李喜豹， 張佳素， 周鵬康， 高穎苗， 陳春苗， 高彩吉， 楊 超， 沈文錦

(華南師范大學生命科學學院/廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室， 廣州 510631)

細胞自噬是依賴于液泡的一種蛋白質(zhì)和細胞器降解途徑，參與調(diào)控細胞成分降解、更新、結(jié)構(gòu)重建及逆境脅迫條件下營養(yǎng)成分的再利用，從而在植物正常生長發(fā)育與環(huán)境脅迫響應中發(fā)揮重要作用。目前，在模式植物擬南芥中已鑒定得到40多個自噬相關基因(Autophagy-related genes,ATGs)，這些自噬基因編碼蛋白相互協(xié)作，參與調(diào)控植物細胞自噬過程[1]。細胞自噬的發(fā)生受到細胞內(nèi)多種信號網(wǎng)絡的嚴格調(diào)控。自噬的激活可以看作一種細胞應激反應，植物細胞可以感受多種環(huán)境信號(如營養(yǎng)匱乏、高溫、低溫、低氧、高鹽和植物激素等)[2-10]，適時地激活自噬途徑而幫助細胞清除逆境脅迫所誘發(fā)的有毒有害物質(zhì)的積累，并協(xié)調(diào)植物不同組織、器官內(nèi)營養(yǎng)成分的循環(huán)利用，從而使植物更好地存活[11-12]。細胞自噬也可以被程序性地激活，從而參與調(diào)控植物特定組織、器官的發(fā)育，例如調(diào)控葉片的衰老、花粉的萌發(fā)和種子的成熟等過程[9,13-21]。但未知細胞自噬是否參與調(diào)控植物種子萌發(fā)。

種子萌發(fā)是指有活力的種子吸脹后，重新開始物質(zhì)合成與代謝活動，促使胚根露出種皮的過程，是種子植物生命周期的起始[22]。種子萌發(fā)極易受到光照、溫度、水分和鹽分等外部環(huán)境因素的影響[22]，而這些外部環(huán)境都可以調(diào)控細胞自噬的活性[2-10]。擬南芥為十字花科植物，其種子為典型的油料種子，其萌發(fā)分為4個階段：第1階段，種子快速吸水膨脹，胚根突破種皮；第2階段，生理代謝激活，胚根繼續(xù)生長突破胚乳；第3階段，胚乳內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)快速分解，胚根迅速生長；第4階段，胚芽突破種皮，長出子葉[22]。在擬南芥種子萌發(fā)過程中，植物激素發(fā)揮重要調(diào)控作用。在種子萌發(fā)早期，赤霉素(GA)可以拮抗脫落酸(ABA)，促進種子萌發(fā)過程，在種子萌發(fā)早期和晚期均發(fā)揮重要作用[23-27]。研究[5]表明，GA處理還可以誘導擬南芥細胞自噬，并促進細胞內(nèi)有害物質(zhì)的清除而維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。但細胞自噬是否也會在GA調(diào)控的種子萌發(fā)過程中發(fā)揮作用還不清楚。

本研究以擬南芥為材料，通過分析種子萌發(fā)過程中的自噬基因表達和蛋白積累，證實在擬南芥種子萌發(fā)過程中細胞自噬途徑被激活；并通過比較分析種子萌發(fā)情況，發(fā)現(xiàn)擬南芥自噬突變體種子的萌發(fā)速度比野生型種子的慢，說明自噬的確參與了種子萌發(fā)的過程。

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)野生型Columbial(Col-0)種子和突變體atg5-1(SAIL_129_B07)、atg7-2(GK-655B06)種子均由本實驗室保存。

1.2 實時熒光定量PCR

稱取100 mg在w(瓊脂)=0.8%的固體培養(yǎng)基上萌發(fā)3、17、30、40、50 h的擬南芥野生型種子，于液氮中徹底研磨后，采用TIANGEN植物總RNA提取試劑盒(DP432)提取擬南芥種子的總RNA，然后用TransGen反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AT311-02)進行反轉(zhuǎn)錄，從而得到cDNA。將得到的cDNA稀釋10倍后，采用TaKaRa熒光定量試劑盒(SYBR Green Mix，DRR041A)，利用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進行PCR分析。以AtUBQ10為內(nèi)參基因，最終采用2-△△CT方法計算自噬基因的相對表達量。所用引物序列見表1。

