王智蘭 韓康妮 杜曉芬 李禹欣 連世超 王 軍

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)谷子研究所/雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/雜糧種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 長治 046011)

GRAS基因家族編碼一類植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、脅迫應(yīng)答、分生組織形成等眾多生物學(xué)過程，在植物組織的生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用[1]。谷子作為世界性主要雜糧作物之一，基因組小，具有營養(yǎng)價值高、耐逆和高光效等特點(diǎn)，已經(jīng)成為遺傳和分子生物學(xué)研究的C4模式作物之一[2]。因此，鑒定GRAS家族基因并研究其在不同激素和逆境脅迫下的表達(dá)特性，對利用該家族基因進(jìn)行谷子株高、產(chǎn)量和耐逆等性狀的遺傳改良具有重要意義。

GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族命名來源于最初發(fā)現(xiàn)的3個家族成員GAI[3]、RGA[4]和SCR[5]。GRAS蛋白一般由400～700個氨基酸組成，其C端序列高度保守，一般由5個典型的結(jié)構(gòu)域組成，即LHRI、VHIID、LHRII、PFYRE和SAW基序[6]。相比而言，GRAS蛋白N端含有不同的固有無序區(qū)域，使得該類蛋白可以通過改變N端結(jié)構(gòu)來靈活地特異性識別配體，因此，GRAS家族表現(xiàn)出功能多樣性[7]，包括參與赤霉素[8]、光信號[9-11]和油菜素內(nèi)酯[12]等多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控腋芽[13]、根[14-15]、分生組織生長[16-17]、分蘗[18]以及維持頂端優(yōu)勢[19-21]等，響應(yīng)植物對鹽、干旱[22]、遮蔽[23]和重金屬[24]等非生物脅迫，并參與雄配子的形成過程[25]。根據(jù)N端結(jié)構(gòu)域的差異，GRAS家族蛋白一般分為SCL3、SHR、PAT1、LISCL、DELLA、SCR、LS、DLT、SCL4/7和HAM等10個亞家族[26-28]。SCR亞家族蛋白N端包含與其他蛋白互作所必需的結(jié)構(gòu)域，在抑制不對稱細(xì)胞分裂中起作用[29]；DELLA亞家族蛋白N端存在GA信號的感知結(jié)構(gòu)域，水稻的SLR1[30]，擬南芥的GID1[31]、RGA[32]、GAI[33]、以及RGL1、RGL2和RGL[34]等都屬于DELLA蛋白。目前，已經(jīng)在擬南芥[26]、水稻[26,35]、大豆[36]、小麥[37]、大麥[38]、藜麥[39]、大白菜[40]、人參[41]和胡桃[42]等30余種植物中對GRAS基因家族進(jìn)行了鑒定和分析。

隨著谷子基因組的公布[43-44]，bZIP、DREB、TCP和MYB等轉(zhuǎn)錄因子基因家族已被相繼鑒定[45-46]，但谷子GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因家族相關(guān)研究仍鮮有報道。鑒于此，本研究通過生物信息學(xué)方法對谷子全基因組GRAS轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員進(jìn)行鑒定，對所有成員的理化信息、結(jié)構(gòu)功能、表達(dá)模式等進(jìn)行分析。同時，利用實(shí)時熒光定量(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)分析33個GRAS基因在4種植物激素和2種非生物脅迫條件下的表達(dá)模式，旨在為進(jìn)一步解析GRAS基因家族的功能奠定基礎(chǔ)。另外，根據(jù)DELLA亞家族基因SiGRAS23序列差異開發(fā)分子標(biāo)記，并在遺傳群體中進(jìn)行檢測，以期為今后谷子株高分子標(biāo)記輔助選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 谷子全基因組GRAS蛋白的鑒定及理化性質(zhì)分析

從Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)數(shù)據(jù)庫下載谷子蛋白數(shù)據(jù)，從Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)中下載GRAS家族的隱馬氏模型文件(Pfam號碼：PF03514)[47]，通過HMMER軟件對谷子蛋白進(jìn)行相似性搜索，找到GRAS家族蛋白序列，使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和CDD(http://www.Ncbi.Nlm.Nih.Gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)檢測蛋白結(jié)構(gòu)域[48]，過濾結(jié)構(gòu)不完整的序列。最后，使用 ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)查找谷子GRAS蛋白的相關(guān)信息，包括氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)和親水性平均值(grand average of hydropathicity，GRAVY)。

1.2 谷子GRAS家族系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

用ClustalW對52個谷子(Setariaitalia)SiGRAS、34個擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtGRAS[26]、56個水稻(Oryzesativa)OsGRAS[26]、84個玉米(Zeamays)ZmGRAS[27]、80個高粱(Sorghumbicolor)SbGRAS[27]和48個短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdGRAS[28]等GRAS家族基因氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對，利用MEGA-X軟件中鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展值(Bootstrap)設(shè)為1 000。參考AtGRAS和OsGRAS蛋白的分類信息[35]對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行聚類分析，利用網(wǎng)站Evolview v3(https://www.evolgenius.info/evolview/#login)進(jìn)行進(jìn)化樹美化[49]。

1.3 谷子GRAS基因結(jié)構(gòu)和家族成員保守結(jié)構(gòu)域分析

從Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)數(shù)據(jù)庫下載谷子基因組GRAS序列信息。根據(jù)谷子GRAS家族成員的基因組DNA序列及編碼區(qū)序列(coding sequence, CDS)，利用GSDS 2.0軟件[50](http://gsds.cbi.pku.edu.cn)分析其基因結(jié)構(gòu)。利用在線預(yù)測軟件MEME[51](http://eme.nbcr.net/meme/tools/meme)預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域查找的最大數(shù)值設(shè)定為15。

1.4 SiGRAS的組織表達(dá)分析

從谷子全生育期基因表達(dá)圖譜和多組學(xué)數(shù)據(jù)庫(http://sky.sxau.edu.cn/MDSi.htm)下載晉谷21號生長發(fā)育過程中各組織器官的RNA-Seq數(shù)據(jù)[44]，包括19個不同的組織(T1～T19)：萌發(fā)3 d種子(T1)、兩葉一心齡整株苗(T2)、抽穗后2 d的頂2和3葉(T3)、灌漿期的穗下節(jié)間(T4)、灌漿期的旗葉(T5)、灌漿期的旗葉葉鞘(T6)、灌漿期的莖(T7)、灌漿期的頂部第4葉(T8)、灌漿期的頂部第4葉(T9)、灌漿期的根(T10)、分化初始階段穗(T11)、分化第3階段穗(T12)、未成熟的圓錐花序S2(T13)、未成熟的圓錐花序S4(T14)、灌漿期種子S1(T15)、灌漿期種子S2(T16)、灌漿期種子S3(T17)、灌漿期種子S4(T18)和灌漿期種子S5(T19)，以此分析谷子GRAS基因的組織表達(dá)特性。利用SPSS軟件包中的Zscore方法，對各成員基因在各組織中表達(dá)的FPKM值進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，用TBtools[52]繪制SiGRASs的組織表達(dá)熱圖。

1.5 SiGRAS啟動子區(qū)域順式作用元件預(yù)測

下載SiGRASs啟動子序列(起始密碼子ATG上游1.5 kb)(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。將獲得的啟動子序列提交到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，進(jìn)行順式作用元件預(yù)測。

