劉 慧 張崇洋 劉世亮 周孟椋 吳苗苗 姜桂英 劉 芳 趙 穎

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 450002）

伴隨著城市化進(jìn)程的不斷加快，鋼筋水泥等建筑日益增多，綠地面積日漸減少，導(dǎo)致許多城市的高溫、干燥等環(huán)境愈加嚴(yán)重。屋頂綠化以其獨(dú)特的優(yōu)勢，如集中節(jié)約利用城市空間、增加綠地面積、提高生態(tài)環(huán)境質(zhì)量等受到更多的關(guān)注和快速發(fā)展[1-2]。但這獨(dú)特的立地條件使植物種植與地面隔離，缺少地下水補(bǔ)給，且光照強(qiáng)烈、夏天高溫、高風(fēng)速、水分揮發(fā)較快，對植物抗旱性要求非常高[3]。

小葉黃楊Buxus microphylla屬黃楊科黃楊屬植物，常綠灌木或小喬木，枝葉茂密、常青，有研究表明小葉黃楊具備較強(qiáng)的耐旱性[4]。近年來，有關(guān)干旱脅迫對小葉黃楊幼苗生理特性的影響主要在小葉黃楊的耗水規(guī)律和光合作用變化特征[5]、水分利用效率[6]等方面進(jìn)行了研究。對干旱脅迫下小葉黃楊保護(hù)酶活性、膜脂過氧化及滲透調(diào)節(jié)等方面研究較少。干旱脅迫往往會導(dǎo)致植物體內(nèi)活性氧（ROS）累積，進(jìn)而對植物造成氧化脅迫。為保護(hù)機(jī)體免受損害，植物進(jìn)化出了抗氧化系統(tǒng)以有效清除ROS，因此，植物葉片的抗氧化酶是植物抗逆性生理評價的重要指標(biāo)。在自然選擇和遺傳變異的雙重作用下，植物對干旱脅迫的抗性逐漸形成，這種抗逆性與植物的生理狀態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[7]。因此，研究不同干旱脅迫下小葉黃楊抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化，對了解小葉黃楊適應(yīng)干旱機(jī)制具有重要意義。本文通過對小葉黃楊在不同干旱脅迫條件下葉片抗氧化特性的變化特征進(jìn)行了研究，以期為小葉黃楊屋頂環(huán)境種植提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

在河南省鄭州市金水區(qū)硅谷廣場樓頂（E113°40′～113°47′，N34°50′～34°57′）進(jìn) 行 試 驗(yàn)，該區(qū)屬于溫帶季風(fēng)氣候，年平均氣溫14.8 ℃，降雨量586.1 mm，其中鄭州市6—8月降雨量達(dá)到322 mm，8月平均氣溫25.9 ℃，屋頂溫度最高可達(dá)50～55 ℃。

1.2 試驗(yàn)材料

供試小葉黃楊為兩年苗齡，由鄭州市陳寨花卉市場購得。

供試土壤采自鄭州市郊農(nóng)田土壤（0～20 cm），屬典型褐土，基本理化性質(zhì)如下：pH 7.79，EC值0.11 ms·cm-1，有機(jī)質(zhì)含量7.77 g·kg-1，堿解氮、有效磷、速效鉀含量44.97 mg·kg-1，7.44 mg·kg-1，62.16 mg·kg-1，田間持水量32.65%。

1.3 試驗(yàn)方法

于2019年6—9月進(jìn)行試驗(yàn)，選用高30 cm直徑40 cm的塑料盆，每盆裝土12.50 kg，移栽前施用2.50 kg的商品有機(jī)肥（有機(jī)質(zhì)≥45%，N+P2O5+K2O≥6%）。

試驗(yàn)共設(shè)4個土壤水分處理：正常水分處理，田間持水量的80%～90%（CK）；輕度干旱脅迫，田間持水量的60%～70%（TB）；中度干旱脅迫，田間持水量的50%～60%（TC）；重度干旱脅迫，田間持水量的35%～45%（TD）。每個處理設(shè)3次重復(fù)（即每個處理種植3盆），每盆種植1株小葉黃楊，進(jìn)行正常栽培管理，采用稱量法控制土壤含水量。

盆栽置于塑料大棚下，每天18:00時稱重補(bǔ)充水分。在移栽后0、20、40、60、80 d，采集由頂端往下第6～8片完全伸展葉，采集后迅速用液氮冷凍，置于-80 ℃冰箱保存，用于相關(guān)指標(biāo)測定。

1.4 項(xiàng)目測定

土壤pH、EC采用多參數(shù)分析儀（滬制02220142）測定；有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法—外加熱法測定；堿解氮含量采用堿解擴(kuò)散法測定；速效磷含量采用0.5 mol·L-1NaHCO3浸提—鉬銻抗比色法測定；速效鉀含量采用火焰光度法測定[8]。