表1 本研究所用引物信息

1.3 ATG8蛋白免疫印跡實驗

稱取100 mg在w(瓊脂)=0.8%的固體培養(yǎng)基上萌發(fā)3、17、50、80 h的擬南芥野生型種子，于液氮中徹底研磨后，加入300 mL的總蛋白提取緩沖液 (0.5 mol/L三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl),pH 6.8；w=5%的十二烷基硫酸鈉(SDS),φ=20%的甘油,φ=10%的β-巰基乙醇,0.2 mg/L溴酚藍)充分研磨后，將提取液倒入1.5 mL的EP管中，在95 ℃的金屬浴中加熱10 min后，13 000 r/min離心10 min，所得上清液即為種子總蛋白。取20 μL蛋白樣品，使用w=15%的SDS-PAGE膠進行電泳，最后轉(zhuǎn)PVDF膜，使用anti-ATG8 (抗體按1∶3 000稀釋使用)檢測種子萌發(fā)過程中ATG8蛋白的積累情況，使用Histone 3抗體(anti-H3)檢測內(nèi)參蛋白Histone 3的表達水平。最終采用Image J軟件分析ATG8蛋白條帶和Histone 3蛋白條帶的灰度值。ATG8抗體由華南農(nóng)業(yè)大學李發(fā)強教授惠贈，Histone 3抗體購自Abcam公司。

1.4 種子萌發(fā)實驗

1.4.1 3-MA處理 將擬南芥野生型種子經(jīng)φ=30%的次氯酸鈉溶液表面消毒后，平鋪在分別添加有0.0、0.5、1.0、2.0 mmol/L的w(瓊脂)=0.8%的固體培養(yǎng)基上，于22 ℃、全日照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在培養(yǎng)30、42、48、72、96、120 h后使用體式顯微鏡拍照并統(tǒng)計種子萌發(fā)率(以胚根突破種皮為萌發(fā)標準)。每個實驗重復3次，每次重復不少于100粒種子。

1.4.2 自噬突變體種子萌發(fā) 將相同批次擬南芥野生型種子和自噬突變體atg5-1、atg7-2種子經(jīng)φ=30%的次氯酸鈉溶液表面消毒后，平鋪在w(瓊脂)=0.8%的固體培養(yǎng)基上，于22 ℃、全日照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在培養(yǎng)30、42、48、72 h后使用體式顯微鏡拍照并統(tǒng)計種子萌發(fā)率。每個實驗重復3次，每次重復不少于100粒種子。

1.4.3 PAC處理 將相同批次擬南芥野生型種子和自噬突變體atg5-1、atg7-2種子經(jīng)φ=30%的次氯酸鈉溶液表面消毒后，分別平鋪在添加有1 mol/L PAC的w(瓊脂)=0.8%的固體培養(yǎng)基上和1 mol/L PAC+10 mol/L GA3的w(瓊脂)=0.8%的固體培養(yǎng)基上，于22 ℃、全日照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在培養(yǎng)后24、48、72、96、120 h后使用體式顯微鏡拍照并統(tǒng)計種子萌發(fā)率。每個實驗重復3次，每次重復不少于100粒種子。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與討論

2.1 種子萌發(fā)時間段確定

種子萌發(fā)受濕度、光照、溫度等環(huán)境因子及種子質(zhì)量、活力等內(nèi)在因素的影響，為了確定后續(xù)自噬基因表達分析和蛋白檢測的最佳取樣時間點，使用收獲后室溫存儲2個月的擬南芥野生型種子進行種子萌發(fā)實驗。實驗條件為：溫度22 ℃，全光照(光照強度為120 μmol/(m2·s))，w(瓊脂)=0.8%的固體培養(yǎng)基作為基質(zhì)保濕。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在w(瓊脂)=0.8%的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3、17 h后，種子均未萌發(fā)；在30 h時，種子種皮破裂，個別種子的胚根突破胚乳；在40 h時，大部分種子的胚根已突破胚乳，胚根伸出，少數(shù)種子尚未萌發(fā)；在50 h時，種子均已萌發(fā)，部分種子開始長出子葉。結(jié)合文獻[22]，確定本實驗條件下擬南芥野生型種子萌發(fā)的5個關鍵時間點為：種子鋪板后的第3 h(完成第一階段吸漲過程)、17 h(完成第二階段吸漲過程)、30 h(種皮破裂)、40 h(胚根突破胚乳，胚根伸出)和50 h(子葉生長)。

