龐學(xué)豐，林 菊，黃政治，韋夏惠，李玉玲，吳燕紅，王思思，廖家瑜，馮玉青

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種致殘率高的慢性疾病，未經(jīng)系統(tǒng)、規(guī)范治療的晚期患者將會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形和功能喪失［1］，目前尚無根治藥物。研究表明，白細(xì)胞介素-17（IL-17）和白細(xì)胞介素-23（IL-23）在RA 的發(fā)病、發(fā)展中起著重要的作用，IL-17 與其他細(xì)胞因子如 IL-1、TNF-α 等相互作用，導(dǎo)致 RA 病變進(jìn)展［2］；IL-23 是 RA 發(fā)病過程中重要的促炎因子之一，在RA 發(fā)病過程起著關(guān)鍵作用［3］。甲氨蝶呤是公認(rèn)的治療RA 療效確切的藥物，二甲雙胍可以改善RA 模型小鼠關(guān)節(jié)癥狀，提示其具有治療RA 的作用［4］。本實(shí)驗(yàn)采用CⅡ乳劑進(jìn)行皮下注射成功誘導(dǎo)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）大鼠模型，選擇甲氨蝶呤、二甲雙胍作為對(duì)照藥，觀察不同劑量的寒痹康湯對(duì)CIA 大鼠血清IL-17 和IL-23的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar 大鼠140 只，雌性，體質(zhì)量（100±10）g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0013。大鼠在廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，觀察7 d 無異常后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥 寒痹康湯由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院新藥研發(fā)中心制備成浸膏，臨用時(shí)將浸膏加入溶液（由乙醇和生理鹽水按比例組成）溶解，配制成濃度為2×10-7g/L 的溶液；甲氨蝶呤片（國(guó)藥準(zhǔn)字H22022674，通化茂祥制藥有限公司）；二甲雙胍（國(guó)藥準(zhǔn)字H13021647，河北天成藥業(yè)股份有限公司）。

1.3 試劑 大鼠IL-17檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：P10031784，武漢華美生物工程有限公司）；IL-23 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：38KJFDZI7C，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；弗氏不完全佐劑、牛Ⅱ型膠原蛋白均為美國(guó)Chondrex公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 分組及造模 隨機(jī)從140 只大鼠中選取20 只作為正常組，余120 只大鼠參照文獻(xiàn)［5］方法注射CⅡ乳劑（將弗氏不完全佐劑和牛Ⅱ型膠原蛋白充分混勻后滴入水中呈油包水狀）進(jìn)行造模。造模時(shí)，分別在大鼠的頸部和背部注射0.2 ml的CⅡ乳劑，間隔2周后再注射CⅡ乳劑1 次。造模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)［5］：大鼠四肢的足爪已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重腫脹，且踝關(guān)節(jié)直徑增長(zhǎng)幅度≥2 mm。將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型組、甲氨蝶呤組、二甲雙胍組及寒痹康湯高、中、低劑量組，每組20只。本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)大鼠的各種處理均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)的相關(guān)要求。

2.2 給藥 模型組大鼠予生理鹽水灌胃，每天1 次；甲氨蝶呤組按13.5 mg/kg 的劑量灌服給予甲氨蝶呤藥液，每周1次；二甲雙胍組按1.35 g/kg的劑量灌胃給予二甲雙胍藥液，每天進(jìn)行2 次；寒痹康湯高、中、低劑量組分別灌胃給予不同劑量的寒痹康湯（112.5 g/kg、56.25 g/kg、28.13 g/kg），每天灌胃2 次。高、中、低劑量參考文獻(xiàn)［6］進(jìn)行換算得出：即按70 kg 人體質(zhì)量與200 g 大鼠的換算系數(shù)進(jìn)行計(jì)算。各組灌胃容積均為20 ml/kg。正常組大鼠任其自由活動(dòng)，不人為干擾其飲食與休息。

2.3 IL-17 和 IL-23 的檢測(cè) 灌胃給藥 36 d 后，用水合氯醛麻醉各組大鼠，腹主動(dòng)脈采集大鼠血液，靜置后，以 3 000 r/min 離心 10 min，收集血清放入 EP 管，后置于-80 ℃冰箱保存，以ELISA 法進(jìn)行測(cè)定，按試劑盒說明進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用方差分析或t檢驗(yàn)。P＜0.05則表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 各組大鼠血清IL-17和IL-23水平比較 見表1。灌胃給藥36 d 后，與正常組比較，模型組大鼠血清IL-17和IL-23的水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，甲氨蝶呤組、二甲雙胍組及寒痹康湯高、中劑量組IL-17 和IL-23 的水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而寒痹康湯低劑量組IL-17 和IL-23 的水平略有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；寒痹康湯高、中劑量組療效與甲氨蝶呤、二甲雙胍相當(dāng)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清IL-17和IL-23水平比較 （pg/ml，）