1.6 qRT-PCR表達(dá)分析

根據(jù)GRAS基因家族啟動子順式作用元件預(yù)測結(jié)果，采用qRT-PCR方法，選取33個谷子GRAS基因(涵蓋了該家族的10個亞類)用于分析這些基因?qū)ιL素(吲哚乙酸，indole-3-acetic acid, IAA)、赤霉素(gibberellin A3, GA3)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、脫落酸(abscisic acid, ABA)、干旱(PEG6000)和冷(4℃)處理下的表達(dá)規(guī)律。選擇飽滿的長農(nóng)35號種子播種于營養(yǎng)缽(營養(yǎng)土∶蛭石=1∶1)，放置于光照培養(yǎng)箱(RTOP-268Y，托普云農(nóng)，浙江)中，生長條件為光照14 h 30℃/黑暗10 h 25℃，待幼苗長至兩葉一心時，分別用5 μmol·L-1IAA、100 μmol·L-1GA3、100 μmol·L-1MeJA、100 μmol·L-1ABA、20% PEG-6000和4℃分別處理幼苗，分別采集對照植株和處理后1、3、6和12 h的植株葉片。按照RNAiso Plus試劑盒(TaKaRa，日本)和步驟說明提取總RNA，采用PrimeScript Ⅱ 1ststrand cDNA synthesis kit(TaKaRa，日本)反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qRT-PCR引物見附表S1。以谷子ACTIN作為內(nèi)參基因。通過CFX96 Real-time PCR儀(Bio-Rad，美國)采集熒光實(shí)時定量數(shù)據(jù)，反應(yīng)體系為10 μL：cDNA template(反轉(zhuǎn)錄第一鏈)1 μL、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TAKARA,日本)5 μL、2 μmol·L-1特異引物1 μL，ddH2O 3 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。65～98℃繪制溶解曲線。采用比較閾值法進(jìn)行定量分析。程序結(jié)束后，根據(jù)Ct值計算C值，公式如下：

C=2-ΔCt(ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因)

3次重復(fù)的C值平均值為目的基因的相對表達(dá)量。采用SPSS 19軟件中單因素方差分析方法進(jìn)行相對表達(dá)量顯著性差異檢測(P<0.05)。

1.7 DELLA蛋白基因SiGRAS23分子標(biāo)記開發(fā)

前期研究利用谷子矮寧黃×?xí)x谷21號的F2分離群體，定位了7個與谷子株高相關(guān)的QTL，其中第5號染色體上存在3個株高QTL，分別為qPH5-1、qPH5-2、qPH5-3，qPH5-2的遺傳效應(yīng)值較大[53]。因此，本研究在上述定位區(qū)間內(nèi)搜索相關(guān)GRAS基因家族成員，通過克隆測序，檢測目標(biāo)基因在矮寧黃和晉谷21號中的等位變異，開發(fā)分子標(biāo)記，并在矮寧黃×?xí)x谷21號的F5群體(AJF5)中192個株系中進(jìn)行檢測，結(jié)合株高表型值，進(jìn)行相關(guān)性分析。同時，從谷子種質(zhì)資源中隨機(jī)選取株高表型變異從75.0～173.7 cm材料37份(附表S2)，利用開發(fā)的分子標(biāo)記檢測上述材料的基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子GRAS家族成員的鑒定及分析

利用HMMER軟件共獲得62個GRAS候選蛋白，使用SMART和CDD工具檢測保守結(jié)構(gòu)域，刪除結(jié)構(gòu)不完整的序列，最終保留52條具有完整谷子GRAS結(jié)構(gòu)域序列。以SiGRAS命名谷子GRAS基因，將所對應(yīng)的52條DNA序列作為谷子GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族的候選基因。染色體定位結(jié)果顯示，除第Ⅵ染色體上無GRAS外，52個SiGRASs呈不均勻狀態(tài)分布在谷子8條染色體上(表1)。不同GRAS轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列存在較大差異，氨基酸長度362～734 aa，蛋白分子量39.81～100.09 kDa，等電點(diǎn)為4.85～9.53，其中等電點(diǎn)小于7的GRAS蛋白有43個，偏酸性蛋白居多。除Seita.2G374000、Seita、3G137200和Seita.9G576800外，其余蛋白均具有親水性(表1)。

表1(續(xù))

