丁曉明，鄭麗紅，孔菲，柏杉

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第四醫(yī)院消化內科，黑龍江哈爾濱 150001；3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第四醫(yī)院內分泌科，黑龍江哈爾濱 150001；4. 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科，黑龍江哈爾濱 150000）

嗅覺具有識別環(huán)境、辨識氣味、促進食欲等作用，而嗅覺障礙不僅嚴重影響人的生活質量，還會導致精神抑郁[1]。鼻竇炎癥性疾病、病毒感染和頭部創(chuàng)傷是誘發(fā)嗅覺障礙的主要致病因素，其中病毒感染后嗅覺障礙占所有門診嗅覺障礙患者的18.6%～29.3%[2]。相關研究顯示，病毒感染后嗅覺障礙繼發(fā)于細菌、真菌或病毒，包括近年的新冠病毒——嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS CoV-2）[3]。當前臨床治療病毒感染后嗅覺障礙的首選藥物為糖皮質激素、維生素A 和銀杏提取物等[4]，但治療效果不甚理想，治愈率不高，且部分藥物會誘發(fā)類似鼻刺激和鼻出血等并發(fā)癥。

針灸是傳統(tǒng)中醫(yī)的治療方式之一，具有副作用小、成本低、能緩解許多慢性免疫性疾病等優(yōu)點，在耳鼻喉科也廣泛應用。例如，針灸治療可降低患者耳鳴程度[5]、耳穴針刺可緩解成人扁桃體切除術后疼痛[6]、針灸治療變應性鼻炎的臨床效果不亞于藥物治療[7]。此外，亦有研究證實針灸在幫助病毒感染后嗅覺障礙患者恢復嗅覺功能及緩解病情具有較好的療效[8]，但其具體機制尚不清楚。

髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）/Toll 樣受體4（toll-like receptor 4, TLR4）/核轉錄因子-κB（nuclear factor-?B, NF-κB）信號通路的激活與嗅覺障礙密切相關。既往研究發(fā)現(xiàn)額葉癲癇患者的嗅覺障礙與嗅球組織中TLR4 受體和下游轉錄因子NF-κB p65 表達顯著增加有關[9]。此外，變應性鼻炎誘導的嗅覺功能障礙與嗅球小膠質細胞中TLR4/NF-κB 信號通路激活有關，表現(xiàn)為膠質細胞中TLR4、MyD88 和p-NF-κB p65 蛋白表達明顯上調[10-11]。

因此，本研究擬通過針刺內迎香穴和鼻丘穴聯(lián)合糠酸莫米松鼻噴霧劑治療病毒感染后嗅覺障礙，以評估針藥聯(lián)合的臨床效果，并進一步探索其調控機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2020年6月—2021年12月就診于黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科的病毒感染后嗅覺障礙患者104 例，隨機分為對照組和聯(lián)合組，每組52 例。納入標準：①感染前患者主觀感受嗅覺正常，有病毒感染或感冒病史；②就診檢查或主訴嗅覺異常、減退或喪失，以及表現(xiàn)出典型的上呼吸道感染癥狀；③接受類固醇治療1 個月以上仍未改善或緩解；④同意本研究治療方案。排除標準：①由于自身慢性免疫性疾病、神經退行性疾病、頭部創(chuàng)傷/創(chuàng)傷性腦損傷、精神疾病或醫(yī)源性原因導致的嗅覺喪失；②既往接受過鼻部或鼻竇手術；③糠酸莫米松鼻噴霧劑禁忌或過敏者；④拒絕參與研究者。兩組的性別構成、年齡、病程及嗅覺情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性（見表1）。本研究經醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者及家屬簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較 （n=52）

1.2 方法

1.2.1 治療方法對照組給予常規(guī)鼻用激素糠酸莫米松鼻噴霧劑[默沙東（中國）有限公司，批準文號：H20140100，規(guī)格：50 μg×60 撳]治療，每日噴鼻一次，持續(xù)4 周。聯(lián)合組采用針藥聯(lián)合的治療方式，即在常規(guī)糠酸莫米松鼻噴霧劑治療的基礎上，給予鼻內鏡下針灸針（華佗牌，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格：75 mm）針刺雙側內迎香穴（針尖沿著鼻唇溝向上斜刺約10～15 mm）和鼻丘穴（針尖稍向內上斜刺10～15 mm），平補平瀉，不使用特殊手法，留針30 min，1 次/d，持續(xù)4 周。兩組患者在治療期間和治療后均未發(fā)生不良事件，順利完成相應治療。

