陳譜，袁黎玥，雷雨陽(yáng)，張曈欣，袁佳，郭輝，施秉銀，強(qiáng)薇

胰腺癌以胰腺導(dǎo)管癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）最為常見，是惡性程度最高的消化系統(tǒng)實(shí)體腫瘤，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)持續(xù)上升。胰腺癌預(yù)后極差，5 年生存率僅約6%［1-2］。分析主要原因是：疾病早期缺乏典型癥狀，確診時(shí)往往已喪失根治性手術(shù)的機(jī)會(huì)；同時(shí)，其具有高侵襲轉(zhuǎn)移特性，易于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；對(duì)現(xiàn)有化療藥物產(chǎn)生耐藥，缺乏有效的化療及靶向藥物。因此，尋找胰腺癌轉(zhuǎn)移之前的診斷方法以及胰腺癌治療的有效靶點(diǎn)尤為重要。

葡萄糖是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基本能量來源。截至目前，哺乳動(dòng)物中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（glucose transporter，GLUT）和鈉-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（sodium-glucose cotransporter，SGLT）2 個(gè)家族的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體已被鑒定［3-4］。人類GLUT 家族在所有的組織中均有表達(dá)，以順濃度梯度（易化擴(kuò)散）的形式轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖。而SGLTs 表達(dá)于人體代謝活躍的細(xì)胞，借助細(xì)胞膜兩側(cè)的鈉離子濃度梯度實(shí)現(xiàn)葡萄糖的逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)。SGLT 家族成員研究最多的是溶質(zhì)載體家族5-成員1（solute carrier family 5-member 1，SLC5A1）和鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白2（sodium - dependent glucose transporters 2，SGLT2）。SGLT2 由溶質(zhì)載體家族5-成員2（solute carrier family 5-member 2，SLC5A2）基因編碼，主要分布于腎皮質(zhì)，是腎臟葡萄糖重吸收的關(guān)鍵分子［5］。SGLT1 由SLC5A1 基因編碼，在小腸和腎近端小管細(xì)胞負(fù)責(zé)葡萄糖攝取。腫瘤細(xì)胞需要大量的葡萄糖來維持其增殖，代謝重編程已被認(rèn)為是腫瘤的特征之一［6］。而SLC5A1 和SLC5A2 的高表達(dá)在結(jié)腸/結(jié)直腸、肺、卵巢、頭部、頸部和口腔鱗狀上皮癌中已有相關(guān)報(bào)道［4］。靶向代謝治療癌癥被認(rèn)為極具前景。葡萄糖攝取增高也是胰腺癌代謝重編程的重要環(huán)節(jié)。新近研究發(fā)現(xiàn)，SLC5A2 在胰腺癌中表達(dá)亦增高，而其抑制劑可抑制小鼠胰腺癌移植瘤生長(zhǎng)［7］。本課題組的另一篇文章已對(duì)SLC5A2 進(jìn)行了分析研究。本研究通過對(duì)癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中胰腺癌患者的數(shù)據(jù)與臨床病理資料進(jìn)行分析，明確SLC5A1 在胰腺癌中的表達(dá)情況，探討其異常表達(dá)與臨床病理及腫瘤發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 胰腺癌的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)是從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）中獲取，正常胰腺組織的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)是從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)及基因組織表達(dá)（genotype-tissue expression，GTEx）數(shù)據(jù)庫(kù)中共同獲取的。

