丁曉明，鄭麗紅，孔菲，柏杉

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院內(nèi)分泌科，黑龍江哈爾濱 150001；4. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科，黑龍江哈爾濱 150000）

嗅覺具有識別環(huán)境、辨識氣味、促進(jìn)食欲等作用，而嗅覺障礙不僅嚴(yán)重影響人的生活質(zhì)量，還會導(dǎo)致精神抑郁[1]。鼻竇炎癥性疾病、病毒感染和頭部創(chuàng)傷是誘發(fā)嗅覺障礙的主要致病因素，其中病毒感染后嗅覺障礙占所有門診嗅覺障礙患者的18.6%～29.3%[2]。相關(guān)研究顯示，病毒感染后嗅覺障礙繼發(fā)于細(xì)菌、真菌或病毒，包括近年的新冠病毒——嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS CoV-2）[3]。當(dāng)前臨床治療病毒感染后嗅覺障礙的首選藥物為糖皮質(zhì)激素、維生素A 和銀杏提取物等[4]，但治療效果不甚理想，治愈率不高，且部分藥物會誘發(fā)類似鼻刺激和鼻出血等并發(fā)癥。

針灸是傳統(tǒng)中醫(yī)的治療方式之一，具有副作用小、成本低、能緩解許多慢性免疫性疾病等優(yōu)點(diǎn)，在耳鼻喉科也廣泛應(yīng)用。例如，針灸治療可降低患者耳鳴程度[5]、耳穴針刺可緩解成人扁桃體切除術(shù)后疼痛[6]、針灸治療變應(yīng)性鼻炎的臨床效果不亞于藥物治療[7]。此外，亦有研究證實(shí)針灸在幫助病毒感染后嗅覺障礙患者恢復(fù)嗅覺功能及緩解病情具有較好的療效[8]，但其具體機(jī)制尚不清楚。

髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）/Toll 樣受體4（toll-like receptor 4, TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-?B, NF-κB）信號通路的激活與嗅覺障礙密切相關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)額葉癲癇患者的嗅覺障礙與嗅球組織中TLR4 受體和下游轉(zhuǎn)錄因子NF-κB p65 表達(dá)顯著增加有關(guān)[9]。此外，變應(yīng)性鼻炎誘導(dǎo)的嗅覺功能障礙與嗅球小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4/NF-κB 信號通路激活有關(guān)，表現(xiàn)為膠質(zhì)細(xì)胞中TLR4、MyD88 和p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)[10-11]。

因此，本研究擬通過針刺內(nèi)迎香穴和鼻丘穴聯(lián)合糠酸莫米松鼻噴霧劑治療病毒感染后嗅覺障礙，以評估針?biāo)幝?lián)合的臨床效果，并進(jìn)一步探索其調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年6月—2021年12月就診于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科的病毒感染后嗅覺障礙患者104 例，隨機(jī)分為對照組和聯(lián)合組，每組52 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①感染前患者主觀感受嗅覺正常，有病毒感染或感冒病史；②就診檢查或主訴嗅覺異常、減退或喪失，以及表現(xiàn)出典型的上呼吸道感染癥狀；③接受類固醇治療1 個(gè)月以上仍未改善或緩解；④同意本研究治療方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：①由于自身慢性免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、頭部創(chuàng)傷/創(chuàng)傷性腦損傷、精神疾病或醫(yī)源性原因?qū)е碌男嵊X喪失；②既往接受過鼻部或鼻竇手術(shù)；③糠酸莫米松鼻噴霧劑禁忌或過敏者；④拒絕參與研究者。兩組的性別構(gòu)成、年齡、病程及嗅覺情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性（見表1）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者及家屬簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較 （n=52）