2.2 谷子GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)發(fā)育分析

為深入理解谷子GRAS的進(jìn)化關(guān)系，通過構(gòu)建谷子與擬南芥(34個)、水稻(56個)、玉米(84個)、高粱(80個)和短柄草(48個)GRAS蛋白進(jìn)化樹，對系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行聚類分析(圖1)。結(jié)果表明，谷子中52個GRAS轉(zhuǎn)錄因子家族可分成LISCL、PAT1、SCR、DELLA、DLT、SCL3、SHR、LAS、SCL4/7和HAM等10個亞家族(圖1)，其中LISCL亞家族成員最多，含15個蛋白；DLT和SCL4/7亞家族成員最少，各含1個蛋白。

圖1 谷子、擬南芥、水稻、玉米、短柄草和高粱的GRAS家族系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of GRAS gene family in Setaria italica, Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Zea mays, Sorghum bicolor and Brachypodium distachyon

2.3 GRAS基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守域分析表明，SiGRASs多數(shù)無內(nèi)含子，同一亞家族內(nèi)，基因結(jié)構(gòu)基本一致，保守基序具有相似性，暗示同一個亞家族的基因具有相似功能。所有SiGRAS蛋白都擁有由LHRI、VHIID、LHRII、PFYRE和SAW在C末端組成的GRAS結(jié)構(gòu)域，與保守的C末端相比，SiGRAS蛋白的N末端序列在各亞族間差異較大。在同一亞家族中，SiGRAS蛋白質(zhì)的氨基酸序列表現(xiàn)出高度一致性(圖2)。

注：外顯子和內(nèi)含子分別用黑色方框和黑色線條表示，UTR用淺灰色方框表示。不同顏色代表不同的結(jié)構(gòu)域。Note: Exons and introns were indicated by dark boxes and dark lines respectively, UTRs were indicated by light grey boxes. Different motifs were displayed in different colors.圖2 谷子GRAS基因家族的進(jìn)化樹、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Phylogenetic tree, gene structure and conserved domain of GRAS gene family in foxtail millet

2.4 SiGRAS的組織表達(dá)分析

為初步分析SiGRASs的功能，根據(jù)MDSi數(shù)據(jù)庫中不同組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段(fragments per kilobase, FPKM)，對52個SiGRASs組織表達(dá)特性進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，不同GRAS在谷子不同組織器官中的表達(dá)量存在明顯差異，SHR亞族中各基因均在根中有較高的表達(dá)量，DELLA亞族中的Seita.5G243400和Seita.9G123000在莖中有較高的表達(dá)量，LISCL亞族中的Seita.9G453600和Seita.5G377500、PAT1亞族的Seita.2G369400、HAM亞族中的Seita.4G003600和Seita.1G262900在葉中有較高的表達(dá)量。另外，本研究發(fā)現(xiàn)一類特殊現(xiàn)象，即42.3%的基因在各組織器官中表達(dá)量很低(圖3)，研究共檢測到22個這樣的基因，包括LISCL亞族中的Seita.3G066300、Seita.3G066400、Seita.3G066200、Seita.9G174600、Seita.9G174900、Seita.7G112100、Seita.3G380300、Seita.7G268200和Seita.7G268300；SCR亞族中的Seita.3G200500；DELLA亞族中的Seita.3G137200和Seita.8G129500；SCL3亞族中的Seita.7G317100、Seita.7G317000、Seita.8G026600、Seita.3G266500和Seita.3G266700；SHR亞族中的Seita.3G189300；HAM亞族中的Seita.7G294300、Seita.8G042700、Seita.9G455500和Seita.7G100800。

2.5 SiGRAS啟動子順式作用元件預(yù)測與分析

SiGRAS含有多種與植物生長發(fā)育相關(guān)的順式作用元件，如光反應(yīng)、胚乳表達(dá)、分生組織表達(dá)、晝夜節(jié)律、細(xì)胞周期、多種植物激素以及與逆境相關(guān)的順式作用元件，表明SiGRAS廣泛參與谷子的生長發(fā)育。對激素以及與逆境相關(guān)的順式作用元件進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其中43個SiGRAS含有響應(yīng)脫落酸的ABRE元件、46個SiGRAS含有響應(yīng)茉莉酸甲酯的CGTCA-motif或TGACG-motif元件、27個SiGRAS含有響應(yīng)生長素的TGA-element或AuxRR-core元件、27個SiGRAS含有響應(yīng)赤霉素的P-box、TATC-box或GARE-motif元件以及19個SiGRAS含有響應(yīng)冷脅迫的LTR元件。

