任 靜，郝琴琴，成俊麗，朱芷葳，許冬梅，賈雪純，李鵬飛

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

牛是單胎動(dòng)物，每個(gè)發(fā)情周期內(nèi)通常只有一個(gè)優(yōu)勢卵泡能夠發(fā)育成熟，并最終排卵受精，其他卵泡則會(huì)在發(fā)育過程中走向閉鎖[1]。發(fā)情周期內(nèi)卵巢發(fā)育卵泡數(shù)量和質(zhì)量直接關(guān)系到母牛的繁殖性能。前期研究發(fā)現(xiàn)，由下丘腦分泌的可卡因-苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(cocaine and amphetamine regulated transcript peptide,CART)是卵泡發(fā)育過程中的重要調(diào)節(jié)因子，對(duì)牛卵泡發(fā)育起負(fù)調(diào)控作用[2-3]。CART通過下丘腦-垂體-卵巢軸作用于卵巢中的卵泡顆粒細(xì)胞(granulesa cells,GCs)，促進(jìn)GCs凋亡，最終導(dǎo)致卵泡閉鎖[4]，但目前對(duì)影響CART表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制鮮見報(bào)道。

microRNA(miRNA)是一種由20個(gè)左右的核苷酸組成的小分子非編碼RNA，能夠與靶基因的部分或全部序列以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式相結(jié)合，導(dǎo)致mRNA降解并抑制其翻譯。幾乎所有編碼mRNA產(chǎn)物的成熟序列都具有能夠與miRNA結(jié)合的反應(yīng)元件，表明miRNA在動(dòng)物生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用[5]。近年來大量研究表明，miRNA能夠調(diào)控卵泡發(fā)育，Wright等[6]發(fā)現(xiàn)，miR-21能夠抑制豬卵母細(xì)胞中程序性死亡因子PDCD4的表達(dá)進(jìn)而影響卵母細(xì)胞的發(fā)育；在豬卵泡膜細(xì)胞中，miR-1275可通過抑制芳構(gòu)化酶CYP19A1的表達(dá)來影響雌二醇(E2)分泌，促進(jìn)GCs凋亡[7]。Zhang等[8]對(duì)多胎和單胎綿羊下丘腦中mRNA和miRNA差異譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)促甲狀腺素釋放激素、促性腺素釋放激素和催乳素等與動(dòng)物生殖相關(guān)的激素，以及能夠調(diào)控這些激素表達(dá)的miRNA，如oar-miR-379-5p、oar-miR-152、oar-miR-432等均存在差異表達(dá)；進(jìn)一步構(gòu)建相應(yīng)的下丘腦miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，miRNA通過調(diào)控下丘腦中激素分泌影響卵泡發(fā)育，并對(duì)綿羊繁殖能力產(chǎn)生影響。以上結(jié)果表明，miRNA在不同動(dòng)物體內(nèi)的不同部位發(fā)揮作用，對(duì)卵泡發(fā)育相關(guān)激素合成及其分泌產(chǎn)生影響，進(jìn)而調(diào)控卵泡發(fā)育。

本研究在明確bta-miR-377與CART 3′-UTR區(qū)靶向結(jié)合關(guān)系的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究bta-miR-377對(duì)CART表達(dá)的調(diào)控作用。通過探討bta-miR-377與牛CART 3′-UTR區(qū)的靶向作用關(guān)系及作用效果，明確牛下丘腦CART表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制，完善分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

于山西文水縣肉牛屠宰場選擇3頭正常發(fā)情的健康西門塔爾母牛，屠宰后采集下丘腦組織，用滅菌DPBS洗滌2次后投入液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2 主要試劑和儀器

293T和PC12細(xì)胞均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存；pGP-miRGLO質(zhì)粒購自Promega公司；miRNA莖環(huán)法第一鏈cDNA合成試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；2×TaqPCR MasterMix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TransIntroTMEL購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司。GloMax Multi酶標(biāo)儀購自Promega公司；熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 生物信息學(xué)分析 利用RNAhybrid軟件預(yù)測并分析牛CART mRNA 3′-UTR區(qū)與bta-miR-377的結(jié)合情況及其二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過TargetScan數(shù)據(jù)庫在線預(yù)測多個(gè)物種CART mRNA 3′-UTR區(qū)與bta-miR-377的結(jié)合位點(diǎn)；并對(duì)bta-miR-377與大鼠miR-377(rno-miR-377)進(jìn)行序列相似性比對(duì)。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 在NCBI中查詢獲得牛CART mRNA序列(GenBank登錄號(hào)：NM_001007820)，在miRBase數(shù)據(jù)庫中查詢獲得bta-miR-377、rno-miR-377-3p、rno-miR-377-5p成熟序列，根據(jù)牛CART mRNA基因組預(yù)測序列及bta-miR-377成熟序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3.3 下丘腦組織總RNA提取及PCR擴(kuò)增 利用Trizol法提取牛下丘腦組織總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用莖環(huán)法對(duì)bta-miR-377的表達(dá)進(jìn)行分析，參照說明書配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL：2×miRNA L-RT Solution mix 10 μL，miRNA L-RT Enzyme mix 1.5 μL，總RNA 4 μL，bta-miR-377 RT引物1 μL，RNase-free ddH2O 3.5 μL。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：16 ℃ 30 min，37 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min使酶失活。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×TaqMasterMix 10 μL，cDNA 3 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 4 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，退火1 min(溫度見表1)，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。