1.2 方法

1.2.1 治療方法對照組給予常規(guī)鼻用激素糠酸莫米松鼻噴霧劑[默沙東（中國）有限公司，批準(zhǔn)文號：H20140100，規(guī)格：50 μg×60 撳]治療，每日噴鼻一次，持續(xù)4 周。聯(lián)合組采用針?biāo)幝?lián)合的治療方式，即在常規(guī)糠酸莫米松鼻噴霧劑治療的基礎(chǔ)上，給予鼻內(nèi)鏡下針灸針（華佗牌，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格：75 mm）針刺雙側(cè)內(nèi)迎香穴（針尖沿著鼻唇溝向上斜刺約10～15 mm）和鼻丘穴（針尖稍向內(nèi)上斜刺10～15 mm），平補(bǔ)平瀉，不使用特殊手法，留針30 min，1 次/d，持續(xù)4 周。兩組患者在治療期間和治療后均未發(fā)生不良事件，順利完成相應(yīng)治療。

1.2.2 Sniffin Sticks 嗅棒測試評估嗅覺功能治療前后用Sniffin Sticks 嗅棒（德國Burghart Messtechnik有限公司，批號：LA-13-00207）檢測兩組患者雙側(cè)的嗅覺功能。測試時(shí)，取下筆帽，筆尖放在兩組患者的鼻前15 s，讓其在選項(xiàng)卡上選擇聞到的氣味。該測試由3 項(xiàng)子測試組成，分別為氣味閾值（threshold, T）、氣味辨別能力（discrimination, D）和氣味識別能力（identification, I）。各子測試總分為16分，3 個(gè)子測試總分之和為整體嗅覺得分，即48 分。TDI 評分≥30.5 分為嗅覺正常，TDI 評分為＞16.5～＜30.5 分為嗅覺減退，TDI 評分≤16.5 分為嗅覺缺失。治療前后的TDI評分差值≥6分為治療成功[12]。

1.2.3 T&T嗅覺計(jì)測試評估嗅覺功能將異戊酸、苯乙醇、甲基環(huán)戊烯酮、臭糞素和十一烷酸內(nèi)酯5 種嗅物10 倍稀釋，稀釋后濃度為10-1～106，并依次標(biāo)識為-1、0、1、2、3、4、5、6。其中，-1～1 為嗅覺正常，1.1～5.5 為嗅覺減退，＞5.6 為嗅覺喪失。

1.2.4 副鼻竇CT掃描評估嗅裂通氣情況用128×2-slice 雙源CT 掃描儀[Flash Definition，西門子（中國）有限公司]對兩組患者進(jìn)行高分辨率副鼻竇CT掃描，以評估嗅裂通氣情況。根據(jù)CT 結(jié)果將嗅覺裂隙通氣模式分為正常、部分渾濁及完全渾濁。嗅裂通氣恢復(fù)正常為治愈，正常和渾濁減輕為改善。

1.2.5 Western blotting 檢測MyD88、TLR4 和NFκB p65 蛋白相對表達(dá)量采集兩組患者空腹外周靜脈血2 mL，置于肝素鈉抗凝管中。加1 mL 放射免疫沉淀法裂解緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號：R0010）提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（上海炎熙生物科技有限公司，批號：PD-BCA-500）定量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將MyD88、TLR4 和NF-κB p65 蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。加入5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h，滴加一抗anti-MyD88（上海艾博抗貿(mào)易有限公司，批號：ab133739，1∶1 000）、anti-TLR4（上海艾博抗貿(mào)易有限公司，批號：ab13556，1∶1 000）和anti-NF-?B p65（上海艾博抗貿(mào)易有限公司，批號：ab288751，1∶1 000），4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3 次，滴加羊抗人IgG H&L 二抗（上海艾博抗貿(mào)易有限公司，批號：ab7153，1∶10 000），室溫孵育40 min。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：E412-01）顯色，曝光顯影。以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算MyD88、TLR4 和NF-κB p65 蛋白相對表達(dá)量。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周靜脈血T 細(xì)胞亞群CD4+CD25+T 細(xì)胞和CD4+CD25highT 細(xì)胞的百分率采集兩組患者空腹外周靜脈血2 mL，置于肝素鈉抗凝管中。吸取50 μL 血液至各流式管，以CD3+和CD4+設(shè)門，篩選出CD3+CD4+T 細(xì)胞，再標(biāo)記CD25。分別加入10 μL 熒光抗體，充分混勻，室溫避光反應(yīng)15 min。滴加2 mL 溶血素，渦流混勻，室溫靜置10 min。離心，棄上清液，留存約50 μL 液體，用BeamCyte 流式細(xì)胞儀（常州必達(dá)科生物科技有限公司）檢測外周靜脈血T 細(xì)胞亞群CD4+CD25+T 細(xì)胞和CD4+CD25highT 細(xì)胞的百分率。其中，左側(cè)為對照管，右側(cè)為待檢管，CD25 平均熒光強(qiáng)度＞102定義為CD4+CD25highT 細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或配對t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療前后TDI評分及差值比較

