黃德林，陳雅慧，凡志婷，石祥廣，黃炎，王少輝，王久存，姜帥

（復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438）

細(xì)胞死亡是所有真核生物的共同特征，對(duì)保持細(xì)胞和機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育有著至關(guān)重要的作用?？茖W(xué)家根據(jù)細(xì)胞死亡時(shí)不同的形態(tài)學(xué)特征提出了壞死性凋亡、自噬性死亡、焦亡和鐵死亡等細(xì)胞死亡類型[1-2]。鐵死亡（ferroptosis）是2012年DIXON等學(xué)者發(fā)現(xiàn)的一種新的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡（Regulatory Cell Death，RCD）形式，在多種疾病中扮演重要角色[3]。目前已發(fā)現(xiàn)鐵死亡在肺纖維化、肺癌、慢性阻滯性肺?。–OPD）、急性肺損傷、肺結(jié)核等肺部疾病中發(fā)揮重要作用[4]。

鐵死亡是一種區(qū)別于傳統(tǒng)細(xì)胞死亡形式的全新細(xì)胞死亡方式。鐵死亡的典型特征是依賴于鐵過載導(dǎo)致的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化[5]。鐵的吸收主要來源于膳食，小腸吸收鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞后被還原為二價(jià)鐵離子，過量二價(jià)鐵離子會(huì)催化細(xì)胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化而死亡。伴隨鐵過載引發(fā)的脂質(zhì)過氧化所催化的細(xì)胞死亡方式，被稱為鐵死亡[6]。隨著工業(yè)化進(jìn)程加速，人類活動(dòng)和環(huán)境破壞導(dǎo)致惡性和非惡性呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率急劇上升，而鐵死亡的發(fā)現(xiàn)可能為解決呼吸系統(tǒng)疾病提供新思路。

核受體共激活因子4（Nuclear Receptor Coactivator 4，NCOA4）介導(dǎo)鐵自噬（ferritinophagy）的激活，在鐵代謝過程中扮演重要角色[7-8]。鐵蛋白（ferritin）是細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存鐵的重要方式，研究發(fā)現(xiàn)NCOA4可以識(shí)別結(jié)合鐵蛋白[9]，二者形成的蛋白復(fù)合體可以被自噬溶酶體識(shí)別并降解釋放出游離鐵，重新參與機(jī)體鐵代謝循環(huán)，游離鐵過量則會(huì)促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生[10-12]。NCOA4介導(dǎo)的鐵死亡對(duì)肺部細(xì)胞功能的影響尚待闡明，本研究旨在通過構(gòu)建敲低、過表達(dá)人NCOA4慢病毒載體，感染目的細(xì)胞獲得敲低、過表達(dá)NCOA4的人胚肺成纖維細(xì)胞（HFL1）穩(wěn)轉(zhuǎn)株，為研究NCOA4介導(dǎo)的鐵死亡在肺部疾病中的作用機(jī)制提供工具細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 試劑

PCR引物、DEPC水，生工生物工程（上海）股份有限公司；NCOA4引物，賽音生物技術(shù)（上海）有限公司；PCR 酶、AgeⅠ、EcoRⅠ、NotⅠ，美國(guó)New England Biolabs公司；TaqManTMMicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DMEM、胰酶、青霉素／鏈霉素、嘌呤霉素、低內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA快速回收試劑盒，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；DNA marker，翌圣生物科技（上海） 股份有限公司；SYBR Premix Ex Taq?Ⅱ試劑，日本Takara公司；TEMED，美國(guó)Sigma公司；HFL1細(xì)胞，美國(guó)ATCC公司。

1.2 儀器

BCD-118TMPA型冰箱，海爾（上海）電器有限公司；MricroCL 21離心機(jī)、QuantStudio 7實(shí)時(shí)定量PCR儀、Heraguard ECO超凈工作臺(tái)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；MCO-20AIC細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本Panasonic公司；Lecia DMR熒光顯微鏡，德國(guó)Fecialeica公司；Gel Doc XR+自動(dòng)曝光儀，美國(guó)BIORAD公司；HW24水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 敲低、過表達(dá)載體的構(gòu)建

1.3.1.1 設(shè)計(jì)NCOA4的shRNA和PCR引物

依據(jù)人NCOA4的cDNA序列以及pLKO.1、pCDH載體的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的shRNA和PCR引物。為保證實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，本研究設(shè)計(jì)了2對(duì)shRNA（如表1所示），2對(duì)PCR引物（如表2所示），由賽音生物技術(shù)（上海）有限公司合成。

表1 NCOA4的shRNA

表2 NCOA4的PCR引物

1.3.1.2 NCOA4敲低、過表達(dá)慢病毒包裝載體雙酶切

（1）慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5-α，擴(kuò)增后提取目的質(zhì)粒。（2）檢測(cè)質(zhì)粒濃度后，取1 μg質(zhì)粒，根據(jù)酶切位點(diǎn)選擇合適的限制性內(nèi)切酶雙酶切目的質(zhì)粒。酶切體系如下：1 μg質(zhì)粒，10×NEB buffer 5 μL，pLKO.1載體加EcoRⅠ、AgeⅠ各1 μL（pCDH載體加EcoRⅠ、NotⅠ各1 μL），加ddH2O至總體積為50 μL，37 ℃酶切4 h。（3）瓊脂糖凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物，回收目的片段的膠條并檢測(cè)濃度。

