63(1∶100)、CK19(1∶100)單克隆一抗，4 ℃孵育過夜。PBS洗3次，避光加入FITC標記的山羊抗兔lgG (1∶100)二抗，室溫孵育1 h，PBS洗3次，1 μg/mL DAPI避光染核20 min，PBS洗3次。用激光掃描共聚焦顯微鏡(TE-2000-E，Nikon公司)觀察并拍照。

1.5 RT-PCR檢測表面標記物

選取第5、15和25代細胞，用Trizol法提取細胞總RNA并反轉錄合成cDNA。根據GenBank中p63、CK19、ABCG2、CD45、骨橋蛋白(OPN)、Ⅰ型膠原蛋白(Col-Ⅰ)、性別決定區(qū)Y框9(Sox9)、Col-Ⅱ和GAPDH基因的序列，用Oligo軟件和NCBI-BLAST設計特異性引物，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系25 μL：dNTP(2.5 mol/L) 2 μL，上、下游引物各1 μL，10×Buffer 2.5 μL，cDNA模板1.5 μL，EX-TaqHS 0.25 μL，ddH2O 16.75 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火(退火溫度見表1)30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.6%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

表1 引物信息

1.6 成骨誘導分化及鑒定

當第6代細胞匯合度達80%～90%時，隨機分為誘導組和對照組。對照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導組用成骨細胞誘導液(10 mmol/L地塞米松+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+50 mg/L抗環(huán)血酸+10% FBS+DMEM/F12)培養(yǎng)，每3 d換1次誘導液。誘導21 d后進行茜素紅染色。按1.5中RT-PCR方法檢測骨細胞特異性基因OPN和Col-Ⅰ的表達情況。

1.7 成軟骨誘導分化及鑒定

當第6代細胞匯合度達70%時，隨機分為誘導組和對照組，對照組用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導組用成軟骨細胞誘導液(DMEM/F12+10% FBS+0.1 μmol/L地塞米松+10 ng/mL TGF-β1+0.9 mmol/L丙酮酸鈉+50 μg/mLL-脯氨酸+50 μg/mL 維生素C+1% ITS)培養(yǎng)，每3 d換1次誘導液，誘導21 d后進行阿利新藍染色。按1.5中RT-PCR方法檢測軟骨細胞特異性基因Sox-9和Col-Ⅱ的表達。

2 結 果

2.1 細胞生長特性

2.1.1 細胞形態(tài) 用分散酶Ⅱ聯(lián)合胰酶法消化角膜緣組織獲得的細胞接種培養(yǎng)15 h后為圓形或不規(guī)則形狀并開始貼壁。細胞貼壁后生長很快，2～4 d成片生長，5～6 d匯合成單層(圖1A)。傳代培養(yǎng)時，細胞貼壁時間較原代細胞短，12 h內可見大量細胞貼壁，細胞形態(tài)呈多角形(圖1B)，傳至第10代時細胞形態(tài)無明顯改變(圖1C)，細胞仍具有較強的增殖活力。隨著傳代次數的增多，細胞貼壁時間延長，細胞體積增大，胞內空泡增多，脂褐質沉積增多，增殖活力逐漸下降，細胞逐漸變扁變長(圖1D)。

A，培養(yǎng)15 h的原代細胞；B，培養(yǎng)5～6 d的原代細胞；C，第10代細胞；D，第24代細胞

2.1.2 生長曲線及群體倍增時間 由圖2可知，第5和10代細胞生長狀況相近，第0～2天細胞處于潛伏適應期，第3～5天快速增殖，進入對數生長期，第5～7天達到平臺期，第7天后進入衰退期。第20代細胞第0～2天也處于潛伏期，但潛伏期后，細胞增殖能力與第5和10代細胞相比明顯下降，到達平臺期的細胞明顯減少。第5、10和20代細胞的群體倍增時間分別為34.14、37.38和39.37 h。