兩組患者治療前TDI 評分比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組治療4 周后TDI評分比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合組高于對照組；兩組治療4 周后和治療前TDI 評分差值比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

選取2017年1月～2018年4月在本院脊柱科門診及住院治療的脊柱骨關(guān)節(jié)病伴有腰椎不穩(wěn)患者30例，病程2～15個(gè)月，平均（6.45±2.58）個(gè)月。

表2 兩組患者治療前后TDI評分及差值比較（n=52，分，±s）

表2 兩組患者治療前后TDI評分及差值比較（n=52，分，±s）

組別對照組聯(lián)合組t 值P 值治療前12.35±0.18 12.40±0.22 1.371 0.173治療4周后15.90±1.54 18.64±1.44 9.369 0.000差值3.56±1.41 6.24±1.29 10.121 0.000

2.2 兩組患者T&T嗅覺計(jì)測試結(jié)果

兩組患者治療前T&T 嗅覺計(jì)測試結(jié)果比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；兩組治療4 周后T&T 嗅覺計(jì)測試結(jié)果比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合組低于對照組；兩組治療4 周后和治療前T&T 嗅覺計(jì)測試差值比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組患者治療前后T&T嗅覺計(jì)測試結(jié)果及差值比較 （n=52，±s）

表3 兩組患者治療前后T&T嗅覺計(jì)測試結(jié)果及差值比較 （n=52，±s）

組別對照組聯(lián)合組t 值P 值治療前4.58±0.17 4.58±0.16 0.235 0.815治療4周后3.30±1.16 2.84±1.27 1.956 0.000差值-1.27±1.21-1.74±1.27 1.196 0.024

2.3 兩組患者嗅裂通氣情況比較

治療4 周后，對照組嗅裂通氣恢復(fù)正常9 例，治愈率為17.31%；嗅裂通氣改善13 例，改善率為25.00%。聯(lián)合組嗅裂通氣恢復(fù)正常15 例，治愈率為28.85%；嗅裂通氣改善22 例，改善率為42.31%。對照組和聯(lián)合組治愈率和改善率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.065 和6.486，P=0.044 和0.011），聯(lián)合組高于對照組。見表4。

表4 兩組患者嗅裂通氣模式比較 （n=52，例）

2.4 兩組患者靜脈血MyD88、TLR4和NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量的比較

兩組患者靜脈血MyD88、TLR4 和NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量治療前與治療4 周后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療4 周后均低于治療前；兩組治療4 周后靜脈血MyD88、TLR4 和NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合組低于對照組。見圖1和表5。

表5 兩組患者靜脈血MyD88、TLR4和NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量的比較 （n=52，±s）

表5 兩組患者靜脈血MyD88、TLR4和NF-κB p65蛋白相對表達(dá)量的比較 （n=52，±s）

注：?與治療前比較，P ＜0.05。

組別MyD88 TLR4治療4周后0.64±0.03?0.45±0.05?5.393 0.006治療4周后0.60±0.04?0.37±0.05?6.605 0.003治療前0.94±0.03 0.96±0.03 0.926 0.407治療前0.82±0.04 0.84±0.03 0.894 0.422治療4周后0.47±0.08?0.33±0.02?3.071 0.037對照組聯(lián)合組t 值P 值NF-κB p65治療前0.78±0.05 0.78±0.02 0.104 0.922