葉片過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外分光光度法測定[9]；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測定[10]；超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性采用南京建成公司生產(chǎn)的SOD試劑盒和POD試劑盒測定[11]；可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定[9]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，使用WPS 2016軟件整理計(jì)算，不同干旱脅迫處理間各種指標(biāo)之間的差異由單因素方差分析中Duncan檢驗(yàn)完成，顯著水平為0.05。采用Origin 8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干旱脅迫處理對小葉黃楊葉片抗氧化酶活性的影響

2.1.1 超氧化物歧化酶（SOD）活性 由圖1可知，隨脅迫時間的延長，SOD活性變化趨勢呈升高-降低-升高，20 d時，不同干旱脅迫處理間SOD差異不顯著，但均顯著低于CK處理（P＜0.05），分別比CK處理降低了39.02%、31.44%、28.60%；40 d時，TB與TC處理的SOD活性達(dá)到最低，且顯著低于CK與TD處理（P＜0.05），TD與CK處理差異不顯著；60 d時，TB和TD處理SOD活性顯著低于CK處理（P＜0.05），TC與CK處理差異不顯著；80 d時，TC處理SOD活性最低為10.04 U·g-1，且僅TC處理顯著低于CK處理（P＜0.05）。

圖1 不同干旱脅迫處理下小葉黃楊葉片SOD活性的變化Fig.1 Change of SOD activity in B. microphylla leaves under different drought stress treatments

2.1.2 過氧化氫酶（CAT）活性 由圖2可知，隨干旱脅迫程度和脅迫時間的增加，小葉黃楊葉片CAT活性呈先升高后降低的變化趨勢。20 d時，TB、TC、TD處理的CAT活性均顯著低于CK處理（P＜0.05）；40 d時，TC處理CAT活性顯著高于CK處理（P＜0.05），TB和TD處理CAT活性也均高于CK處理，但差異不顯著；60 d和80 d時，各處理的CAT活性均顯著低于CK處理（P＜0.05）。其中，60 d時，CK處理CAT活性最高為19.27 U·g-1，分別比其他處理高了17.92%、24.37%、32.57%。

圖2 不同干旱脅迫處理下小葉黃楊葉片CAT活性的變化Fig.2 Change of CAT activity in B. microphylla leaves under different drought stress treatments

2.1.3 過氧化物酶（POD）活性 由圖3可知，隨干旱脅迫時間的延長，各處理的POD活性呈先升高后降低再升高的變化趨勢，在40 d達(dá)到峰值，分別比0 d增加了366.49%、461.06%、450.46%、335.35%；20 d時，不同干旱脅迫處理的POD活性均顯著低于CK處理（P＜0.05），而TC處理的POD活性顯著高于TB與TD處理（P＜0.05）；40 d時，TB和TC處理的POD活性顯著高于CK處理（P＜0.05），而TD處理的POD活性低于CK處理，但差異不顯著；60 d時TB、TC、TD處理的POD活性均顯著低于CK處理（P＜0.05）；80 d時，TB、TC、TD處理的POD活性分別比CK處理低了10.86%、14.75%、17.68%，且TC處理分別與TB、TD處理差異不顯著，TB和TD處理間差異顯著（P＜0.05）。

圖3 不同干旱脅迫處理下小葉黃楊葉片POD活性的變化Fig.3 Change of POD activity in B. microphylla leaves under different drought stress treatments

2.2 不同干旱脅迫處理對小葉黃楊葉片丙二醛（MDA）含量的影響

由圖4可知，隨干旱脅迫時間的延長，各處理的MDA含量大體上呈先降低后升高的變化趨勢，在干旱脅迫末期（80 d）均達(dá)最大值。與脅迫初期（0 d）相比，TB、TC、TD處理在脅迫末期（80 d）的MDA含量分別提高126.33%、1.46%、5.58%；20 d時，TB、TD處理的MDA含量顯著高于CK處理（P＜0.05），而TC處理的MDA含量略低于CK處理；40 d時，只有TB處理的MDA含量顯著高于CK處理（P＜0.05）；60 d時，TB、TC和TD處理的MDA含量顯著高于CK處理（P＜0.05）；80 d時，TB、TC和TD處理的MDA含量均顯著低于CK處理（P＜0.05）。此 外，80 d與60 d時 相 比，TB、TC和TD處理的MDA含量分別提高323.51%、109.95%、103.61%。

圖4 不同干旱脅迫處理下小葉黃楊葉片MDA含量的變化Fig.4 Change of MDA content in B. microphylla leaves under different drought stress treatments