2.6 SiGRAS在不同激素和逆境下表達(dá)模式分析

圖3 GRAS基因在谷子不同組織和不同發(fā)育時期的表達(dá)模式分析Fig.3 Expression profile analysis of GRAS genes in different tissues and different developmental stages of foxtail millet

根據(jù)上述順式作用元件預(yù)測結(jié)果，選取33個SiGRAS，分別對其在IAA、MeJA、GA3、ABA、4℃和PEG-6000處理1、3、6和12 h后的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，33個SiGRASs均響應(yīng)激素和非生物脅迫，但表達(dá)水平不同。18個基因(包括Seita.3G066400、Seita.3G066200、Seita.8G250200、Seita.7G112100、Seita.3G380300、Seita.7G268300、Seita.1G273300、Seita.3G200500、Seita.5G418700、Seita.4G017100、Seita.8G026600、Seita.7G317000、Seita.3G266700、Seita.2G374000、Seita.3G189300、Seita.1G048800、Seita.4G219200和Seita.7G294300)雖然對各種激素和逆境有不同程度的響應(yīng)，但是表達(dá)仍處于較低水平。因此，本試驗(yàn)選取在不同激素和逆境處理下葉片中相對表達(dá)量較高的15個SiGRAS進(jìn)行重點(diǎn)分析，PAT1亞族中Seita.2G369400對6種不同的處理響應(yīng)最為敏感，而LISCL亞族Seita.9G453600 和HAM亞族Seita.4G003600對各種處理響應(yīng)不明顯；在4℃脅迫下，大部分基因在處理1、3 h 后表達(dá)逐漸上調(diào)，但在6 h后表達(dá)量逐漸下降；在IAA處理下，大部分基因在處理1 h后表達(dá)量急劇下降，而在 6 h 后又有小幅回升，但仍低于對照的表達(dá)水平；在MeJA、GA3、ABA、4℃和PEG-6000處理下，除Seita.2G369400外，大部分基因在1 h的表達(dá)量輕微上調(diào)或維持不變，在3 h后表達(dá)量逐漸下降(圖4)。

圖4 不同激素和逆境脅迫下SiGRAS的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of SiGRASs under different hormone and abiotic stress

對6種處理后6 h的基因相對表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，與CK相比，在IAA處理下，Seita.9G174600顯著上調(diào)表達(dá)，大多數(shù)基因顯著下調(diào)表達(dá)，5個表達(dá)無顯著差異；在GA3、MeJA、ABA和PEG處理下，除Seita.4G003600外，其余均顯著下調(diào)表達(dá)；而在低溫脅迫下，Seita.5G377500、Seita.3G236000和Seita.9G576800顯著上調(diào)表達(dá)，而Seita.5G377500、Seita.5G243400和Seita.9G112200顯著下調(diào)表達(dá)。Seita.7G209700、Seita.2G369400、Seita.5G243400和Seita.5G450300在4種激素和2種脅迫下相比對照均顯著下調(diào)表達(dá)(圖5)。

注：*和**分別表示在P<0.05和P<0.01水平差異顯著。Note: * and ** mean significant difference at 0.05 and 0.01 level, respectively.圖5 15個GRAS基因在谷子激素和逆境脅迫處理6 h后的表達(dá)模式分析Fig.5 Expression profile analysis of 15 SiGRAS genes at 6 h after different hormones and abiotic stresses treatment