1.3.1.3 shRNA退火和目的基因PCR擴(kuò)增

（1）將合成的shRNA和引物稀釋成終濃度為5 μmol/mL的儲(chǔ)藏液。（2）shRNA退火：正向、反向shRNA及10×NEB buffer 2各5 μL，加ddH2O至總體積50 μL，95 ℃加熱5 min，梯度降溫。（3）PCR擴(kuò)增：正向、反向引物及高保真酶各5 μL，加ddH2O至總體積50 μL。94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次。（4）結(jié)束后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收目的基因。

1.3.1.4 目的基因與載體連接

測(cè)定步驟1.3.1.2和1.3.1.3中回收的載體和目的基因的濃度，分別將退火后的shRNA與pLKO.1片段連接，將擴(kuò)增的NCOA4基因與pCDH片段連接。連接體系：插入片段100 ng，線性化克隆載體500 ng，NEB T4 DNA ligase 2 μL，10×NEB T4 DNA ligase buffer 2 μL，ddH2O定容至20 μL。16 ℃連接過夜。

1.3.1.5 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化擴(kuò)增、測(cè)序

取2 μL重組質(zhì)粒，用移液槍轉(zhuǎn)移至大腸桿菌DH5-α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42 ℃水浴鍋熱激50 s，然后迅速置于冰上5 min。加入300 μL無抗生素培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h。3 000 r/min離心5 min，棄掉200 μL上清液，剩余液體吹打均勻，在含抗生素的LB培養(yǎng)板中涂勻，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)過夜。挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后測(cè)序，測(cè)序正確即可進(jìn)行慢病毒包裝。

1.3.2 慢病毒包裝感染HFL1構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株1.3.2.1 包裝慢病毒

本實(shí)驗(yàn)采用Addgene公司的三質(zhì)粒包裝體系。（1）在6 cm皿中鋪板293T細(xì)胞，待長(zhǎng)到80%時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基。（2）取靶基因質(zhì)粒4 μg，psPAX2（Addgene #12260）3 μg，pMD2.G（Addgene#12259）1 μg加入到500 μL無血清opti-MEM中配制溶液A；同時(shí)取16 μL Lipo2000加入到500 μL無血清opti-MEM中配制溶液B；分別靜置5 min。（3）混合溶液A、B，靜置20 min，將混合后的溶液加入到293T細(xì)胞中。12 h后換液，并添加丁酸鈉至終濃度為5 μmol/L。（4）48 h后培養(yǎng)基變黃，證明病毒包裝成功，收集上清，用0.45 μm濾膜過濾。收集到的病毒溶液離心純化后，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 確定嘌呤霉素最佳篩選濃度

第1天：將HFL1鋪板于10個(gè)6 cm的培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2條件下過夜培養(yǎng)。第2天：靶細(xì)胞應(yīng)有約80%～90%匯合。嘌呤霉素的最終濃度為1～10 μg/mL，增量為1 μg/mL，分別標(biāo)記為1～10號(hào)平板，并向細(xì)胞中添加適當(dāng)?shù)暮朽堰拭顾氐呐囵B(yǎng)基。第3天及以后：每天檢查細(xì)胞，24 h后更換含嘌呤霉素的新鮮DMEM完全培養(yǎng)基。最佳嘌呤霉素篩選濃度為3～5天后細(xì)胞完全死亡的嘌呤霉素濃度，也是實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用于篩選細(xì)胞的濃度。最終確定HFL1嘌呤霉素的最佳篩選濃度為1 μg/mL。

1.3.2.3 慢病毒感染HFL1和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選

第1天：鋪板HFL1細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)過夜。第2天：靶細(xì)胞應(yīng)有約70%匯合。慢病毒顆粒溶液，對(duì)于6 cm靶板，添加0.5～1.0 mL病毒（高M(jìn)OI添加0.5 mL，低MOI添加1.0 mL，根據(jù)目標(biāo)板的大小調(diào)整病毒添加量）。添加聚凝胺至終濃度為8 μg/mL，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞過夜。第3天：感染24 h后更換新鮮培養(yǎng)基。如果在細(xì)胞系中觀察到病毒毒性，可以將感染時(shí)間減少到4～20 h，清除含有病毒的培養(yǎng)基，并更換為新的培養(yǎng)基。建議保持一個(gè)未感染病毒的平行細(xì)胞孔板作為嘌呤霉素篩選的對(duì)照組。第4天及以后：每隔48 h根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況更換含有嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基。持續(xù)篩選14天后檢測(cè)NCOA4的表達(dá)情況。

1.4 qPCR檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株NCOA4的表達(dá)