圖1 兩組患者靜脈血MyD88、TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)

2.5 兩組患者靜脈血CD4+CD25+ T 細(xì)胞和CD4+CD25high T細(xì)胞百分率的比較

兩組患者靜脈血CD4+CD25+T 細(xì)胞百分率和CD4+CD25highT 細(xì)胞百分率治療前與治療4 周后比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），治療4 周后均高于治療前；聯(lián)合組與對照組患者治療4 周后靜脈血CD4+CD25+T 細(xì)胞百分率和CD4+CD25highT 細(xì)胞百分率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），聯(lián)合組高于對照組。見圖2和表6。

表6 兩組患者CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25high T細(xì)胞百分率的比較 （n=52，%，±s）

表6 兩組患者CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25high T細(xì)胞百分率的比較 （n=52，%，±s）

注：?與治療前比較，P ＜0.05。

組別對照組聯(lián)合組t 值P 值CD4+CD25+T細(xì)胞治療前5.32±0.11 5.34±0.07 1.106 0.271治療4周后1.05±0.05?1.25±0.07?16.765 0.000治療4周后5.75±0.04?6.67±0.05?103.609 0.000 CD4+CD25high T細(xì)胞治療前0.92±0.03 0.93±0.06 1.078 0.285

圖2 兩組患者靜脈血CD4+CD25+T細(xì)胞和CD4+CD25high T細(xì)胞百分率

3 討論

病毒感染后嗅覺障礙通常由病毒感染損傷嗅覺通路所致，是獲得性嗅覺功能障礙最常見的原因之一，可誘發(fā)病毒感染后嗅覺障礙患者永久性嗅覺減退或喪失。特別是近年來新冠病毒SARSCoV-2 肆虐，由此引發(fā)的病毒感染后嗅覺障礙后遺癥更是引起廣泛關(guān)注[13]。當(dāng)前，病毒感染后嗅覺障礙的治療多采用手術(shù)、嗅覺訓(xùn)練、米諾環(huán)素、糖皮質(zhì)激素、銀杏葉提取物及α-硫酸鋅等治療方案，但存在療效有限、鼻刺激及非標(biāo)準(zhǔn)化等缺陷。

針灸治療不僅可提高健康人群的嗅覺敏感性，還在幫助病毒感染后嗅覺障礙患者恢復(fù)嗅覺功能方面具有很強(qiáng)的潛力。如VENT 等[14]證實(shí)相較于服用維生素B 復(fù)合物，針灸治療可使病毒感染后嗅覺障礙患者的TDI 評分由13.5 分增加至17.9 分；DAI等[15]發(fā)現(xiàn)針灸針刺改善11 例患者的嗅覺功能等。由于嗅黏膜的感受神經(jīng)元可持續(xù)再生，人類的嗅覺神經(jīng)系統(tǒng)具有可塑性，而針灸治療可通過各種嗅覺元件反復(fù)刺激嗅上皮和嗅覺通路，使受損的嗅覺功能有所恢復(fù)?；诖?，本研究在給予病毒感染后嗅覺障礙患者常規(guī)鼻用激素糠酸莫米松鼻噴霧劑的基礎(chǔ)上，用針灸針刺鼻雙側(cè)內(nèi)迎香穴和鼻丘穴，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組的TDI 評分較對照組明顯增加，治愈者多了6 例，且T&T 嗅覺計(jì)測試數(shù)值變小，即病毒感染后嗅覺障礙患者的氣味識別能力增強(qiáng)，嗅覺功能得以改善。