1.2 基因共表達(dá)、信號(hào)通路富集及數(shù)據(jù)分析cBioPortal（http：//www.cbioportal.org/）是一個(gè)開放獲取資源，可進(jìn)行多維癌癥基因組學(xué)交互分析，LinkedOmics（http：//www.linkedomics.orglogin.php）是一個(gè)包含32 種TCGA 癌癥多組學(xué)數(shù)據(jù)的開放資源網(wǎng)站。利用cBioPortal 和LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行胰腺癌中SLC5A1 共表達(dá)基因的分析。利用可視化注釋和集成探索在線數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）及KEGG（https：//www.kegg.jp/）進(jìn)行功能注釋和通路富集分析。通過基因表達(dá)譜交互分析在線數(shù)據(jù)庫(kù)GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）獲取TCGA 及GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)中的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)，并比較SLC5A1 在胰腺癌（179 例）與正常胰腺組織（171 例）中mRNA 的表達(dá)，并分析SLC5A1 mRNA 表達(dá)水平與不同臨床特征的相關(guān)性，如患者的種族、腫瘤的病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分型等。胰腺癌根據(jù)基因分型可分為4 種類型：（1）鱗狀型；（2）胰腺祖細(xì)胞型；（3）免疫原性型；（4）異常分化的內(nèi)分泌外分泌型（aberrantly differentiated endocrine exocrine，ADEX）。本研究對(duì)4 種亞型相關(guān)基因胰島素（insulin，INS）、核受體亞家族5-組A-成員2（nuclear receptor subfamily 5-group A-member 2，NR5A2）、蛋白酶-絲氨酸-3（protease-serine-3，PRSS3）、叉頭框A3（forkhead box A3，F(xiàn)OXA3）、肝細(xì)胞核因子1α（hepatocyte nuclear factor 1-alpha，HNF1A）、叉頭框A2（forkhead box A2，F(xiàn)OXA2）、肝細(xì)胞核因子1β（hepatocyte nuclear factor1β，HNF1B）、胰十二指腸同源框因子-1（pancreatic and duodenal homeobox 1，PDX1）、肝細(xì)胞核因子4-γ（hepatocyte nuclear factor 4-gamma，HNF4G）、肝細(xì)胞核因子4-α（hepatocyte nuclear factor 4-alpha，HNF4A）、多毛和增強(qiáng)子斷裂1（hairy and enhancer of split 1，HES1）等與SLC5A1 的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 軟件（Chicago，IL，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用±s表示，2 組數(shù)據(jù)間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman 分析。采用Log rank 檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLC5A1 在胰腺癌的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性 如圖1A 所示，對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在胰腺癌組織中的SLC5A1 mRNA表達(dá)高于正常胰腺組織（P<0.05）。SLC5A1 的表達(dá)與患者的種族相關(guān)（P=0.002），但與年齡、臨床病理階段、病理TNM 分期、組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無相關(guān)性。見表1。如圖1B 所示，相較于SLC5A1低表達(dá)的患者，SLC5A1 高表達(dá)的患者總生存時(shí)間雖呈現(xiàn)減低趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.075）。而如圖1C 所示，SLC5A1 高表達(dá)及低表達(dá)患者的無病生存時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.870）。

表1 SLC5A1 的表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的相關(guān)性

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)分析在胰腺癌組織中的SLC5A1 mRNA 表達(dá)

2.2 與SLC5A1 表達(dá)相關(guān)的基因 進(jìn)一步用cBioPortal 分析胰腺癌中與SLC5A1 表達(dá)呈正相關(guān)以及負(fù)相關(guān)的基因，見圖2A；GO 分析顯示大多數(shù)與SLC5A1 相關(guān)的基因位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核，負(fù)責(zé)蛋白和離子的結(jié)合，參與細(xì)胞生物功能和代謝調(diào)節(jié)，見圖2B。KEGG 分析進(jìn)一步提示，SLC5A1 的高表達(dá)與包括葡萄糖攝取、糖酵解信號(hào)通路等細(xì)胞代謝相關(guān)的通路以及細(xì)胞色素P450 介導(dǎo)的藥物代謝激活呈正相關(guān)。SLC5A1 的高表達(dá)還與青少年發(fā)病的成年型糖尿病的信號(hào)通路激活呈正相關(guān)，見表2。