表1 引物信息

1.3.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)bta-miR-377成熟序列的種子區(qū)域獲取靶位點(diǎn)突變的插入序列，由上海吉瑪公司合成野生型和突變型插入片段(圖1)及bta-miR-377 mimics，用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和SacⅠ切割目的片段和骨架載體pGP-miRGLO，將經(jīng)過連接回收并純化后的切割產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選取經(jīng)藍(lán)白斑篩選并測序正確的菌落進(jìn)行質(zhì)粒抽提，野生型與突變型重組質(zhì)粒分別命名為pGP-CART-WT和pGP-CART-Mut。

方框部分表示bta-miR-377對(duì)應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)和突變位點(diǎn)

1.3.5 雙熒光素酶報(bào)告載體試驗(yàn) 將構(gòu)建好的雙熒光素酶報(bào)告載體與bta-miR-377 mimics參照TransIntroTMEL的操作說明共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)30 h后裂解細(xì)胞，用雙熒光素酶檢測試劑盒測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。

1.3.6 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 選擇處于對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，以5×105/孔的密度接種于6孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用DMEM培養(yǎng)基分別稀釋bta-miR-377 mimics、NC mimics和轉(zhuǎn)染試劑，室溫孵育5 min后再混合孵育20 min，加入6孔板中。將細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)6 h后更換正常培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h。

1.3.7 牛CART基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 提取上述PC12細(xì)胞中的總RNA，參照1.3.3中方法對(duì)轉(zhuǎn)染bta-miR-377 mimics的試驗(yàn)組及轉(zhuǎn)染NC mimics的陰性對(duì)照組中的bta-miR-377進(jìn)行特異性擴(kuò)增，檢測bta-miR-377的表達(dá)情況，對(duì)轉(zhuǎn)染效果進(jìn)行判斷。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)試驗(yàn)組及對(duì)照組中牛CART基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測，并以β-actin作為內(nèi)參基因，引物信息見表1。PCR反應(yīng)體系10 μL：2×TB Green Premix ExTaqⅡ 5 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 3.2 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算CART mRNA在PC12細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.8 Western blotting檢測CART蛋白表達(dá) 將bta-miR-377 mimics、NC mimics分別與CART過表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量后取50 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(分離膠10%，濃縮膠5%)、轉(zhuǎn)膜、室溫下封閉后，加入CART抗體(1∶500稀釋)過夜孵育，加入山羊抗小鼠二抗(1∶5 000稀釋)搖床孵育1 h；滴加化學(xué)發(fā)光液后進(jìn)行顯影并采集圖像，利用Image J對(duì)圖像進(jìn)行分析，計(jì)算CART蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析 每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)組，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，對(duì)雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，并利用GraphPad Prism 9.0軟件繪制直方圖。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 牛CART與bta-miR-377靶向結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

經(jīng)TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測確定bta-miR-377能夠靶向結(jié)合牛CART 3′-UTR區(qū)，結(jié)合位點(diǎn)在161―167 bp區(qū)域，信噪比為-0.42(圖2)，表示結(jié)合性較強(qiáng)；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在包括大鼠在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物中，bta-miR-377與CART 3′-UTR區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)高度保守，序列為UGUGUGAA。

圖2 bta-miR-377與CART 3′-UTR結(jié)合位點(diǎn)及信噪比

利用RNAhybrid軟件進(jìn)一步預(yù)測二者結(jié)合的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，bta-miR-377的種子序列2～8 nt與牛CART 3′-UTR區(qū)完全互補(bǔ)配對(duì)，位于5′-端的首個(gè)核苷酸所對(duì)應(yīng)的靶基因的核苷酸為A，且結(jié)合位點(diǎn)最小自由能為-90 kJ/mol(圖3)，符合靶位點(diǎn)預(yù)測條件。