2.7 DELLA蛋白基因SiGRAS23分子標(biāo)記開發(fā)

在前期矮寧黃×?xí)x谷21號的F2群體定位的株高QTL區(qū)間基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)2個DELLA蛋白編碼基因SiGRAS23(Seita.5G243400)和SiGRAS26(Seita.5G418700)分別位于qPH5-2和qPH5-1區(qū)間內(nèi)或附近，分別擴(kuò)增上述基因的序列(表2)。比對分析后發(fā)現(xiàn)，SiGRAS26在雙親中無差異位點(diǎn)，而SiGRAS23在雙親間存在7個差異位點(diǎn)，其中CDS區(qū)存在2個SNP，啟動子區(qū)存在3個SNP和2處InDel。根據(jù)這些差異位點(diǎn)，本研究開發(fā)了D8-1、D8-2和D8-3等3個分子標(biāo)記，分別位于啟動子區(qū)-871 bp、啟動子區(qū)-349 bp、CDS區(qū)627 bp(圖6-A，表2)。利用開發(fā)的標(biāo)記D8-1對190份AJF5(矮寧黃×?xí)x谷21號)群體株系和37份株高差異較大的谷子材料進(jìn)行基因型檢測，將矮寧黃基因型命名為D8-1-A，晉谷21號基因型命名為D8-1-J，雜合基因型命名為D8-1-A/J，結(jié)果表明，分子標(biāo)記D8-1與AJF5(矮寧黃×?xí)x谷21號)群體中株高緊密連鎖(P<0.01)(圖6-B)；在37份谷子親本材料中，矮88、矮97、石矮大-1等矮桿材料與矮寧黃基因型一致，D8-1-A基因型材料的株高與另外2種基因型材料的株高存在顯著差異，但D8-1-J基因型和D8-1-A/J基因型的材料間株高差異不顯著(圖6-C，附表S2)，表明該基因可能與株高遺傳相關(guān)，D8-1-A可能是谷子矮桿變異相關(guān)的基因型之一。

3 討論

在植物中GRAS基因家族編碼的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量眾多，功能多樣，參與調(diào)控許多重要生長發(fā)育過程。目前，該基因家族已經(jīng)在多個物種中被鑒定，如在擬南芥[26,54]、水稻[26]、大豆[36]、小麥[37]、高粱[27]、玉米[27]、短柄草[28]、大麥[38]、藜麥[39]、大白菜[40]、人參[41]、大麻[22]和胡桃[42]分別鑒定出34、56、117、153、80、86、48、59、54和52個GRAS家族成員。本研究從谷子全基因組數(shù)據(jù)庫中獲得了52個GRAS家族成員，與水稻、短柄草和藜麥等作物中的數(shù)量相似，96%蛋白均具有親水性，與前人結(jié)果一致[55]。根據(jù)進(jìn)化樹分支，結(jié)合擬南芥、水稻、玉米、高粱和短柄草同源基因的分類方法，將谷子GRAS家族同樣分為10個亞類。

表2 DELLA蛋白基因SiGRAS23和SiGRAS26分段擴(kuò)增引物及標(biāo)記開發(fā)引物Table 2 Amplified primers and marker development primers of DELLA protein encoding gene SiGRAS23 and SiGRAS26

注：A圖：SiGRAS23在矮寧黃和晉谷21號間的序列差異和分子標(biāo)記開發(fā)，不同數(shù)字代表距基因起始密碼子的位置，D8-1、D8-2、D8-3分別為開發(fā)的分子標(biāo)記，A：矮寧黃，J：晉谷21號，A/J：雜合基因型；B圖：D8-1在AJF5群體株系中的基因型檢測；C圖：D8-1在37份材料中的基因型檢測。字母a和b表示不同等位變異間的顯著差異(P<0.01)。Note: Figure A: Sequence difference and molecular markers development between Aininghuang and Jingu 21. Different numbers represent the position from the start codon of the gene. D8-1, D8-2 and D8-3 are the developed molecular markers, respectively. A: Aininghuang. J: Jingu 21. A/J: the heterozygous genotype line. Figure B: Genotyping in lines of AJF5 with D8-1. Figure C: Genotyping in 367materials with D8-1. a and b indicate significant differences at 0.01 level.圖6 SiGRAS23在矮寧黃和晉谷21號間的序列差異和分子標(biāo)記開發(fā)以及在不同材料中的基因型檢測Fig.6 Sequence difference and molecular markers development between Aininghuang and Jingu 21, and genotyping in materials of SiGRAS23

