李亞男，高峰，陳宗馥，李世嬌，林蠡

（廣東省水環(huán)境與水產(chǎn)品安全工程技術(shù)研究中心，廣州市水產(chǎn)病害與水禽養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225）

羅非魚（Oreochroinis mossambicus）原產(chǎn)非洲，又名非洲鯽魚，屬鱸形目（Perciformes）、麗魚科（Cichlidae），廣泛分布于熱帶、亞熱帶的淡水和咸淡水交界水域。因其具有食性廣、生長快、繁殖力和抗病能力強(qiáng)等特點(diǎn)，在養(yǎng)殖方面得到廣泛推廣，是全球重要的養(yǎng)殖魚類之一，目前已在全世界85個(gè)國家和地區(qū)進(jìn)行養(yǎng)殖。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）有關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2012年，全球羅非魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)456萬t，隨后逐年遞增，到2015年產(chǎn)量達(dá)到了640萬t。我國羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)量自2000年以來一直占世界羅非魚總產(chǎn)量的50%以上，2017年，我國羅非魚產(chǎn)量更是達(dá)到170多萬t。然而，伴隨著養(yǎng)殖密度的加大以及養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的水質(zhì)惡化等一系列因素，羅非魚病害也隨之增多。

羅非魚湖病毒（TiLV）是一種新型的單股負(fù)鏈RNA病毒，隸屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae），可引起羅非魚湖病毒病（TiLVD），該病可感染幾乎所有的羅非魚種類，致死率高達(dá)80%～100%。該病毒首次從2009年以色列、厄瓜多爾、埃及、泰國等地區(qū)暴發(fā)大規(guī)模羅非魚死亡事件中被分離鑒定。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）、亞太地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖中心網(wǎng)（NACA）、FAO等多個(gè)國際組織，于2017年5月針對TiLV發(fā)布公告或預(yù)警。2018年起，我國海關(guān)總署、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部也將TiLVD列為水產(chǎn)動(dòng)物疫病檢疫與監(jiān)測對象。2020年7月，又將TiLVD列為二類動(dòng)物疫病進(jìn)行防控。鑒于TiLV對羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的嚴(yán)重威脅，現(xiàn)從TiLVD的流行病學(xué)研究、病原研究以及診斷與防治等方面進(jìn)行綜述，以期為TiLVD的基礎(chǔ)研究和疫病防控提供相關(guān)參考。

1 羅非魚湖病毒病及其流行病學(xué)研究

1.1 發(fā)現(xiàn)歷史與地理分布

TiLVD最早暴發(fā)于以色列養(yǎng)殖和野生羅非魚群體間，造成集體死亡。2011年，厄瓜多爾Chitralada品系羅非魚以及尼羅羅非魚暴發(fā)羅非魚合胞體肝炎（SHT），之后經(jīng)鑒定，均為TiLVD。2012—2016年夏，埃及暴發(fā)中、大規(guī)格尼羅羅非魚死亡事件，平均死亡率達(dá)到9.2%。2015—2017年，泰國養(yǎng)殖的紅羅非魚和尼羅羅非魚暴發(fā)“羅非魚一個(gè)月死亡綜合征（TOMMS）”，累計(jì)死亡率在20%～100%，后病原被證實(shí)為TiLV。

近年來，TiLVD呈逐年擴(kuò)散趨勢，自2014年起，亞洲、南美洲和非洲均已檢測和分離出TiLV。到目前為止，TiLVD已在哥倫比亞、厄瓜多爾、以色列、埃及和泰國等國家流行，對馬來西亞、印度、印度尼西亞、坦桑尼亞、烏干達(dá)、菲律賓和秘魯?shù)热?3個(gè)羅非魚貿(mào)易頻繁國家和地區(qū)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。依據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，推測包括中國在內(nèi)的全球40多個(gè)國家的TiLV可能來自進(jìn)口的泰國孵化場羅非魚魚苗。

1.2 臨床特征

TiLV可以感染所有生命階段的羅非魚，特別是羅非魚的早期發(fā)育階段，患病魚體的肝臟、腦、脾臟和頭腎均可被感染。不同地區(qū)TiLVD的臨床表現(xiàn)以及病變器官有所差異，這與病原毒株、其他病原混合感染、多種病原繼發(fā)感染以及羅非魚品種差異等因素相關(guān)，臨床特征比較詳見表1。