表2 胰腺癌中與SLC5A1 表達(dá)正相關(guān)及負(fù)相關(guān)的信號(hào)通路

圖2 胰腺癌中SLC5A1 相關(guān)基因

2.3 SLC5A1 表達(dá)與胰腺癌不同亞型基因的相關(guān)性分析 本研究對(duì)胰腺癌4 種亞型相關(guān)基因與SLC5A1 的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLC5A1的表達(dá)與ADEX 型胰腺癌相關(guān)基因中的INS（r=0.174 8，P<0.05）、NR5A2（r=0.331 7，P<0.001）、PRSS3（r=0.207 7，P<0.05）表達(dá)呈正相關(guān)。見圖3。SLC5A1 表達(dá)與胰腺祖型胰腺癌中糖代謝關(guān)鍵基因FOXA3（r=0.294 4，P<0.001）、HNF1A（r=0.234 0，P<0.05）、FOXA2（r=0.193 5，P<0.05）、HNF1B（r=0.545 4，P<0.001）、PDX1（r=0.370 1，P<0.001）、HNF4G（r=0.628 3，P<0.001）、HNF4A（r=0.473 2，P<0.001）、HES1（r=0.300 1，P<0.001）表達(dá)呈正相關(guān)。見圖4。與鱗狀型、免疫原性型無明顯相關(guān)性。

圖3 SLC5A1 表達(dá)與ADEX 型胰腺癌相關(guān)性分析

圖4 SLC5A1 表達(dá)與胰腺祖細(xì)胞亞型胰腺癌相關(guān)性分析

3 討論

葡萄糖攝取增高是胰腺癌代謝重編程的重要特征之一，由介導(dǎo)葡萄糖順梯度異化擴(kuò)散的GLUT家族和介導(dǎo)葡萄糖逆濃度梯度主動(dòng)攝取的SGLT 家族介導(dǎo)。SGLT1 是由SLC5A1 編碼的，本研究分析TCGA 中的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，SLC5A1 在胰腺癌組織中的表達(dá)顯著高于正常胰腺組織，遺憾的是本研究未能有臨床樣本進(jìn)行進(jìn)一步的組織學(xué)驗(yàn)證，但這一結(jié)果與其他研究結(jié)果一致［8-9］，均提示其可能作為潛在治療靶點(diǎn)，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

本研究進(jìn)行GO 分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)與SLC5A1相關(guān)的基因位于細(xì)胞膜和細(xì)胞核，負(fù)責(zé)蛋白和離子的結(jié)合，參與細(xì)胞生物功能、代謝及應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)。利用KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，SLC5A1 高表達(dá)除與葡萄糖攝取信號(hào)通路呈正相關(guān)，也與糖酵解信號(hào)通路正相關(guān)。糖酵解改變被認(rèn)為是胰腺癌的主要代謝改變。許多糖酵解酶與PDAC 預(yù)后不良有關(guān)，而通過遺傳學(xué)途徑或用藥抑制糖酵解關(guān)鍵因子如己糖激酶2（hexokinaseⅡ，HK2）、磷酸果糖激酶1（phosphofructokinase-1，PFK1)和乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）等已被證明能抑制胰腺癌惡性程度。最近，糖酵解增強(qiáng)還被發(fā)現(xiàn)與胰腺癌對(duì)吉西他濱喪失敏感性有關(guān)［10］。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)SLC5A1 高表達(dá)與胰腺分泌、青少年的成年型糖尿病發(fā)病的信號(hào)通路激活呈正相關(guān)。2 型糖尿病患者并發(fā)腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增加，其中胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了1.5～2.0 倍［11］，合并糖尿病的胰腺癌患者的死亡率顯著高于無糖尿病的患者［1］。此外，患有糖尿病的胰腺癌患者的腫瘤常較大，中位生存期短［13］。高胰島素血癥和高糖已被證明能促進(jìn)胰腺癌的增殖、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換及轉(zhuǎn)移潛能［5］。SLC5A1 表達(dá)與葡萄糖攝取、糖酵解等信號(hào)通路的正相關(guān)提示其所編碼的SGLT1 可能參與胰腺癌發(fā)生、進(jìn)展的機(jī)制。通過對(duì)SGLT1 的抑制有望降低腫瘤對(duì)葡萄糖的吸收，進(jìn)而抑制胰腺癌的代謝、生長(zhǎng)，具有臨床前景。