SiGRAS各亞家族基因的組織器官表達(dá)特性分析表明，谷子各亞族基因與擬南芥中已報道同類亞族基因的表達(dá)特性和相應(yīng)功能基本一致。大多數(shù)谷子PAT亞家族基因在葉中表達(dá)量較高，而葉是感受光信號的主要部位，推測該類基因在谷子phyA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮作用；SHR蛋白參與根系徑向形態(tài)的維持和根系生長[56-57]。谷子SHR亞族中各基因均在根中有較高的表達(dá)量，其對根系發(fā)育的調(diào)控作用有待進(jìn)一步研究；DELLA蛋白通過GA應(yīng)答反應(yīng)調(diào)控植物莖的伸長[1,3-4]。本研究中，Seita.5G243400和Seita.9G123000等DELLA亞族中的基因在莖中有較高的表達(dá)量，推測這些基因可能通過莖的生長發(fā)育來調(diào)控谷子株高等性狀。另外，谷子GRAS各亞族基因的組織表達(dá)特異性與水稻、短柄草、大豆中各亞族的組織表達(dá)特異性一致[26,28,36]。GRAS各亞類基因在不同物種中的保守表達(dá)譜表明，同源基因可能在這些特定的組織器官發(fā)育中發(fā)揮相同或相似的作用。

植物對各種激素和環(huán)境脅迫的應(yīng)答中需要GRAS蛋白的參與[1-4,20-22]。本研究中，SiGRASs啟動子區(qū)域存在多個與激素或逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，經(jīng)生長素、赤霉素、茉莉酸甲酯、脫落酸、干旱和冷等6種不同的處理后發(fā)現(xiàn)，33個SiGRAS表達(dá)水平存在較大差異，在同一亞族成員之間也存在較明顯差異。在短柄草[28]、楊樹[35]、梅花[55]和番茄[58]GRAS同一亞族不同基因中也出現(xiàn)類似的結(jié)果，表明同一亞族各基因在非生物脅迫反應(yīng)和激素介導(dǎo)的信號通路中的作用可能不同。另外，本研究中，谷子PAT1亞族中Seita.2G369400對6種不同的處理響應(yīng)最為敏感，暗示該基因是谷子在激素響應(yīng)和逆境脅迫中的一個重要基因。GRAS家族PAT1分支基因不僅在光敏色素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用，也直接影響植物抗逆過程，該亞族中已報道的SlGRAS4[58]、AtGAI[59]和BdGRAS[60]等基因能積極響應(yīng)低溫脅迫。DELLA蛋白是GA信號關(guān)鍵負(fù)向調(diào)節(jié)因子，本研究中的3個DELLA亞族基因Seita.5G243400、Seita.9G123000和Seita.5G418700在GA3處理后的3、6、12 h均表現(xiàn)為下降趨勢?；蚣易逋ǔＴ诨蚪M中具有多個拷貝，這些基因表現(xiàn)出功能冗余性和特異性，5個MIR172基因在調(diào)控植物分生組織大小、葉片下表皮毛起始、莖的伸長、側(cè)枝發(fā)生以及開花時間上具有冗余性[60]，推測本研究中表達(dá)量極低的基因也存在基因冗余，但還需大量試驗(yàn)驗(yàn)證。