1.2.2 Sniffin Sticks 嗅棒測試評估嗅覺功能治療前后用Sniffin Sticks 嗅棒（德國Burghart Messtechnik有限公司，批號：LA-13-00207）檢測兩組患者雙側的嗅覺功能。測試時，取下筆帽，筆尖放在兩組患者的鼻前15 s，讓其在選項卡上選擇聞到的氣味。該測試由3 項子測試組成，分別為氣味閾值（threshold, T）、氣味辨別能力（discrimination, D）和氣味識別能力（identification, I）。各子測試總分為16分，3 個子測試總分之和為整體嗅覺得分，即48 分。TDI 評分≥30.5 分為嗅覺正常，TDI 評分為＞16.5～＜30.5 分為嗅覺減退，TDI 評分≤16.5 分為嗅覺缺失。治療前后的TDI評分差值≥6分為治療成功[12]。

1.2.3 T&T嗅覺計測試評估嗅覺功能將異戊酸、苯乙醇、甲基環(huán)戊烯酮、臭糞素和十一烷酸內酯5 種嗅物10 倍稀釋，稀釋后濃度為10-1～106，并依次標識為-1、0、1、2、3、4、5、6。其中，-1～1 為嗅覺正常，1.1～5.5 為嗅覺減退，＞5.6 為嗅覺喪失。

1.2.4 副鼻竇CT掃描評估嗅裂通氣情況用128×2-slice 雙源CT 掃描儀[Flash Definition，西門子（中國）有限公司]對兩組患者進行高分辨率副鼻竇CT掃描，以評估嗅裂通氣情況。根據(jù)CT 結果將嗅覺裂隙通氣模式分為正常、部分渾濁及完全渾濁。嗅裂通氣恢復正常為治愈，正常和渾濁減輕為改善。

1.2.5 Western blotting 檢測MyD88、TLR4 和NFκB p65 蛋白相對表達量采集兩組患者空腹外周靜脈血2 mL，置于肝素鈉抗凝管中。加1 mL 放射免疫沉淀法裂解緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，批號：R0010）提取總蛋白，二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（上海炎熙生物科技有限公司，批號：PD-BCA-500）定量，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將MyD88、TLR4 和NF-κB p65 蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。加入5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h，滴加一抗anti-MyD88（上海艾博抗貿易有限公司，批號：ab133739，1∶1 000）、anti-TLR4（上海艾博抗貿易有限公司，批號：ab13556，1∶1 000）和anti-NF-?B p65（上海艾博抗貿易有限公司，批號：ab288751，1∶1 000），4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3 次，滴加羊抗人IgG H&L 二抗（上海艾博抗貿易有限公司，批號：ab7153，1∶10 000），室溫孵育40 min。增強型化學發(fā)光（ECL）檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，批號：E412-01）顯色，曝光顯影。以β-actin 為內參，計算MyD88、TLR4 和NF-κB p65 蛋白相對表達量。

1.2.6 流式細胞術檢測外周靜脈血T 細胞亞群CD4+CD25+T 細胞和CD4+CD25highT 細胞的百分率采集兩組患者空腹外周靜脈血2 mL，置于肝素鈉抗凝管中。吸取50 μL 血液至各流式管，以CD3+和CD4+設門，篩選出CD3+CD4+T 細胞，再標記CD25。分別加入10 μL 熒光抗體，充分混勻，室溫避光反應15 min。滴加2 mL 溶血素，渦流混勻，室溫靜置10 min。離心，棄上清液，留存約50 μL 液體，用BeamCyte 流式細胞儀（常州必達科生物科技有限公司）檢測外周靜脈血T 細胞亞群CD4+CD25+T 細胞和CD4+CD25highT 細胞的百分率。其中，左側為對照管，右側為待檢管，CD25 平均熒光強度＞102定義為CD4+CD25highT 細胞。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗或配對t檢驗；計數(shù)資料以構成比或率（%）表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者治療前后TDI評分及差值比較

兩組患者治療前TDI 評分比較，經t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；兩組治療4 周后TDI評分比較，經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），聯(lián)合組高于對照組；兩組治療4 周后和治療前TDI 評分差值比較，經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

選取2017年1月～2018年4月在本院脊柱科門診及住院治療的脊柱骨關節(jié)病伴有腰椎不穩(wěn)患者30例，病程2～15個月，平均（6.45±2.58）個月。

表2 兩組患者治療前后TDI評分及差值比較（n=52，分，±s）

表2 兩組患者治療前后TDI評分及差值比較（n=52，分，±s）

組別對照組聯(lián)合組t 值P 值治療前12.35±0.18 12.40±0.22 1.371 0.173治療4周后15.90±1.54 18.64±1.44 9.369 0.000差值3.56±1.41 6.24±1.29 10.121 0.000

