陳玉玲，李志愿，李小平，王洪斌，王淑芳*

(1.江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港 222005；2.江蘇省泗洪縣大樓街道農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)技術(shù)服務(wù)中心，江蘇泗洪 223900)

隨著國民生活水平的不斷提高，對食品安全的要求也愈發(fā)嚴(yán)格。在水產(chǎn)品養(yǎng)殖安全的源頭——飼料環(huán)節(jié)，微生物發(fā)酵飼料作為一種新型的生態(tài)健康型飼料，具有十分廣闊的前景。2021年克氏原螯蝦()產(chǎn)值超過4 000億元，其新型健康養(yǎng)殖尚處于初級階段。利用有益菌發(fā)酵飼料，改善飼料品質(zhì)，提高飼料利用率，是目前研究的重要課題。王天神研究表明飼料中添加25%～35%的益生菌可以提高克氏原螯蝦的生長性能；生物發(fā)酵飼料中的益生菌能夠優(yōu)化腸道中的微生物菌群，提高消化酶活性，提高飼料利用率，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收，增強(qiáng)克氏原螯蝦的特異性免疫和抗病能力。徐增洪等研究發(fā)現(xiàn)生物飼料對克氏原螯蝦的生長和性腺成熟發(fā)育有顯著影響(<0.05)，表明生物飼料對克氏原螯蝦等水產(chǎn)動物養(yǎng)殖有較好的飼喂效果，它同時具有加快蝦蟹生長速度和改善商品蝦蟹品質(zhì)的作用。地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌是發(fā)酵飼料中常用的微生物，對水產(chǎn)動物生長具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α９P者用解淀粉芽孢桿菌()SS-42和地衣芽孢桿菌()10-2作為試驗(yàn)菌株，以不同菌濃度混合飼料飼喂克氏原螯蝦幼蝦，通過測定生長狀況比較不同飼喂量不同菌株對克氏原螯蝦生長的影響，以期為微生物發(fā)酵飼料在克氏原螯蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)動物?？耸显r購自贛榆某養(yǎng)殖場；試驗(yàn)所用飼料為某公司生產(chǎn)的膨化顆粒飼料。

試驗(yàn)菌株。解淀粉芽孢桿菌：SS-42菌株，從連云港紫菜養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的紫菜中分離，由江蘇海洋大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離、純化和保存。地衣芽孢桿菌：10-2菌株，從連云港紫菜養(yǎng)殖場養(yǎng)殖的紫菜中分離，由江蘇海洋大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離、純化和保存。

菌種活化、搖床培養(yǎng)與稀釋。用固體培養(yǎng)基活化SS-42和10-2菌株，在2216E固體培養(yǎng)基平板上三區(qū)劃線后于28 ℃下培養(yǎng)活化。次日取單菌落轉(zhuǎn)種于50 mL液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，使用血球計數(shù)板計數(shù)，梯度稀釋至濃度10、10、10CFU/mL，待用。

試驗(yàn)處理設(shè)計。試驗(yàn)設(shè)置解淀粉芽孢桿菌SS-42和地衣芽孢桿菌10-2的3個濃度梯度[10、10、10CFU/(尾·d)]的處理組，3個解淀粉芽孢桿菌處理組為A、A、A，3個地衣芽孢桿菌處理組為B、B、B，每個濃度梯度重復(fù)3次，另外設(shè)置1個空白對照組(CK)，共21個處理。將不同濃度的菌液與飼料混合后投喂到相應(yīng)養(yǎng)殖箱中，飼養(yǎng)期間每天統(tǒng)計死亡和出現(xiàn)殘肢的克氏原螯蝦數(shù)量，飼養(yǎng)結(jié)束后計算總死亡率、總殘肢率和體重增長率等指標(biāo)。

養(yǎng)殖管理。試驗(yàn)蝦飼養(yǎng)在無毒塑料養(yǎng)殖箱(63 cm×53 cm×30 cm)中。水深5 cm，用增氧泵不間斷充氣。養(yǎng)殖用水是經(jīng)過充分曝氣的靜置自來水，水中加入抗應(yīng)激劑(0.003 g/mL)幫助適應(yīng)環(huán)境，加入硫代硫酸鈉(0.003 g/mL)和除氯、鈣劑(0.007 g/mL)促進(jìn)脫殼。外罩遮光度90%的遮陽網(wǎng)，養(yǎng)殖盆中加入遮蔽物供蝦躲避和休憩。

從養(yǎng)殖場上購買的克氏原螯蝦幼蝦體長為(6.21±1.52)cm，體質(zhì)量為(8.35±0.15)g，體色正常、反應(yīng)活躍、體型相近。需先經(jīng)過馴化處理，待蝦適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室的養(yǎng)殖環(huán)境后挑取其中活力較強(qiáng)、腹肢齊全、體色鮮亮的個體放入編好號的養(yǎng)殖盆中，每個養(yǎng)殖盆中飼養(yǎng)10只蝦。