圖3 bta-miR-377與牛CART 3′-UTR結(jié)合的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.2 bta-miR-377與rno-miR-377序列相似性比對(duì)

bta-miR-377與rno-miR-377序列比對(duì)結(jié)果顯示，miR-377在牛與大鼠中的種子區(qū)序列不一致，保守性較低，表明PC12細(xì)胞中內(nèi)源的rno-miR-377不會(huì)影響bta-miR-377與CART 3′-UTR的結(jié)合，對(duì)后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果無影響，故在本研究的細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中不必設(shè)計(jì)inhibitor組。

2.3 牛下丘腦bta-miR-377與CART基因內(nèi)源性表達(dá)分析

以牛下丘腦cDNA為模板，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，bta-miR-377經(jīng)莖環(huán)法特異性擴(kuò)增后產(chǎn)物條帶約為70 bp(圖4A)，CART基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶約為728 bp(圖4B)，均與預(yù)期結(jié)果相符。

M，DNA Marker；1～3，目的產(chǎn)物

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證靶標(biāo)關(guān)系

分別共轉(zhuǎn)染bta-miR-377 mimics與重組質(zhì)粒及空質(zhì)粒，并設(shè)置NC mimics作為陰性對(duì)照組。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒時(shí)bta-miR-377 mimics和NC mimics兩組間熒光活性無明顯差異(圖5)，表明試驗(yàn)體系穩(wěn)定，結(jié)果可靠。bta-miR-377 mimics+pGP-CART-WT共轉(zhuǎn)染的相對(duì)熒光素酶活性與NCmimics+pGP-CART-WT相比差異極顯著(P<0.01)，而pGP-CART-Mut與bta-miR-377共轉(zhuǎn)染時(shí)，其相對(duì)熒光素酶活性與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。表明bta-miR-377在CART基因3′-UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，CART是bta-miR-377的靶基因。

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)。下同

2.5 轉(zhuǎn)染后PC12細(xì)胞中bta-miR-377與CART的表達(dá)分析

PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，收集細(xì)胞提取總RNA，對(duì)bta-miR-377 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，bta-miR-377 mRNA在試驗(yàn)組中高表達(dá)，在對(duì)照組中無表達(dá)(圖6A)，與預(yù)期結(jié)果一致，說明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染bta-miR-377 mimics后的試驗(yàn)組與轉(zhuǎn)染NC mimics的對(duì)照組相比，試驗(yàn)組PC12細(xì)胞中CART基因mRNA表達(dá)量極顯著降低(P<0.01，圖6B)，表明bta-miR-377能夠抑制神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)源CART基因mRNA的表達(dá)。

M,DNA Marker；1～3，試驗(yàn)組PCR產(chǎn)物；4～6，對(duì)照組PCR產(chǎn)物

2.6 bta-miR-377對(duì)293T細(xì)胞中CART蛋白表達(dá)的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，與NC mimics相比，轉(zhuǎn)染bta-miR-377 mimics的293T細(xì)胞中的CART蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05，圖7)，表明bta-miR-377能夠在蛋白水平抑制CART的表達(dá)。

A，Western blotting檢測結(jié)果；B，Image J灰度分析結(jié)果

3 討 論

miRNA是一類在進(jìn)化上較為保守的內(nèi)源性非編碼RNA，一般由18～25個(gè)核苷酸組成，能夠與靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)、5′-UTR區(qū)或CDS區(qū)結(jié)合調(diào)控目的基因表達(dá)。miRNA的調(diào)控機(jī)制可分為兩類：與靶基因mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)導(dǎo)致其降解，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制表達(dá)；或與mRNA不完全互補(bǔ)配對(duì)直接抑制其翻譯，在翻譯水平抑制表達(dá)。目前對(duì)miRNA的研究主要集中在各類癌細(xì)胞的成因、擴(kuò)散及靶向藥物研發(fā)等方面[9-11]。miR-377是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的miRNA分子，對(duì)多種癌細(xì)胞生長具有抑制作用[12-14]，miR-377還能夠通過調(diào)控與血管生成相關(guān)因子VEGF的生成抑制大鼠缺血性腦損傷[15]；抑制miR-377表達(dá)可以減少由于藥物引起的心肌細(xì)胞凋亡[16]。在調(diào)控動(dòng)物卵泡發(fā)育方面，Zhang等[17]證實(shí)oar-miR-377和oar-miR-485-3p可與綿羊卵巢中的PTX3靶向結(jié)合，降低PTX3表達(dá)量，影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量。本研究發(fā)現(xiàn)，bta-miR-377與CART在牛下丘腦組織中均有表達(dá)，經(jīng)生物信息學(xué)手段和雙熒光素酶報(bào)告基因法明確二者靶向結(jié)合關(guān)系后，認(rèn)為bta-miR-377能夠在牛下丘腦中與CART基因mRNA的3′-UTR區(qū)靶向結(jié)合，影響CART的表達(dá)。