2.2 兩組患者T&T嗅覺計測試結果

兩組患者治療前T&T 嗅覺計測試結果比較，經t檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；兩組治療4 周后T&T 嗅覺計測試結果比較，經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），聯(lián)合組低于對照組；兩組治療4 周后和治療前T&T 嗅覺計測試差值比較，經t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組患者治療前后T&T嗅覺計測試結果及差值比較 （n=52，±s）

表3 兩組患者治療前后T&T嗅覺計測試結果及差值比較 （n=52，±s）

組別對照組聯(lián)合組t 值P 值治療前4.58±0.17 4.58±0.16 0.235 0.815治療4周后3.30±1.16 2.84±1.27 1.956 0.000差值-1.27±1.21-1.74±1.27 1.196 0.024

2.3 兩組患者嗅裂通氣情況比較

治療4 周后，對照組嗅裂通氣恢復正常9 例，治愈率為17.31%；嗅裂通氣改善13 例，改善率為25.00%。聯(lián)合組嗅裂通氣恢復正常15 例，治愈率為28.85%；嗅裂通氣改善22 例，改善率為42.31%。對照組和聯(lián)合組治愈率和改善率比較，經χ2檢驗，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=4.065 和6.486，P=0.044 和0.011），聯(lián)合組高于對照組。見表4。

表4 兩組患者嗅裂通氣模式比較 （n=52，例）

2.4 兩組患者靜脈血MyD88、TLR4和NF-κB p65蛋白相對表達量的比較

兩組患者靜脈血MyD88、TLR4 和NF-κB p65蛋白相對表達量治療前與治療4 周后比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），治療4 周后均低于治療前；兩組治療4 周后靜脈血MyD88、TLR4 和NF-κB p65蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），聯(lián)合組低于對照組。見圖1和表5。

表5 兩組患者靜脈血MyD88、TLR4和NF-κB p65蛋白相對表達量的比較 （n=52，±s）

表5 兩組患者靜脈血MyD88、TLR4和NF-κB p65蛋白相對表達量的比較 （n=52，±s）

注：?與治療前比較，P ＜0.05。

組別MyD88 TLR4治療4周后0.64±0.03?0.45±0.05?5.393 0.006治療4周后0.60±0.04?0.37±0.05?6.605 0.003治療前0.94±0.03 0.96±0.03 0.926 0.407治療前0.82±0.04 0.84±0.03 0.894 0.422治療4周后0.47±0.08?0.33±0.02?3.071 0.037對照組聯(lián)合組t 值P 值NF-κB p65治療前0.78±0.05 0.78±0.02 0.104 0.922

圖1 兩組患者靜脈血MyD88、TLR4和NF-κB p65蛋白表達

2.5 兩組患者靜脈血CD4+CD25+ T 細胞和CD4+CD25high T細胞百分率的比較

兩組患者靜脈血CD4+CD25+T 細胞百分率和CD4+CD25highT 細胞百分率治療前與治療4 周后比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），治療4 周后均高于治療前；聯(lián)合組與對照組患者治療4 周后靜脈血CD4+CD25+T 細胞百分率和CD4+CD25highT 細胞百分率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），聯(lián)合組高于對照組。見圖2和表6。

表6 兩組患者CD4+CD25+T細胞和CD4+CD25high T細胞百分率的比較 （n=52，%，±s）

表6 兩組患者CD4+CD25+T細胞和CD4+CD25high T細胞百分率的比較 （n=52，%，±s）

注：?與治療前比較，P ＜0.05。

組別對照組聯(lián)合組t 值P 值CD4+CD25+T細胞治療前5.32±0.11 5.34±0.07 1.106 0.271治療4周后1.05±0.05?1.25±0.07?16.765 0.000治療4周后5.75±0.04?6.67±0.05?103.609 0.000 CD4+CD25high T細胞治療前0.92±0.03 0.93±0.06 1.078 0.285

圖2 兩組患者靜脈血CD4+CD25+T細胞和CD4+CD25high T細胞百分率

3 討論

病毒感染后嗅覺障礙通常由病毒感染損傷嗅覺通路所致，是獲得性嗅覺功能障礙最常見的原因之一，可誘發(fā)病毒感染后嗅覺障礙患者永久性嗅覺減退或喪失。特別是近年來新冠病毒SARSCoV-2 肆虐，由此引發(fā)的病毒感染后嗅覺障礙后遺癥更是引起廣泛關注[13]。當前，病毒感染后嗅覺障礙的治療多采用手術、嗅覺訓練、米諾環(huán)素、糖皮質激素、銀杏葉提取物及α-硫酸鋅等治療方案，但存在療效有限、鼻刺激及非標準化等缺陷。