2.3 不同干旱脅迫處理對小葉黃楊葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由圖5可知，隨著干旱脅迫時間的增加和程度的加深，小葉黃楊葉片可溶性蛋白質(zhì)含量整體趨勢先上升，60 d時達(dá)到峰值后下降。20 d時，TB、TC、TD處理的可溶性蛋白質(zhì)含量均顯著高于CK處理（P＜0.05），其中TD處理的可溶性蛋白質(zhì)含量最高為2.59 mg·g-1；40 d時，TB和TC處理顯著低于CK處理（P＜0.05），而TD處理的可溶性蛋白質(zhì)含量略高于CK處理，但差異不顯著；60 d時，TB和TD處理的可溶性蛋白質(zhì)含量均高于CK處理，其中TD處理顯著高于CK處理（P＜0.05）且含量最高為3.33 mg·g-1，80 d時，除TC處理顯著高于CK處理（P＜0.05）外，其他處理與CK處理相比均差異不顯著。

圖5 不同干旱脅迫處理下小葉黃楊葉片可溶性蛋白質(zhì)含量的變化Fig.5 Change of soluble protein content in B. microphylla leaves under different drought stress treatments

2.4 不同干旱脅迫處理下各指標(biāo)相關(guān)性

由表1可知，POD活性與SOD活性、CAT活性、MDA含量、可溶性蛋白質(zhì)含量均呈正相關(guān)關(guān)系，其中POD活性與CAT活性和可溶性蛋白質(zhì)含量（P＜0.01）呈極顯著相關(guān)關(guān)系，SOD活性與MDA含量（P＜0.05）呈顯著相關(guān)關(guān)系；CAT活性和可溶性蛋白質(zhì)含量均與SOD活性、MDA含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

表1 小葉黃楊葉片各指標(biāo)相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of each indicator in B. microphylla leaves

3 討論與結(jié)論

3.1 干旱脅迫下過量的活性氧（ROS）會造成細(xì)胞膜脂過氧化，損壞植物細(xì)胞和膜，抗氧化酶可以促進(jìn)植物抗逆性和防御系統(tǒng)[12-13]。研究表明，SOD在干旱脅迫初期0～20 d時，含量增加迅速，20 d時達(dá)到高峰。表明0～20 d時，小葉黃楊主要靠SOD清除·O2-，將其歧化為H2O2，進(jìn)而緩解干旱脅迫帶來的傷害[14]。相關(guān)研究表明，隨著干旱脅迫的增強(qiáng)，孟連苗葉片的SOD活性呈現(xiàn)先升高后下降再升高變化的“S”曲線[15]，本試驗(yàn)所得結(jié)論與上述觀點(diǎn)一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，正常水分處理的SOD活性在20～60 d時，呈下降趨勢。這可能是因?yàn)?—8月屋頂溫度較高，水分蒸發(fā)較快，一定程度上抑制了正常水分處理的SOD活性，使其整體下降。

本研究發(fā)現(xiàn)，在一定強(qiáng)度干旱脅迫下，小葉黃楊葉片CAT活性增加，嚴(yán)重的干旱脅迫可能會抑制CAT活性，40 d時CAT活性達(dá)到峰值。CAT可以將H2O2直接轉(zhuǎn)化成H2O，降低活性氧的含量。此外，清除H2O2可以清除細(xì)胞中的活性氧，緩解植物氧化損傷[16-17]。本研究中，CAT活性在20～40 d時，呈上升趨勢，40 d后下降?？赡苁且?yàn)?月20日—7月10日溫度逐漸升高，干旱脅迫對小葉黃楊的影響日益明顯，而7月10日—8月溫度較高抑制了小葉黃楊的正常生長和代謝，進(jìn)而CAT活性隨之降低。熊仕發(fā)等[18]研究表明，在干旱脅迫過程中，小葉黃楊葉片CAT活性變化呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，與本研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，在0～60 d隨著干旱脅迫的加劇，小葉黃楊葉片中POD活性先上升后下降，各干旱脅迫處理下的POD活性與CK處理相比均差異顯著，這可能是由于干旱脅迫下的膜脂過氧化作用，使得H2O2積累而導(dǎo)致SOD活性減弱，將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2的能力降低，H2O2誘導(dǎo)POD活性增強(qiáng)，POD將H2O2分解，防止H2O2與剩余超氧陰離子反應(yīng)生成活性更強(qiáng)的OH－，加劇氧化脅迫，從而達(dá)到維護(hù)機(jī)體免受活性氧的損傷[19]。這與前人研究結(jié)果一致[20-21]，但60 d后POD活性又上升，這可能是因?yàn)闅鉁叵陆稻徑饬烁珊得{迫程度。