每天投飼2次，分別為08：00和17：00，2次投喂比例為3∶7，按照蝦平均體重的5%投喂飼料。飼喂前菌液與飼料充分混合，并使菌液全部吸附在飼料上。投飼3 h后使用虹吸器吸除水體中的雜質(zhì)，最后向養(yǎng)殖箱中添加新水至水深5 cm。飼喂前，測定水質(zhì)指標(biāo)。

連續(xù)飼喂7 d，每天觀察和記錄附肢是否完整，計算死亡率和殘肢率；養(yǎng)殖結(jié)束后對每個處理的克氏原螯蝦稱重，計算平均體重、體重增長率和飼料系數(shù)。

水質(zhì)指標(biāo)測定。水質(zhì)指標(biāo)測定使用快速水質(zhì)分析盒(由湛江市浩洋生物科技有限公司生產(chǎn))，參照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

生長指標(biāo)測定。每天09：00記錄各處理克氏原螯蝦幼蝦的死亡數(shù)量和出現(xiàn)殘肢的蝦數(shù)量，計算每天的死亡率和殘肢率。試驗(yàn)結(jié)束后，計算體重增長率。死亡率、殘肢率和體重增長率的計算公式如下：

體重增長率=[(-)]×100

(1)

死亡率=×100

(2)

殘肢率=×100

(3)

飼料系數(shù)=(-)×100

(4)

式中，為始重，為末重，為飼料消耗量，為24 h內(nèi)每個處理死亡數(shù)，為24 h內(nèi)每個處理內(nèi)出現(xiàn)附肢缺失的蝦尾數(shù)，為每個處理投放克氏原螯蝦的尾數(shù)。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Origin 2018軟件進(jìn)行單因素方差分析與繪圖。

2 結(jié)果與分析

所測水質(zhì)指標(biāo)都在安全范圍內(nèi)，氯含量為0.010～0.015 mg/L，亞硝酸鹽含量為0.005～0.010 mg/L，氨氮含量為0.1～0.2 mg/L，pH為7.9～8.0，溶解氧含量為7 mg/L。

解淀粉芽孢桿菌SS-42對克氏原螯蝦死亡率的影響。由表1可知，對照組(CK)克氏原螯蝦7 d總死亡率為50.00%，A、A、A組7 d總死亡率均為50.00%。由此可見，SS-42各飼喂量處理組與對照組相比無顯著差異(>0.05)。

表1 解淀粉芽孢桿菌對克氏原螯蝦死亡率的影響Table 1 Effects of B.amyloliquefaciens on the mortality rate of P.clarkii

解淀粉芽孢桿菌SS-42對克氏原螯蝦殘肢率的影響。由表2可知，克氏原螯蝦出現(xiàn)殘肢的情況主要出現(xiàn)在試驗(yàn)前中期，對照組(CK)7 d總殘肢率為30.00%，A、A、A組7 d總殘肢率均為30.00%。由此可見，不同飼喂量的SS-42菌株對克氏原螯蝦幼蝦總殘肢率無顯著影響(>0.05)。

表2 解淀粉芽孢桿菌對克氏原螯蝦殘肢率的影響Table 2 Effects of B.amyloliquefaciens on the stump rate of P.clarkii

解淀粉芽孢桿菌SS-42對克氏原螯蝦體重增長率和飼料系數(shù)的影響。如表3所示，與對照組(CK)相比，各飼喂量SS-42處理組克氏原螯蝦的體重增長率均顯著提高(<0.05)，對照組(CK)的體重增長率為(17.14±1.06)%，A、A、A組體重增長率分別為(24.13±0.67)%、(29.44±1.26)%和(24.11±0.98)%。由此可見，當(dāng)飼喂量為10CFU/(尾·d)克氏原螯蝦的體重增長率最高。由表3可知，與對照組(CK)相比，A、A、A組飼料系數(shù)顯著降低(<0.05)，說明添加解淀粉芽孢桿菌SS-42后飼料轉(zhuǎn)化率顯著提高(<0.05)。

地衣芽孢桿菌10-2對克氏原螯蝦死亡率的影響。由表4可知，對照組(CK)克氏原螯蝦7 d總死亡率為50.00%，B、B、B組7 d總死亡率均為50.00%。由此可見，地衣芽孢桿菌10-2各飼喂量處理組原克氏原螯蝦7 d總死亡率與對照組相比無顯著差異(>0.05)。

表3 解淀粉芽孢桿菌對克氏原螯蝦體重增長率和飼料系數(shù)的影響Table 3 Effects of B.amyloliquefaciens on the body weight growth rate and feed coefficient of P.clarkii

地衣芽孢桿菌10-2對克氏原螯蝦殘肢率的影響。由表5可知，對照組(CK)克氏原螯蝦7 d總殘肢率為20.00%，B、B、B組7 d總殘肢率均為20.00%。由此可見，不同飼喂量的10-2菌株對克氏原螯蝦幼蝦總殘肢率無顯著影響(>0.05)。

表4 地衣芽孢桿菌對克氏原螯蝦死亡率的影響Table 4 Effects of B.licheniformis on the mortality rate of P.clarkii

表5 地衣芽孢桿菌對克氏原螯蝦殘肢率的影響Table 5 Effects of B.licheniformis on the stump rate of P.clarkii