DELLA蛋白是GAs代謝通路中的負(fù)調(diào)控因子，屬于植物特有的GRAS家族，調(diào)控植物生長發(fā)育，但其結(jié)構(gòu)域相對復(fù)雜[1,3-4,34-38]。在擬南芥GRAS家族中共有5個DELLA蛋白，其N端均含有DELLA和VHYNP典型的結(jié)構(gòu)域[26,54]，在水稻中，DELLA亞家族成員中僅有OsSLR1含有DELLA和VHYNP結(jié)構(gòu)域，而與其同聚為DELLA亞族的OsSLRL1和OsSLRL2并不含有這2個結(jié)構(gòu)域[61]，短柄草DELLA亞家族成員BdSLR1含有DELLA和VHYNP結(jié)構(gòu)域而BdSLRL1不存在該結(jié)構(gòu)域[28]，在玉米中也出現(xiàn)了類似現(xiàn)象，但這些蛋白均作為GA信號的阻遏蛋白調(diào)控植株的生長發(fā)育，過表達(dá)這些基因的植株均表現(xiàn)為矮化。在本研究中，谷子DELLA亞家族有5個基因，除Seita.9G123000中發(fā)現(xiàn)DELLA結(jié)構(gòu)域，其余4個蛋白均未發(fā)現(xiàn)DELLA結(jié)構(gòu)域，這與水稻[26,61]、短柄草[28]、藜麥[39]中GRAS家族DELLA亞族結(jié)果相似。目前，對該現(xiàn)象的解釋可能是，GRAS基因通過復(fù)制增加基因拷貝數(shù)，不同拷貝數(shù)導(dǎo)致基因序列發(fā)生改變，這些序列差異決定了功能特異的各種蛋白質(zhì)。在這種情況下，DELLA蛋白復(fù)制DELLA、TVHYNP和polyS/T/V等功能結(jié)構(gòu)域序列。研究人員推測GRAS序列復(fù)制可能發(fā)生在單子葉植物和雙子葉植物分化之前，雙子葉植物中存在DELLA基因復(fù)制事件，而單子葉植物中不存在DELLA基因復(fù)制[61]。DELLA結(jié)構(gòu)域的有無是否會影響谷子DELLA蛋白的功能，還有待下一步研究。

SiDWARF1(Seita.9G123000)編碼的DELLA蛋白，是目前谷子中唯一報道的GRAS家族基因，其突變體84133植株表現(xiàn)矮化[62]。本研究結(jié)合先前本課題組對谷子矮寧黃×?xí)x谷21號F2分離群體株高性狀的QTL定位[53]，發(fā)現(xiàn)第V染色體與株高相關(guān)的QTL區(qū)間中包含2個編碼DELLA蛋白的基因(SiGRAS23和SiGRAS26)。目前已知，根據(jù)SiGRAS23變異位點(diǎn)開發(fā)的分子標(biāo)記D8-1與AJF5群體株高性狀緊密連鎖，下一步本研究小組擬從株高性狀QTL的精細(xì)定位、克隆以及SiGRAS23基因功能驗(yàn)證兩方面開展相關(guān)研究，以探明編碼DELLA蛋白的SiGRAS23基因與株高的關(guān)系。此外，谷子中常見的矮桿材料，如矮88、矮97和石矮大-1等基因型均為D8-1-A，但也有少數(shù)材料的基因型和株高表型不相符，如晉谷20號、東山谷、合光3號、六十天還家(見附表S2)。鑒于株高為數(shù)量性狀控制，推測這些材料中存在其他控制株高的主效基因或位點(diǎn)，有待于進(jìn)一步發(fā)掘和利用。

4 結(jié)論

本研究對谷子GRAS基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定，共發(fā)現(xiàn)52個SiGRAS家族成員，可分為10個亞類。除第Ⅵ染色體上無GRAS基因外，其余8條染色體上均有SiGRASs分布，且具有典型的C端GRAS保守域和N端高度可變特異結(jié)構(gòu)域。不同亞族基因表達(dá)具有明顯的組織表達(dá)特異性，不同程度地響應(yīng)生長素、赤霉素、茉莉酸甲酯、脫落酸等激素以及干旱和冷等脅迫。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DELLA亞族中的SiGRAS23在遺傳群體AJF5的雙親矮寧黃和晉谷21號間存在序列差異，據(jù)此開發(fā)的標(biāo)記D8-1與該群體株高性狀緊密連鎖，D8-1-A可能是谷子矮桿的優(yōu)異等位變異之一。

表S1 qRT-PCR所用引物信息Table S1 Primers used for qRT-PCR

表S2 37份谷子材料信息Table S2 Profiles of 37 foxtail millet