MDA含量在后期尤其是60 d后顯著增加，質(zhì)膜被破壞，大量離子外溢，其中輕度脅迫下質(zhì)膜的損害嚴(yán)重，很多研究[22-25]得出了與之相似的結(jié)果。干旱在前期不會對膜造成太大傷害，后期干旱程度加劇MDA含量增加。在輕度脅迫下MDA含量增加幅度已很大，尤其60 d后MDA含量出現(xiàn)大幅度增加，表明在干旱脅迫下，小葉黃楊體內(nèi)氧自由基的積累導(dǎo)致MDA大量增加，從而使植株免受嚴(yán)重?fù)p害，趙嬋璞等[26]對匍枝委陵菜Potentilla flagellaris的研究與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。3.2 可溶性蛋白質(zhì)是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能明顯提高細(xì)胞的結(jié)合水含量和持水能力[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著脅迫時間的增加，各處理可溶性蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，可溶性蛋白質(zhì)含量的最大值出現(xiàn)在60 d，這與高鵬飛等[28]的研究結(jié)果一致。小葉黃楊的葉片因?yàn)槟な軗p傷蛋白質(zhì)被釋放出來，蛋白酶活性升高將蛋白質(zhì)水解，而水解所得的氨基酸又用于合成如抗氧化酶等響應(yīng)干旱脅迫的蛋白質(zhì)，導(dǎo)致小葉黃楊葉片前60 d的可溶性蛋白質(zhì)含量增加[29]，這也表明小葉黃楊有一定抗旱性，與張衛(wèi)紅等[30]對垂穗披堿草的研究結(jié)果一致。隨著脅迫強(qiáng)度的增加，在一定程度上抑制了蛋白質(zhì)的合成或加快其降解速度，導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)含量在60 d后下降，這與王曉宇等[31]研究結(jié)果相一致。也有相關(guān)研究表明，干旱可抑制蛋白質(zhì)合成，誘導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，從而降低某些植物的總蛋白質(zhì)含量[32]。

此外，各處理在60 d之前可溶性蛋白質(zhì)含量與干旱持續(xù)時間正相關(guān)，可溶性蛋白質(zhì)含量的增加也許能使植物細(xì)胞保持在低滲透電位水平，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，延緩衰老，抵抗干旱脅迫造成的損害。隨著干旱脅迫的加劇，可溶性蛋白質(zhì)含量的下降幅度也隨之增大，刺激了小葉黃楊保護(hù)酶系統(tǒng)做出保護(hù)性反應(yīng)，但隨著脅迫時間的延長，各脅迫處理的保護(hù)酶活性在達(dá)到最大值后均呈下降趨勢，這可能是因?yàn)檫^量ROS或H2O2積累，超過保護(hù)酶系統(tǒng)閾值，打破動態(tài)平衡，致使酶光鈍化，抑制新酶的合成。

3.3 在正常條件下，植物活性氧的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，但在干旱脅迫下，這種平衡被打破，植物為維持正常的生長代謝，必須依靠抗氧化酶系統(tǒng)清除活性氧[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫的不同時期，POD和CAT活性的降低與MDA的積累緊密相關(guān)，兩者可能互為因果關(guān)系。一方面，POD和CAT活性降低使有害自由基積累超過損傷閾值，可能直接或間接地引發(fā)膜脂過氧化，增加MDA含量，損傷膜系統(tǒng)；另一方面，隨著MDA的積累，POD和CAT活性受到抑制后降低，從而失去了保護(hù)酶系統(tǒng)的功能，進(jìn)而加重膜系統(tǒng)的損傷。說明植物抗旱能力與保護(hù)酶活性及其防御功能有關(guān)[34]，這可能是植物在干旱脅迫下的主要生理反應(yīng)和損傷機(jī)制。此外，可溶性蛋白質(zhì)與POD活性和MDA含量關(guān)系密切。在干旱脅迫前期（0～40 d），可溶性蛋白質(zhì)與POD活性變化一致，說明二者協(xié)同作用以適應(yīng)干旱逆境造成的傷害。在整個干旱脅迫過程中，可溶性蛋白質(zhì)與MDA含量的變化趨勢相反，可能是可溶性蛋白含量的增加減輕了MDA的積累，進(jìn)而減輕干旱對植物的損傷。

綜上所述，干旱脅迫后，小葉黃楊體內(nèi)的保護(hù)酶系統(tǒng)做出響應(yīng)，使機(jī)體在一定程度上可以維持正常的生長和代謝等活動。在輕度和中度干旱脅迫后，保護(hù)酶活性的提高可以有效協(xié)調(diào)和維持氧化物含量的相對平衡，減少有害氧化物積累所造成的損害；重度脅迫后，小葉黃楊保護(hù)酶系統(tǒng)和細(xì)胞遭受不可逆的損害，不能發(fā)揮正常的保護(hù)機(jī)體的功能。總之，小葉黃楊作為一種綠色植物，具有較強(qiáng)的抗旱性，在很大程度上能夠適應(yīng)逆境，能夠在屋頂這種特殊的環(huán)境下正常生長。