表1 各組大鼠血清IL-17和IL-23水平比較 （pg/ml，）

注：與正常組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

組 別正常組模型組甲氨蝶呤組二甲雙胍組寒痹康湯低劑量組寒痹康湯中劑量組寒痹康湯高劑量組n 劑量（g/kg）20 20 20 20 20 20 20- -0.0135 1.35 28.13 56.25 112.5 IL-17 44.251±6.523 104.209±8.136①63.348±9.735②64.402±9.768②95.413±6.452 66.283±8.046②62.121±5.053②IL-23 53.165±5.536 109.541±8.654①67.412±5.246②67.382±5.253②98.641±6.223 69.534±5.162②68.323±5.156②

3 討 論

既往研究證實(shí)，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過程以及出現(xiàn)的骨質(zhì)破壞和由此破壞產(chǎn)生的功能障礙，存在多種信號(hào)通路和炎性因子的共同參與。而白細(xì)胞介素-23/輔助性T細(xì)胞17介導(dǎo)的B細(xì)胞促炎性機(jī)制在RA的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［7］。

相關(guān)研究結(jié)果已表明，白細(xì)胞介素-17（IL-17）可以正反饋誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞產(chǎn)生白細(xì)胞介素-23（IL-23），致使骨破壞進(jìn)程加速，（IL-17）A可導(dǎo)致破骨細(xì)胞的進(jìn)一步分化和增殖加快，促進(jìn)骨吸收，造成類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞［8］。IL-17A、IL-17F 均參與了包含RA 在內(nèi)的自身免疫性疾病的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致了這些疾病的發(fā)生［9］。RA 發(fā)病情況下IL-23、IL-17 作為促炎癥的細(xì)胞因子，在關(guān)節(jié)中有較高表達(dá)。在RA 的發(fā)病過程中，IL-23和IL-17在Th17細(xì)胞中形成IL-23/IL-17炎癥軸，研究發(fā)現(xiàn)此炎癥軸在RA的發(fā)病過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10］。在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中IL-23、IL-17、IL-6、IL-1、IL-33 水平升高，并且與RA 病情的嚴(yán)重程度、臨床癥狀評(píng)分等有密切關(guān)聯(lián)，可以作為診斷以及評(píng)估RA 病情和治療效果的標(biāo)志物［11］。

甲氨蝶呤是治療RA 的臨床常用藥物之一，其療效肯定，也是實(shí)驗(yàn)研究的常用對(duì)照藥物。近年來許多學(xué)者進(jìn)行了二甲雙胍治療RA 的相關(guān)研究，如鄭魏等［12］發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以促進(jìn)RA患者外周血CD4+T淋巴細(xì)胞中Treg 細(xì)胞增長(zhǎng)，使Th17/Treg 下降并且維持平衡狀態(tài)，有利于病情的緩解，其安全性良好，副作用少。Fan等［13］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)二甲雙胍能夠抑制小鼠全身炎癥和滑膜炎，能夠抑制軟骨層基質(zhì)降解、破骨細(xì)胞形成以及軟骨細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮骨保護(hù)作用。Matsuoka 等［14］研究表明，二甲雙胍可以影響 RA 的發(fā)病機(jī)制，可能被用作治療RA 的潛在治療劑。基于以上認(rèn)識(shí)，本課題組選擇甲氨蝶呤、二甲雙胍作為對(duì)照藥物，觀察不同劑量的寒痹康湯對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠血清IL-17和IL-23的影響。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)學(xué)的“痹病”范疇，中醫(yī)認(rèn)為正氣虧虛是RA 發(fā)病的內(nèi)在因素，而感受風(fēng)寒濕邪為其發(fā)病的外在因素，治則應(yīng)扶正祛邪。寒痹康湯為筆者治療RA 的經(jīng)驗(yàn)方，由補(bǔ)腎中藥和抗風(fēng)濕中藥（秦艽、黃芪、防風(fēng)、熟附子、麻黃、當(dāng)歸、青風(fēng)藤、淫羊藿、狗脊）組成，全方具有補(bǔ)益肝腎、益氣溫經(jīng)、祛風(fēng)除濕、蠲痹止痛的功效，課題組成員經(jīng)多年臨床應(yīng)用，表明本方治療寒濕型RA療效較好，且副作用少［15］，值得進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，寒痹康湯高、中劑量組能明顯降低CIA 大鼠IL-17 和IL-23 水平，且與甲氨蝶呤組、二甲雙胍作用相當(dāng)（P＞0.05）。提示寒痹康湯可能通過降低CIA大鼠IL-17和IL-23水平而發(fā)揮治療RA的作用。