表1 不同地區(qū)TiLVD的臨床特征比較

1.3 宿主范圍

1.4 傳播媒介

截至目前，TiLV的最初來源還未確定，已知唯一的傳染源是野生或養(yǎng)殖的患病羅非魚群。在其眼睛、大腦和肝臟內(nèi)檢出了高濃度的病毒，推測患病死亡的羅非魚可能是重要的傳播媒介。混養(yǎng)條件下，TiLV可在水體中進(jìn)行直接傳播。羅非魚湖病毒在試驗(yàn)條件下可通過同居成功地將病毒傳播給易感魚類。此外，Pierezan等在試驗(yàn)條件下，采用灌胃的方法成功地再現(xiàn)了該疾病，在魚類養(yǎng)殖池的糞便和污染水中檢測到病毒，這高度提示了口腔—糞便傳播途徑。在最近的研究中也描述了TiLV的垂直傳播。Eyngor等證明TiLV傳播介質(zhì)是水體，因此羅非魚在進(jìn)行交易和運(yùn)輸期間傳播疾病的可能性很高；Fathi等提出鳥類的遷徙等多種途徑可能對TiLV的傳播發(fā)揮一定的作用，但該觀點(diǎn)還未得到證明。

1.5 流行季節(jié)

2009年5—10月，以色列全境出現(xiàn)羅非魚大量死亡的現(xiàn)象，發(fā)病水溫22～32℃。埃及TiLVD暴發(fā)季節(jié)集中在6—10月，其間發(fā)病水溫高于25℃，厄瓜多爾地區(qū)TiLVD發(fā)病時(shí)間集中在5—11月，水溫25～27℃。在泰國10月至次年5月之間采樣的羅非魚中均發(fā)現(xiàn)TiLV陽性。另有研究表明，24～33℃時(shí)TiLV可增殖，最適溫度25℃。由此可知，TiLVD常暴發(fā)于高溫時(shí)期，熱帶地區(qū)全年均有感染的可能性，其他地區(qū)每年的5—10月可能是TiLV大規(guī)模暴發(fā)的關(guān)鍵期。此外，TiLV可在低溫條件下存活，在-20℃冷凍保存的羅非魚肉片內(nèi)至少能存活28 d。

1.6 傳入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估與管理

TiLVD屬于近年來新發(fā)水生動(dòng)物疫病，具有極強(qiáng)傳染性，對羅非魚的致死率可以達(dá)到20%～90%，給該產(chǎn)業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。世界各國對此高度重視，2017年5月，OIE、NANC、FAO、CGIAR（國際農(nóng)業(yè)研究磋商組織）等多個(gè)國際組織發(fā)布公告，要求其所有成員國加強(qiáng)對TiLVD的檢驗(yàn)防范工作。我國先后從多個(gè)國家引進(jìn)優(yōu)良羅非魚品種進(jìn)行繁育，目前是世界上最大的羅非魚養(yǎng)殖國，年產(chǎn)量超過160萬t。因此，對入境的水生動(dòng)物進(jìn)行TiLV檢測和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，可有效降低TiLV的傳入風(fēng)險(xiǎn)。

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是針對TiLV隨水生動(dòng)物及其產(chǎn)品傳入我國引發(fā)疫病的可能性及后果進(jìn)行分析，涉及危害識(shí)別、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及風(fēng)險(xiǎn)管理三大方面。其中，危害識(shí)別主要是從病原、易感宿主、易感階段及靶組織、傳播媒介等幾個(gè)方面對TiLV進(jìn)行識(shí)別和預(yù)防風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，包括對TiLV傳入的高、中、低類風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估和判定。如活的敏感魚類（親魚、魚苗和魚卵）、冰凍、冰鮮的敏感魚類等，可能攜帶TiLV，且TiLV無法通過體表消毒進(jìn)行消除；或者冰鮮魚類在死亡之前已經(jīng)攜帶TiLV，而TiLV可在低溫下保存較長時(shí)間，因此此類動(dòng)物屬于高風(fēng)險(xiǎn)；中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，如在水產(chǎn)養(yǎng)殖飼喂中使用到的鮮活餌料可能摻雜有攜帶TiLV的敏感魚種，這些敏感魚種可能是病原傳入渠道之一；低風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估包括對敏感魚的各種加工產(chǎn)品、非敏感魚的各種制品以及運(yùn)輸活魚過程中所用到的工具等進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。目前對于TiLVD缺乏有效的治療方法與疫苗，且TiLV易感性與羅非魚種類關(guān)系密切，以上因素造成了該病的防治困難。應(yīng)以預(yù)防為主，加強(qiáng)管理，措施如下：（1）嚴(yán)格遵循官方制定的衛(wèi)生檢測計(jì)劃，定期開展苗種檢測與生物防治；（2）定時(shí)進(jìn)行漁場消毒與清潔；（3）積極開發(fā)高靈敏度診斷方法，提高疾病篩查效率；（4）及時(shí)捕殺患病羅非魚，控制TiLVD的傳播，防止疫病大規(guī)模暴發(fā)。