迄今為止，病毒感染后嗅覺障礙確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，但部分學(xué)者認(rèn)為病毒感染過度激發(fā)機(jī)體免疫體系，致使嗅黏膜損傷，促進(jìn)嗅覺受體神經(jīng)元凋亡，從而導(dǎo)致患者嗅覺減退乃至喪失[16]。嗅覺神經(jīng)上皮位于鼻腔與外部環(huán)境接觸的重要免疫屏障上，因此易受外源性損傷和內(nèi)源性宿主過度防御的影響[17]。盡管嗅覺神經(jīng)元及其祖細(xì)胞具有一定的再生能力，但長期的組織損傷終將導(dǎo)致特定的嗅覺神經(jīng)上皮被呼吸道黏膜替代[18]，也就是說，病毒感染后嗅覺障礙患者可能經(jīng)歷嗅覺功能障礙的消長，最終嗅覺減退及喪失。在給予糠酸莫米松鼻噴霧劑治療后，患者靜脈血中CD4+CD25+T 細(xì)胞和CD4+CD25highT 細(xì)胞百分率升高，尤其是具有調(diào)節(jié)活性的CD4+CD25highT 細(xì)胞較治療前有所增加，說明機(jī)體對病毒感染的免疫應(yīng)答得到抑制。進(jìn)一步給予針刺雙側(cè)內(nèi)迎香穴和鼻丘穴，CD4+CD25+T 細(xì)胞和CD4+CD25highT 細(xì)胞百分率明顯上調(diào)，免疫抑制調(diào)節(jié)作用加強(qiáng)。此外，本研究副鼻竇CT 掃描結(jié)果也同樣證實(shí)機(jī)體免疫反應(yīng)得以抑制。嗅裂由嗅上皮排列組成，后者含有嗅受體神經(jīng)元，這些神經(jīng)元的軸突在嗅球中以嗅絲和突觸的形式穿過篩狀板。由于病毒的侵襲，嗅裂可發(fā)生繼發(fā)性炎癥變化，導(dǎo)致黏膜水腫，隨后嗅裂變窄[19]。治療前病毒感染后嗅覺障礙患者嗅裂呈部分渾濁或完全渾濁，而給予糠酸莫米松鼻噴霧劑和針?biāo)幝?lián)合均有效改善患者嗅裂通氣情況，使之趨于正常及渾濁減輕。其中，針?biāo)幝?lián)合的療效顯著優(yōu)于傳統(tǒng)鼻噴霧劑治療，治愈率和改善率均較對照組明顯提升。

本研究結(jié)果均表明針?biāo)幝?lián)合對病毒感染后嗅覺障礙患者嗅覺功能恢復(fù)有好處，然而，其潛在的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。TLR4 屬免疫系統(tǒng)感受器，也是機(jī)體獲得性免疫和天然免疫之間的橋梁，可激活下游MyD88/NF-κB 通路，促進(jìn)細(xì)胞因子釋放，從而參與炎癥疾病進(jìn)程[20]。既往研究證實(shí)針灸可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路減輕血管性癡呆大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥[21]和創(chuàng)傷性腦損傷大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥[22]，提示其有減輕神經(jīng)炎癥的作用。而病毒感染后嗅覺障礙正與病毒感染過度激發(fā)機(jī)體免疫體系，致使嗅覺受體神經(jīng)元損傷有關(guān)。本研究中，對照組和聯(lián)合組治療4 周后靜脈血中MyD88、TLR4 和NF-κB p65 蛋白相對表達(dá)量較治療前均顯著降低，且后者降幅更大，揭示TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路與之相關(guān)。但針?biāo)幝?lián)合是否通過調(diào)控TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路來抑制炎癥反應(yīng)和改善嗅覺功能，還有待進(jìn)一步在細(xì)胞動(dòng)物層面對其進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，針?biāo)幝?lián)合可有效減少嗅裂氣流阻塞，減輕炎癥反應(yīng)，恢復(fù)病毒感染后嗅覺障礙患者的嗅覺功能，且該療效與TLR4/MyD88/NF-κB 通路有關(guān)，為病毒感染后嗅覺障礙的臨床治療提供一種新的可行方案。