地衣芽孢桿菌10-2對克氏原螯蝦體重增長率和飼料系數(shù)的影響。由表6可知，對照組(CK)克氏原螯蝦的體重增長率為(17.14±1.06)%，B、B、B組克氏原螯蝦的體重增長率分別為(22.13±0.67)%、(21.44±0.83)%和(20.31±0.98)%。由此可見，與對照組(CK)相比，各飼喂量地衣芽孢桿菌10-2處理組克氏原螯蝦的體重增長率顯著提高(<0.05)，但B、B、B組間無顯著差異(>0.05)。由表6可知，與對照組(CK)相比，B、B、B組飼料系數(shù)顯著降低(<0.05)，說明添加地衣芽孢桿菌10-2后飼料轉(zhuǎn)化率顯著提高(<0.05)。

如圖1所示，相同飼喂量下，2種菌株對克氏原螯蝦幼蝦的體重增長率有顯著影響(<0.05)。不同飼喂量解淀粉芽孢桿菌SS-42處理組克氏原螯蝦的體重增長率差異顯著(<0.05)，當(dāng)SS-42飼喂量為10CFU/(尾·d)時克氏原螯蝦的體重增長率最高；不同飼喂量地衣芽孢桿菌10-2處理組克氏原螯蝦的體重增長率無顯著差異(>0.05)。

表6 地衣芽孢桿菌對克氏原螯蝦體重增長率和飼料系數(shù)的影響Table 6 Effects of B.licheniformis on the body weight growth rate and feed coefficient of P.clarkii

圖1 相同飼喂量的2種芽孢桿菌對克氏原螯蝦體重增長率的影響Fig.1 Effects of two species of Bacillus at the same feeding amount on the body weight growth rate of P.clarkii

3 討論

芽孢桿菌能夠分泌高活性的胞外酶系，可將水體中的有機(jī)殘余物迅速降解為無機(jī)物，有效促進(jìn)養(yǎng)殖水體生態(tài)的良性循環(huán)。研究表明，復(fù)合型芽孢桿菌制劑對蝦育苗時期氨氮和亞硝態(tài)氮的含量有顯著影響，但解淀粉芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌對蝦育苗水質(zhì)的影響不明顯。該試驗(yàn)中投放芽孢桿菌的方式是將芽孢桿菌混合飼料一起飼喂幼蝦，3 h后使用虹吸式吸水器吸去殘留糞便和飼料。

益生菌能夠促進(jìn)養(yǎng)殖動物生長，能抑制病原生長、補(bǔ)充營養(yǎng)、促進(jìn)消化和提高免疫力，但不同菌種甚至同種不同菌株的作用方式各有側(cè)重，效果也有所差異。關(guān)于芽孢桿菌制劑應(yīng)用于對蝦育苗、抗逆性的研究已有少量報道。研究表明，在對蝦育苗體系中連續(xù)投入較高密度的芽孢桿菌可以顯著提高幼體或仔蝦的存活率，促進(jìn)生長或變態(tài)，增強(qiáng)蝦苗抗逆性。李高俊等研究表明進(jìn)一步提高用菌量時作用效果并不會繼續(xù)提升，甚至可能造成幼體存活率下降。該試驗(yàn)結(jié)果表明解淀粉芽孢桿菌SS-42菌株和地衣芽孢桿菌10-2菌株對克氏原螯蝦幼蝦死亡率和殘肢率的影響不顯著(>0.05)。試驗(yàn)期間幼蝦無明顯病原感染，水質(zhì)良好，幼蝦營養(yǎng)也較為充分，可能是因?yàn)樵囼?yàn)周期過短，樣本數(shù)較小，數(shù)據(jù)未體現(xiàn)出差異顯著性。因此，在無明顯脅迫條件下，與對照組相比，2種芽孢桿菌的作用效果難以通過存活率和殘肢率體現(xiàn)出來。當(dāng)飼喂量相同時，解淀粉芽孢桿菌SS-42處理組克氏原螯蝦的體重增長率顯著高于地衣芽孢桿菌10-2處理組，這可能是因?yàn)?種芽孢桿菌菌種或發(fā)酵后菌體以外的其他成分存在差異，作用效果明顯不同。

4 結(jié)論

該試驗(yàn)用不同濃度的解淀粉芽孢桿菌SS-42和地衣芽孢桿菌10-2飼喂克氏原螯蝦幼蝦，通過測定生長狀況分析2種菌株對克氏原螯蝦幼蝦生長的影響。結(jié)果表明，2種芽孢桿菌處理組克氏原螯蝦的死亡率和殘肢率與對照組相比差異不顯著(>0.05)，平均體重增長率顯著提高(<0.05)；當(dāng)飼喂量相同時，飼喂解淀粉芽孢桿菌SS-42菌株處理組克氏原螯蝦的平均體重增長率顯著高于飼喂地衣芽孢桿菌10-2菌株的處理組(<0.05)；解淀粉芽孢桿菌SS-42飼喂量為10CFU/(尾·d)時各項生長指標(biāo)表現(xiàn)最佳。