胰腺癌是胰源性糖尿病的重要病因，一項(xiàng)對(duì)PDAC 患者的對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，高血糖出現(xiàn)可能早于PDAC 診斷，提示新發(fā)糖尿病可作為胰腺癌的早期預(yù)警指標(biāo)［11］。同時(shí)，靶向高血糖也可能有利于胰腺癌防治，經(jīng)典降糖藥物二甲雙胍已被證明與PDAC合并糖尿病患者生存延長(zhǎng)有關(guān)，而現(xiàn)今SGLT2 抑制劑及部分SGLT1 及SGLT2 雙抑制劑被作為降糖藥物廣泛應(yīng)用于臨床［14］。此類藥物對(duì)糖尿病患者心衰及慢性腎臟病的改善作用確切，具有減重、低血糖風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)勢(shì)［11］，被美國(guó)、歐洲及我國(guó)等國(guó)家的2 型糖尿病指南推薦［15-17］。與慢性胰腺炎導(dǎo)致的胰源性糖尿病相比，胰腺癌相關(guān)胰源性糖尿病的胰島素水平相對(duì)較高，且外周胰島素抵抗更為顯著［18］。如SGLT1 及SGLT2 雙抑制劑對(duì)胰腺癌有抑制作用，那么在胰腺癌所致胰源性糖尿病患者中應(yīng)用此類藥物有望達(dá)到降糖及抗腫瘤的雙重效果。

精準(zhǔn)治療是腫瘤治療的重要發(fā)展趨勢(shì)。PDAC 具有高度異質(zhì)性，最近的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄分析將其劃分為不同亞型，每種亞型表現(xiàn)為不同臨床特征及代謝特征［11］。本研究分析發(fā)現(xiàn)，SLC5A1 的表達(dá)與胰腺祖細(xì)胞型和ADEX 型胰腺癌的關(guān)系更為密切，在胰腺祖細(xì)胞型胰腺癌中SLC5A1 的表達(dá)與FOXA3、HNF1A、FOXA2、HNF1B、PDX1、HNF4G、HNF4A 及HES1 表達(dá)均呈正相關(guān)，其大多與肝臟及胰島β 細(xì)胞的調(diào)節(jié)相關(guān)；同時(shí)，SLC5A1 的表達(dá)與ADEX 型胰腺癌相關(guān)基因中的INS、NR5A2、PRSS3 表達(dá)呈正相關(guān)。NR5A2 調(diào)控炎癥基因的表達(dá)，增加胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)［19］；PRSS3 在胰腺癌等消化道腫瘤中高表達(dá)，促進(jìn)人胰腺癌腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移，認(rèn)為其可能在腫瘤的進(jìn)展過程中參與了腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移［20］，同時(shí)，有研究表明在結(jié)直腸癌患者中PRSS表達(dá)水平與癌細(xì)胞對(duì)西妥昔單抗的敏感性呈顯著負(fù)相關(guān)［20］，提示在上述亞型胰腺癌中抑制SLC5A1 可能達(dá)到更好的效果，這一發(fā)現(xiàn)需要后續(xù)進(jìn)一步的研究以探討其作用的靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究基于TCGA 胰腺癌數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)SLC5A1 在胰腺癌中高表達(dá)，其高表達(dá)與葡萄糖攝取、糖酵解、胰腺分泌的基因信號(hào)通路呈正相關(guān)；SLC5A1 高表達(dá)與胰腺祖細(xì)胞型及ADEX 胰腺癌型密切相關(guān)，有可能成為胰腺癌代謝治療的新靶點(diǎn)。