2 病原研究

2.1 病毒發(fā)現(xiàn)與命名

2009年，在以色列境內(nèi)的淡水湖基內(nèi)雷特湖首次發(fā)現(xiàn)TiLV并命名。之后發(fā)現(xiàn)，引起厄瓜多爾羅非魚SHT的病毒基因組與TiLV相似，后被證實(shí)為TiLV。2015—2017年，泰國檢測并分離得到TiLV毒株。2017年，在印度西孟加拉邦和喀拉拉邦兩個(gè)州養(yǎng)殖的羅非魚中也發(fā)現(xiàn)了TiLV。Dong等分析證實(shí)，TiLV在2012—2017年就已經(jīng)呈現(xiàn)全球擴(kuò)散趨勢，秘魯?shù)腡iLV毒株與以色列分離株Til-4-2011具有相同起源。

2.2 形態(tài)特征

TiLV是一種RNA單股負(fù)鏈病毒，國際病毒分類委員會(huì)將其暫定為新的正黏病毒物種，單列為羅非魚病毒新屬中的羅非魚病毒種。電子顯微鏡下顯示TiLV具包膜結(jié)構(gòu)，形態(tài)通常為圓形到橢圓形二十面體，少有絲狀或管狀形態(tài)，大小55～75 nm，對乙醚和氯仿敏感。

2.3 感染偏好性

魚體試驗(yàn)方面，通過混養(yǎng)和腹腔攻毒感染證實(shí)，羅非魚及其雜交品種對TiLV敏感。TiLV也可引起其他魚類發(fā)病，Jaemwimol等對10種養(yǎng)殖溫水性魚類進(jìn)行TiLV敏感試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，絲足鱸受感染后組織病理學(xué)損害顯著，死亡率極高。Abdullah等研究發(fā)現(xiàn)，野生河鯉、鯰和孔雀鱸也受到TiLV較大影響。目前經(jīng)研究證實(shí)，可與TiLV陽性羅非魚混養(yǎng)的魚類有鯉、灰鯔、細(xì)唇鯔、印度鯪、大鯉、珍珠斑、遮目魚等。

細(xì)胞層面，TiLV可在尼羅羅非魚（Ophicephalus striatus）的成纖維細(xì)胞（E-11）、羅非魚的腦（OnlB、TiB）、肝臟（OnlL）、動(dòng)脈球（OmB）和腦原代細(xì)胞（TmB）、雜交鱧腦細(xì)胞系（CAMB）中進(jìn)行培養(yǎng)，最為合適的細(xì)胞系是E-11。其他的細(xì)胞系如來自大鱗大麻哈魚（Oncorhynchus tshawytscha）的CHSE-214、藍(lán)腮太陽魚（Lepomis macrochirus）的BF-2等均不適宜進(jìn)行TiLV的培養(yǎng)。

2.4 基因組學(xué)研究

第一個(gè)完成全基因組測定的羅湖病毒分離株是Til-4-2011，現(xiàn)被認(rèn)定為標(biāo)準(zhǔn)毒株，具有10個(gè)基因組節(jié)段（Segment 1~10，S1~S10，GenBank登記號(hào)為KU751814~KU751823），基因組總大小為10 323 bp，從S1到S10片段大小逐個(gè)降低，S1長1 641 bp，S10只有465 bp。所有的基因片段均存在5'-GUAAUU...UUCAUC-3'的保守序列。10個(gè)片段中，S1片段編碼蛋白與C型流感病毒的聚合酶PB1中保守氨基酸序列具有弱同源性，S4和S6片段可能分別編碼TiLV的HEF蛋白和NP蛋白，但功能還需進(jìn)一步確認(rèn)，其余片段編碼蛋白未發(fā)現(xiàn)與已知病毒存在同源性（表2）。到目前為止，包括Til-4-2011在內(nèi)，已經(jīng)有5個(gè)TiLV毒株完成了全基因組測序，60多個(gè)TiLV毒株完成了部分基因片段測序，分離出的毒株與Til-4-2011標(biāo)準(zhǔn)株同源性可以達(dá)到95%以上，基因序列特征十分相似。