（1）收集細(xì)胞，加Trizol充分裂解后提取總RNA。取1 μg的RNA，加DEPC水定容至7 μL，再加入1 μL 10×RT buffer，1 μL random primers，0.5 μL dNTP，0.5 μL反轉(zhuǎn)錄酶?；靹蚝蟀凑?5 ℃，5 min；37 ℃，2 h；85 ℃，5 min；4 ℃+∞完成逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。（2）獲取的cDNA用ddH2O稀釋10倍，qPCR定量。體系包括稀釋后的cDNA 2 μL，濃度為2 μmol/L的上下游引物各0.5 μL，SYBR Mix 2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃，40 s；95 ℃，30 s；60 ℃，60 s；72 ℃，30 s；重復(fù)36個(gè)循環(huán)。

1.5 Western Blot檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株NCOA4的表達(dá)

收集細(xì)胞，加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解30 min。轉(zhuǎn)移至離心管，加5×的loading buffer染色，100 ℃金屬浴10 min，然后迅速置于冰上冰浴，防止蛋白復(fù)性。收集處理后的蛋白SDS-PAGE電泳至溴酚藍(lán)跑出蛋白凝膠底部，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后用5%BSA封閉2 h，孵育一抗過夜，第二天洗膜，孵育二抗2 h，再次洗膜后顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

序列比對(duì)使用軟件DNAMAN 9.0。打開軟件后選擇要添加的NCOA4基因序列、NCOA4的shRNA、克隆載體測(cè)序數(shù)據(jù)。導(dǎo)入序列后選擇Multiple Sequence Alignment，參數(shù)全部保持默認(rèn)。

差異性分析使用軟件GraphPad Prism 9.0，使用方差分析（Analysis of Variance，ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCOA4敲低、過表達(dá)載體

pLKO.1長(zhǎng)7 091 bp，shRNA1長(zhǎng)58 bp。在雙酶切掉一個(gè)約1 900 bp片段的位置連接上shRNA，獲得目的載體長(zhǎng)約5 200 bp。pCDH長(zhǎng)7 384 bp，NCOA4基因片段長(zhǎng)1 890 bp，因此連接上NCOA4片段后長(zhǎng)約9 200 bp。如圖1所示，核酸電泳顯示重組載體在相應(yīng)分子量位置出現(xiàn)，在相同條件下環(huán)狀質(zhì)粒比線性質(zhì)粒運(yùn)動(dòng)更快，酶切鑒定與預(yù)期相符。如圖2所示，測(cè)序結(jié)果顯示shRNA1（KO1）成功連到pLKO.1載體上，NCOA4基因片段成功連到pCDH載體上。

圖1 目的基因質(zhì)粒的酶切電泳

圖2 目的基因質(zhì)粒的測(cè)序

2.2 敲低、過表達(dá)NCOA4的HFL1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

用包裝好的NCOA4敲低、過表達(dá)慢病毒感染HFL1細(xì)胞，得到敲低、過表達(dá)NCOA4的HFL1穩(wěn)轉(zhuǎn)株。如圖3、圖4所示，經(jīng)qPCR和Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NCOA4實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定低表達(dá)和高表達(dá)，成功構(gòu)建NCOA4敲低、過表達(dá)的HFL1細(xì)胞系。

圖3 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中NCOA4蛋白表達(dá)情況

圖4 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中NCOA4的mRNA相對(duì)表達(dá)量

4 結(jié)論

鐵死亡與肺纖維化、肺癌、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等多種肺部疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。研究表明，特發(fā)性肺纖維化（IPF）患者肺中的總鐵水平、鐵相關(guān)氧自由基均有所增加[14]；Fer-1可以通過抑制鐵死亡進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化[15]。正常HFL1能夠活化形成腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs），促進(jìn)肺癌的發(fā)生發(fā)展[16]。COPD常伴隨成纖維細(xì)胞過度增殖，正常的組織結(jié)構(gòu)破壞，并發(fā)間質(zhì)性肺纖維化，誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，可能為COPD的治療提供新思路[17]。NCOA4介導(dǎo)的鐵死亡與肺部疾病的研究尚處于早期階段，大部分研究?jī)H揭示了呼吸系統(tǒng)疾病中存在鐵死亡現(xiàn)象，但其具體機(jī)制尚不明確。深入探究鐵死亡與疾病發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制，有助于加深對(duì)肺部疾病的認(rèn)識(shí)，為肺部疾病提供更精準(zhǔn)的治療[18-19]。

基于此，使用基因工程技術(shù)構(gòu)建了NCOA4敲低、過表達(dá)慢病毒包裝質(zhì)粒，通過慢病毒三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)包裝敲低、過表達(dá)NCOA4慢病毒感染顆粒，并確定了HFL1的嘌呤霉素最佳篩選濃度為1 μg/mL。慢病毒感染目的細(xì)胞2～3天后，嘌呤霉素篩選2周，獲得了敲低、過表達(dá)NCOA4的HFL1穩(wěn)轉(zhuǎn)株，為深入研究NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬引發(fā)的鐵死亡在肺部疾病中發(fā)揮的作用提供了一個(gè)優(yōu)良的細(xì)胞模型。