圖2 分離細胞的生長曲線

2.2 分離細胞的鑒定

2.2.1 免疫熒光檢測表面標記物 由圖3可知，分離的細胞表達LSCs特異性表面標記物p63、ABCG2和CK19，不表達CK3和CK12，符合LSCs特異性，表明分離的細胞為LSCs。

圖3 分離細胞表面標志物免疫熒光檢測(40×)

2.2.2 RT-PCR檢測LSCs表面標志物 由圖4可知，分離的北京油雞LSCs表達p63、CK19和ABCG2，不表達CD45。

M，DL1000 DNA Marker；1～5，GADPH-1、ABCG2、p63、CK19、CD45基因

2.2.3 成骨誘導分化 與對照組(圖5A)相比，在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)21 d的北京油雞胚胎LSCs有礦化鈣結節(jié)產生，并且積累的鈣結節(jié)可被茜素紅S(陽性)染紅(圖5B)。RT-PCR檢測結果顯示，誘導后的北京油雞LSCs高表達成骨關鍵基因OPN和Col-Ⅰ，而在對照組細胞中則未檢測到這2個基因(圖5C)。

①A，對照組細胞茜素紅S染色(40×)；B，誘導組細胞茜素紅S染色(40×)；C，骨細胞RT-PCR檢測。②M，DL1000 DNA Marker；1～3，誘導組GAPDH-2、OPN和Col-Ⅰ基因；4～6，對照組GAPDH-2、OPN和Col-Ⅰ基因

2.2.2 成軟骨誘導分化 與對照組(圖6A)相比，在軟骨形成培養(yǎng)基中孵育21 d的北京油雞胚胎LSCs有軟骨組織產生，并且可被阿利新藍染成藍色(圖6B)。RT-PCR結果表明，誘導后的北京油雞LSCs表達成軟骨關鍵基因Col-Ⅱ和SOX-9，而對照組細胞中則未檢測到這2個基因(圖6C)。

①A，對照組細胞阿利新藍染色(40×)；B，誘導組細胞阿利新藍染色(40×)；C，軟骨細胞RT-PCR檢測。②M，DL1000 DNA Marker；1～3，誘導組GAPDH-2、Col-Ⅱ、SOX-9基因；4～6，對照組GAPDH-2、Col-Ⅱ、SOX-9基因

3 討 論

LSCs的分離方法主要有組織塊貼壁法和酶消化法，酶消化法是從組織中分離干細胞的穩(wěn)定方法[26]，而組織塊貼壁法耗時較長，且由于雞胚的角膜緣組織較其他器官組織堅硬，分離率較低，故本試驗采取分散酶Ⅱ聯(lián)合胰酶法消化北京油雞雞胚角膜緣組織獲得細胞，此方法得到的細胞產量高，培養(yǎng)成功率高。雞胚的眼球在孵化至第5天時出現(xiàn)黑色素，形成淡灰色圓圈[27-28]，第7天時眼球增大，第10天瞬膜和眼瞼出現(xiàn)，至第18天時睜眼[29]。10胚齡時眼球各部分已完整形成，且組織柔軟，便于消化，可分離出大量細胞。隨著胚齡的增大，眼球組織變硬，經過分散酶Ⅱ聯(lián)合胰酶消化后仍無法獲得大量細胞，故本試驗選擇10胚齡北京油雞雞胚為研究對象。免疫熒光和RT-PCR鑒定結果均表明，分離的北京油雞LSCs中ABCG2、p63和CK19均呈陽性表達，符合LSCs的特性[30]。