表2 TiLV各片段研究進(jìn)展[35，41-42]

2.5 致病機(jī)理

截至目前，對TiLV致病機(jī)理的研究報(bào)道十分有限?？梢源_定的是，當(dāng)TiLV與其他細(xì)菌共同感染時(shí)，會(huì)加強(qiáng)TiLV對羅非魚的危害程度。據(jù)泰國相關(guān)報(bào)道，在感染TiLV的羅非魚體內(nèi)還檢測出了黃桿菌、氣單胞菌和鏈球菌以及外源寄生蟲和纖毛原生動(dòng)物等。埃及、馬來西亞等地養(yǎng)殖場的患病魚體內(nèi)也同時(shí)檢測出多種氣單胞菌共同感染的情況。因此，推測氣單胞菌和TiLV可能存在協(xié)同作用，從而加強(qiáng)TiLV對于羅非魚的危害，但具體機(jī)制尚不明晰。

TiLV還能以潛伏狀態(tài)存在于患病羅非魚體內(nèi)。具體表現(xiàn)為：雖然TiLV檢測呈陽性，但病毒載量較低，并未表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀或只表現(xiàn)出亞臨床感染癥狀，這可能是由于TiLV發(fā)生遺傳變異所致。

3 診斷與防控

3.1 觀察法

可通過觀察法對魚體是否患TiLVD進(jìn)行初步判斷。TiLVD典型臨床癥狀包括昏睡、眼部病變、眼球突出、身體發(fā)黑、腹脹、鱗片突出、魚鰓變白，皮膚糜爛、腎充血和腦炎等。組織病理學(xué)變化往往發(fā)生在肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，如腦部水腫、組織充血；肝臟腫脹、細(xì)胞分離、合胞性肝炎等。由于不同地區(qū)、不同品系羅非魚以及TiLV毒株有差異，可能會(huì)造成臨床癥狀有差異。在以色列，養(yǎng)殖羅非魚中受影響的魚類表現(xiàn)出嗜睡、眼部改變、皮膚侵蝕和變色，而野生羅非魚中僅描述了皮膚侵蝕和眼部病變。在厄瓜多爾，TiLV感染的臨床體征包括眼球突出、皮膚變色、腹部發(fā)脹、鱗片突出和魚鰓蒼白，而在秘魯?shù)聂~類中已描述了潰瘍和眼球突出。在泰國，病魚表現(xiàn)出嗜睡、食欲不振、行為異常、貧血、鰓蒼白、眼球突出、皮膚充血、腹部腫脹、糜爛等癥狀。在印度，自然感染病例出現(xiàn)皮膚侵蝕和鱗片脫落等癥狀，但在試驗(yàn)性感染魚類時(shí)觀察到眼球突出、腹部腫脹和鱗片突出等癥狀。在菲律賓，感染TiLV的魚類的臨床體征為腹部腫脹和眼睛腫脹。在埃及，受夏季死亡率影響的羅非魚出現(xiàn)了出血斑、脫落鱗片、開放性傷口、暗變色等癥狀和魚鰭腐爛病。

3.2 原位雜交法

原位雜交法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可用于分析保存樣品中病毒核酸的回顧性調(diào)查，對于充分了解該病的歷史流行情況具有重要意義。另外，不同的TiLV地理株感染靶組織可能存在差異，原位雜交法可用于精確定位感染靶組織。例如，利用原位雜交法，檢測出泰國患病羅非魚的主要感染組織為肝、腎以及鰓組織，而厄瓜多爾TiLV主要作用的靶器官是胃腸道和肝臟。