針灸治療不僅可提高健康人群的嗅覺敏感性，還在幫助病毒感染后嗅覺障礙患者恢復嗅覺功能方面具有很強的潛力。如VENT 等[14]證實相較于服用維生素B 復合物，針灸治療可使病毒感染后嗅覺障礙患者的TDI 評分由13.5 分增加至17.9 分；DAI等[15]發(fā)現(xiàn)針灸針刺改善11 例患者的嗅覺功能等。由于嗅黏膜的感受神經元可持續(xù)再生，人類的嗅覺神經系統(tǒng)具有可塑性，而針灸治療可通過各種嗅覺元件反復刺激嗅上皮和嗅覺通路，使受損的嗅覺功能有所恢復?；诖?，本研究在給予病毒感染后嗅覺障礙患者常規(guī)鼻用激素糠酸莫米松鼻噴霧劑的基礎上，用針灸針刺鼻雙側內迎香穴和鼻丘穴，結果發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合組的TDI 評分較對照組明顯增加，治愈者多了6 例，且T&T 嗅覺計測試數(shù)值變小，即病毒感染后嗅覺障礙患者的氣味識別能力增強，嗅覺功能得以改善。

迄今為止，病毒感染后嗅覺障礙確切的發(fā)病機制尚不清楚，但部分學者認為病毒感染過度激發(fā)機體免疫體系，致使嗅黏膜損傷，促進嗅覺受體神經元凋亡，從而導致患者嗅覺減退乃至喪失[16]。嗅覺神經上皮位于鼻腔與外部環(huán)境接觸的重要免疫屏障上，因此易受外源性損傷和內源性宿主過度防御的影響[17]。盡管嗅覺神經元及其祖細胞具有一定的再生能力，但長期的組織損傷終將導致特定的嗅覺神經上皮被呼吸道黏膜替代[18]，也就是說，病毒感染后嗅覺障礙患者可能經歷嗅覺功能障礙的消長，最終嗅覺減退及喪失。在給予糠酸莫米松鼻噴霧劑治療后，患者靜脈血中CD4+CD25+T 細胞和CD4+CD25highT 細胞百分率升高，尤其是具有調節(jié)活性的CD4+CD25highT 細胞較治療前有所增加，說明機體對病毒感染的免疫應答得到抑制。進一步給予針刺雙側內迎香穴和鼻丘穴，CD4+CD25+T 細胞和CD4+CD25highT 細胞百分率明顯上調，免疫抑制調節(jié)作用加強。此外，本研究副鼻竇CT 掃描結果也同樣證實機體免疫反應得以抑制。嗅裂由嗅上皮排列組成，后者含有嗅受體神經元，這些神經元的軸突在嗅球中以嗅絲和突觸的形式穿過篩狀板。由于病毒的侵襲，嗅裂可發(fā)生繼發(fā)性炎癥變化，導致黏膜水腫，隨后嗅裂變窄[19]。治療前病毒感染后嗅覺障礙患者嗅裂呈部分渾濁或完全渾濁，而給予糠酸莫米松鼻噴霧劑和針藥聯(lián)合均有效改善患者嗅裂通氣情況，使之趨于正常及渾濁減輕。其中，針藥聯(lián)合的療效顯著優(yōu)于傳統(tǒng)鼻噴霧劑治療，治愈率和改善率均較對照組明顯提升。

本研究結果均表明針藥聯(lián)合對病毒感染后嗅覺障礙患者嗅覺功能恢復有好處，然而，其潛在的調控機制尚不清楚。TLR4 屬免疫系統(tǒng)感受器，也是機體獲得性免疫和天然免疫之間的橋梁，可激活下游MyD88/NF-κB 通路，促進細胞因子釋放，從而參與炎癥疾病進程[20]。既往研究證實針灸可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路減輕血管性癡呆大鼠小膠質細胞炎癥[21]和創(chuàng)傷性腦損傷大鼠小膠質細胞、星形膠質細胞的炎癥[22]，提示其有減輕神經炎癥的作用。而病毒感染后嗅覺障礙正與病毒感染過度激發(fā)機體免疫體系，致使嗅覺受體神經元損傷有關。本研究中，對照組和聯(lián)合組治療4 周后靜脈血中MyD88、TLR4 和NF-κB p65 蛋白相對表達量較治療前均顯著降低，且后者降幅更大，揭示TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路與之相關。但針藥聯(lián)合是否通過調控TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路來抑制炎癥反應和改善嗅覺功能，還有待進一步在細胞動物層面對其進行驗證。

綜上所述，針藥聯(lián)合可有效減少嗅裂氣流阻塞，減輕炎癥反應，恢復病毒感染后嗅覺障礙患者的嗅覺功能，且該療效與TLR4/MyD88/NF-κB 通路有關，為病毒感染后嗅覺障礙的臨床治療提供一種新的可行方案。