研究表明，干細胞具有巨大的自我更新和增殖能力[31-32]。LSCs是具有自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，負責角膜上皮的更新，而角膜上皮完整性對于維持最佳視力所需的角膜透明度至關重要。分離的北京油雞LSCs在體外培養(yǎng)傳代26次，且第5、10、20代LSCs的生長曲線均表現(xiàn)出S形，說明細胞均經歷了潛伏適應期、對數生長期和平臺期這3個正常的細胞生長周期[33]。剛開始培養(yǎng)時，由于細胞密度低及由酶引起的損傷的恢復，LSCs的生長速度極慢，經過2～3 d的潛伏適應期后，LSCs迅速增殖并進入對數生長期，培養(yǎng)后期由于細胞密度增加和接觸抑制而趨于穩(wěn)定進入平臺期[34]，表明分離的北京油雞LSCs具有強大的自我更新和增殖能力，與以往的研究一致[34-37]。

除了自我更新和增殖能力，LSCs在體外還具有多向分化潛能[38]。在北京油雞LSCs誘導成骨的培養(yǎng)基中，抗壞血酸鹽對于膠原蛋白合成和堿性磷酸酶(ALP)活性起到了重要作用[39]。抗壞血酸可以刺激Ⅰ型膠原蛋白的產生，Ⅰ型膠原蛋白是骨中主要的蛋白質成分，為鈣鹽、磷鹽等礦物質的沉積和礦化提供有利條件[40]，可以促進骨的形成[41]。β-甘油磷酸鈉可以提供磷，磷是ALP的反應底物，可以促進結節(jié)鈣化[42]。地塞米松對成骨分化具有重要的調控作用，高濃度的地塞米松可以促進堿性磷酸酶的形成[43]。本試驗成骨誘導液中添加抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松，成功誘導北京油雞LSCs向成骨方向分化，誘導21 d后細胞產生明顯的鈣結節(jié)，可被茜素紅S染成紅色，且誘導的細胞表達成骨關鍵基因OPN和Col-Ⅰ，而未添加誘導液的對照組細胞不表達這些基因。在北京油雞LSCs誘導成軟骨的培養(yǎng)基中添加了TGF-β1、地塞米松、抗壞血酸和丙酮酸鈉等。TGF-β1可在體外誘導干細胞向軟骨方向的分化，這個過程需要細胞-細胞和細胞-基質的作用，并涉及多個信號網絡的協(xié)調[44]。TGF-β1可以促進Ⅱ型膠原蛋白的合成。誘導21 d后，可見被阿利新藍染藍的軟骨組織，且誘導的細胞表達成軟骨關鍵基因SOX-9和Col-Ⅱ，而未添加誘導液的對照組細胞不表達這些基因。證明LSCs具有成骨和成軟骨的分化潛能，可以分化為多個胚層的細胞，同時表明LSCs的分化方向是由不同的誘導培養(yǎng)基決定的。

LSCs移植(LSCT)在治療角膜緣干細胞缺失癥和角膜燒傷等疾病中受到越來越多的關注，但供體組織的可用性仍然是影響所有移植的主要限制。目前關于LSCs異種移植的報道較少，如將兔來源LSCs移植到人的角膜上[46]，將大鼠來源LSCs移植到小鼠角膜表面損傷模型中[45]，將人來源LSCs移植到LSC缺陷小鼠模型中[47-48]，將兔來源LSCs移植到小鼠角膜堿燒傷模型中[49]，都證明LSCs能通過下調炎癥因子表達、上調抗炎因子表達等方式促進角膜損傷愈合，提高燒傷后角膜的透明度，甚至具有完全恢復角膜的能力[50]。有研究者推測來自轉基因豬的角膜或細胞的異種移植可能成為人類LSCs供體缺乏的解決方案之一[51]，禽類相比于豬來說養(yǎng)殖成本更低，取材也更方便，但尚未發(fā)現(xiàn)關于移植禽類LSCs治療角膜損傷或疾病的報道，未來禽類也許會成為更加合適的LSCs供體來源。

4 結 論

本試驗從10胚齡北京油雞雞胚中成功分離LSCs，且LSCs表達ABCG2、p63、CK19基因，不表達CK3、CK12基因及造血干細胞特異性基因CD45，LSCs可以誘導分化為成骨和成軟骨細胞。