3.3 PCR法

目前，可用于檢測TiLV的方法有RT-PCR法、巢式RT-PCR法、熒光RT-PCR法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)（LAMP）等。2014年，Eyngor等開發(fā)了用于TiLV檢測的RT-PCR方法，該方法有較強(qiáng)的特異性和較高的敏感性，可在短時(shí)間內(nèi)檢測大量臨床樣品，適用于批量臨床樣本檢測和流行病學(xué)監(jiān)測。Tsofack等建立了一種更為敏感的巢式RT-PCR方法，檢測限可達(dá)7個(gè)拷貝的病毒粒子，該方法能夠?qū)悠分胁≡瓟?shù)量進(jìn)行定量，且快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，現(xiàn)已被開發(fā)用于檢測多種魚類病毒病。隨后，Dong等發(fā)表了一種改進(jìn)的半巢式RT-PCR檢測方法，省略了引物“nested ext－2”，可有效避免假陽性結(jié)果，檢測的靈敏度高于qRT-PCR方法，與巢式RT－PCR相當(dāng)。2019年，Phusantisampan等和Yin等等建立了TiLV的熒光RT－LAMP快檢方法，該方法特異性好，靈敏度是半巢式RT－PCR方法的4倍，檢測限低至1.6個(gè)拷貝數(shù)的病毒粒子，為TiLV的現(xiàn)場快速檢測提供了一種準(zhǔn)確可靠的方法。LAMP法作為一種全新的恒溫核酸擴(kuò)增方法，雖然引物設(shè)計(jì)較為復(fù)雜，但操作簡單，對于實(shí)驗(yàn)器材要求不高，反應(yīng)產(chǎn)物用肉眼可見，具有效果明顯、成本低廉，實(shí)用性更強(qiáng)的特點(diǎn)，可用于TiLV的現(xiàn)場快速檢測。

3.4 防控措施

目前，TiLVD疫情還未見行之有效的治療方法，因此精準(zhǔn)防控至關(guān)重要。首先，考慮到不同品種羅非魚對TiLV的敏感性有差異，建議養(yǎng)殖時(shí)避開敏感品種。另外，從苗種到成魚的養(yǎng)殖過程中，應(yīng)采取有效的生物控制措施，改善養(yǎng)殖環(huán)境，減少病原微生物種類和數(shù)量，以避免降低魚體免疫力、增加TiLV感染風(fēng)險(xiǎn)；配合使用免疫增強(qiáng)劑，提高魚體抗病能力；養(yǎng)殖過程中，經(jīng)常進(jìn)行TiLV監(jiān)測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和控制傳染源，防止疫病大規(guī)模流行。最后，加強(qiáng)TiLV的診斷技術(shù)研究，加快開發(fā)精準(zhǔn)、廉價(jià)、便捷的現(xiàn)場快檢技術(shù)與產(chǎn)品；并積極推進(jìn)相關(guān)疫苗研發(fā)。

4 建議

TiLVD為近年來新發(fā)重大疫病，目前已在全球范圍內(nèi)流行，給羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。今后對于TiLVD相關(guān)研究，應(yīng)重點(diǎn)從以下幾方面開展：

（1）目前缺乏有效的TiLVD化學(xué)治療方法和疫苗，應(yīng)時(shí)刻保持警惕，以預(yù)防為主，積極開展TiLVD流行病學(xué)調(diào)查，明確發(fā)病條件、流行規(guī)律以及傳播途徑等；推進(jìn)病原研究，病毒的分離、傳播、復(fù)制、致病機(jī)理等是下一步需要重點(diǎn)關(guān)注的問題；以感染TiLV后存活下來的羅非魚為切入點(diǎn)，深入分析對病原的免疫應(yīng)答差異，盡快研制出TiLV疫苗。

（2）由于各地區(qū)發(fā)現(xiàn)的TiLV毒株不同，首先應(yīng)充分調(diào)查各種毒株相對應(yīng)的羅非魚敏感品系，在此基礎(chǔ)上，盡量避免養(yǎng)殖TiLV易感品種，并積極進(jìn)行品種改良。

（3）加強(qiáng)羅非魚生物安保措施管理與傳播風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)體系建設(shè)。加強(qiáng)養(yǎng)殖管理，開展養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)測，及時(shí)發(fā)現(xiàn)、切斷傳染源，尤其要加強(qiáng)羅非魚苗種廠的監(jiān)測管理與消毒。另外，由于我國每年都需要從國外引進(jìn)羅非魚良種、冰凍和冰鮮敏感魚類以及用作活餌料的野雜魚等，存在TiLV通過國際貿(mào)易傳入的潛在風(fēng)險(xiǎn)。對此，應(yīng)督促各貿(mào)易國嚴(yán)格遵守世界動(dòng)物衛(wèi)生組織發(fā)布的《水生動(dòng)物衛(wèi)生法典》，加強(qiáng)入境產(chǎn)品有效檢疫，阻斷TiLV在國際貿(mào)易中傳播。

（4）TiLV屬于RNA病毒，變異快，且在不同地理?xiàng)l件下基因組存在顯著差異。應(yīng)及時(shí)更新序列信息，改進(jìn)診斷方法，正確區(qū)分不同地理株，開發(fā)更為精準(zhǔn)、低價(jià)的快檢技術(shù)與產(chǎn)品。