動(dòng)物卵泡在生長發(fā)育過程中所需的營養(yǎng)物質(zhì)主要由包裹在其外周的GCs提供，GCs的凋亡是卵泡閉鎖的一個(gè)重要表現(xiàn)[18]。下丘腦分泌的各類神經(jīng)肽能夠通過調(diào)控垂體中促性腺素分泌[19]、卵泡GCs增殖凋亡[20]、E2分泌[21-22]等過程調(diào)控動(dòng)物卵泡發(fā)育。前期研究發(fā)現(xiàn)，CART在牛優(yōu)勢卵泡中的含量低于從屬卵泡[3]；一定條件下體外培養(yǎng)牛卵泡GCs，在培養(yǎng)液中添加CART后會(huì)對(duì)GCs的生長和增殖產(chǎn)生影響，導(dǎo)致E2分泌被抑制[23-24]。經(jīng)進(jìn)一步高通量測序及免疫組化定位分析發(fā)現(xiàn)，CART基因mRNA及其多肽在不同發(fā)育階段牛卵泡GCs中表達(dá)量有顯著差異，在卵泡發(fā)育波出現(xiàn)偏差后，高表達(dá)的CART將抑制優(yōu)勢卵泡繼續(xù)發(fā)育，因此認(rèn)為CART對(duì)牛卵泡生長發(fā)育具有負(fù)調(diào)控作用[25]。近年來，為明確CART影響卵泡發(fā)育的作用機(jī)理，本課題組一直致力于篩選并鑒定位于牛卵泡GCs膜上的能夠與CART特異性結(jié)合并發(fā)揮調(diào)控作用的G蛋白偶聯(lián)受體[26-27]，而對(duì)牛下丘腦中CART表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制研究較少。

CART大量存在于哺乳動(dòng)物的下丘腦神經(jīng)核，能夠通過下丘腦-垂體-卵巢軸直接作用于卵巢GCs，因此，本研究選擇PC12細(xì)胞株作為細(xì)胞模型，該細(xì)胞株能夠在神經(jīng)生長因子的誘導(dǎo)下發(fā)生形態(tài)及生理功能的變化[28]，形成具有內(nèi)分泌功能的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，且具有易培養(yǎng)、易轉(zhuǎn)染等特點(diǎn)，因此常應(yīng)用于如帕金森病、阿爾茲海默癥等神經(jīng)元損傷或神經(jīng)系統(tǒng)疾病等方面的研究中[29]。目前，PC12細(xì)胞在對(duì)神經(jīng)分泌性物質(zhì)的研究中應(yīng)用廣泛，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)是一種抑郁癥標(biāo)志物，Zhang等[30]通過制備RNA依賴的腺嘌呤核苷脫氨酶1(ADAR1)過表達(dá)的PC12細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)ADAR1能夠通過調(diào)控miR-432轉(zhuǎn)錄顯著降低BDNF mRNA的表達(dá)豐度發(fā)揮抗抑郁作用；Zosen等[31]對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，證實(shí)了細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK1/2)對(duì)其多巴胺分泌的抑制作用。而CART作為一種已經(jīng)證實(shí)的神經(jīng)肽，被檢測到在PC12細(xì)胞中高表達(dá)[32]，本研究中生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，bta-miR-377與rno-miR-377之間的保守性較低，且bta-miR-377與牛和大鼠CART基因3′-UTR區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)序列相同，表明PC12細(xì)胞內(nèi)源的rno-miR-377不會(huì)影響bta-miR-377與大鼠CART基因3′-UTR區(qū)的結(jié)合，因此本研究選擇PC12細(xì)胞作為模式細(xì)胞是合理的，通過轉(zhuǎn)染miRNA mimics使bta-miR-377在PC12細(xì)胞中過表達(dá)，結(jié)果顯示PC12細(xì)胞中CART的表達(dá)被極顯著抑制，這與Western blotting檢測bta-miR-377對(duì)CART蛋白表達(dá)影響的試驗(yàn)結(jié)果一致，表明bta-miR-377能夠在基因和蛋白水平抑制CART的表達(dá)，是CART表達(dá)過程中的負(fù)調(diào)控因子，這將為深入探究CART在神經(jīng)元細(xì)胞中表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

在牛下丘腦中檢測到bta-miR-377與CART基因均有表達(dá)，bta-miR-377與CART基因3′-UTR區(qū)能夠靶向結(jié)合，經(jīng)細(xì)胞功能驗(yàn)證明確轉(zhuǎn)染bta-miR-377 mimics能夠抑制CART基因mRNA和蛋白表達(dá)，推測bta-miR-377能夠與CART基因3′-UTR區(qū)結(jié)合進(jìn)而影響CART基因mRNA轉(zhuǎn)錄。