2.2 種子萌發(fā)過程中自噬對基因表達的影響

為了探究種子萌發(fā)過程是否與自噬作用相關，通過熒光定量PCR檢測了ATG4b、ATG5、ATG6、ATG7、ATG8、ATG9和ATG10等12個自噬相關基因在擬南芥野生型種子萌發(fā)3、17、30、40、50 h后的基因表達情況(圖1)。研究結(jié)果表明：在種子萌發(fā)過程中，自噬基因顯著上調(diào)表達，其中ATG8b、ATG8f和ATG10在種子萌發(fā)17 h時，相對于萌發(fā)早期(3 h)，相對表達量上升超過10倍，而其他自噬基因也都有2～6倍的上調(diào)表達；而在種子萌發(fā)中后期(30～50 h)，雖然ATG8b、ATG8c、ATG8d、ATG8f和ATG10的相對表達量相對于17 h時有所下降，但依然比種子萌發(fā)早期的相對表達量高；而其他自噬基因(如ATG4b、ATG5和ATG9)則持續(xù)高表達。

圖1 種子萌發(fā)不同階段的自噬基因表達量

2.3 種子萌發(fā)過程中對ATG8蛋白量的影響

為了進一步確定種子萌發(fā)過程中細胞自噬的激活，提取擬南芥野生型種子萌發(fā)不同時間點的總蛋白，使用蛋白免疫印跡實驗檢測ATG8蛋白的積累。結(jié)果(圖2)表明：隨著種子萌發(fā)時間延長，ATG8蛋白逐漸增多，表明在該過程中細胞自噬被逐漸激活。

圖2 擬南芥野生型種子萌發(fā)過程中ATG8蛋白表達

2.4 自噬抑制劑(3-MA)處理對擬南芥種子萌發(fā)的影響

3-甲基腺苷(3-methyladenine,3-MA)是一種磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)的抑制劑，可以有效抑制細胞自噬[28]。通過設定4個濃度梯度實驗，分析3-MA是否通過抑制細胞自噬功能來影響種子萌發(fā)進程。結(jié)果(圖3)表明自噬抑制劑3-MA可以抑制擬南芥野生型種子萌發(fā)，且抑制效果具有濃度和時間梯度特征：(1)3-MA可以顯著抑制種子萌發(fā)和后續(xù)幼苗生長(圖3A)。(2)在同一時間點，隨著3-MA濃度的升高，種子萌發(fā)率依次降低；當3-MA濃度達到2 mmol/L時，種子在96 h后才完全萌發(fā)，比不添加3-MA的條件下延遲了48 h(圖3B)。

圖3 不同濃度的3-MA處理對擬南芥野生型種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

2.5 自噬突變體種子與野生型種子的萌發(fā)速率比較

為了直觀分析自噬是否影響種子萌發(fā)，比較分析了擬南芥野生型種子和自噬突變體atg5-1、atg7-2種子的萌發(fā)速率。結(jié)果(圖4)表明細胞自噬不是種子萌發(fā)所必需的，但自噬途徑缺失會減緩種子的萌發(fā)：在42 h時，擬南芥野生型種子的萌發(fā)率為60%，而自噬突變體種子的萌發(fā)率為45%；在48 h時，擬南芥野生型種子全部萌發(fā)完成，而自噬突變體種子的萌發(fā)率為95%；在72 h時，自噬突變體種子才全部萌發(fā)。

圖4 擬南芥自噬突變體種子的萌發(fā)速率

2.6 PAC處理對自噬突變體種子萌發(fā)的影響

種子萌發(fā)過程中，植物激素赤霉素(GA)會促進種子萌發(fā)。為了進一步研究細胞自噬在GA調(diào)控的種子萌發(fā)過程中是否發(fā)揮作用，本文比較了擬南芥野生型種子和自噬突變體種子在GA合成抑制劑(PAC)處理條件下的萌發(fā)速率。由結(jié)果(圖5)可知：1 μmol/LPAC處理5天后，擬南芥野生型種子的萌發(fā)率達到100%，自噬突變體atg5-1、atg7-2種子的萌發(fā)率分別僅為15%、30%，表明擬南芥自噬突變體對PAC處理超敏感。

圖5 1 μmol/L PAC處理對擬南芥野生型種子和自噬突變體種子萌發(fā)的影響

用GA和PAC同時處理擬南芥野生型種子和自噬突變體atg5-1、atg7-2種子，結(jié)果(圖6)表明：處理3天后，擬南芥野生型種子和自噬突變體種子的萌發(fā)率均達到100%，表明擬南芥自噬突變體的種子萌發(fā)對PAC處理的超敏感確實是由于抑制了GA造成的。

圖6 1 μmol/L GA和1 μmol/L PAC處理3天對擬南芥野生型種子和自噬突變體種子萌發(fā)的影響

3 討論

在擬南芥野生型種子的萌發(fā)過程中，自噬基因持續(xù)上調(diào)表達(圖1)，并且細胞自噬重要調(diào)控蛋白ATG8在種子萌發(fā)過程中逐漸積累(圖2)，表明在種子萌發(fā)過程中細胞自噬被激活。使用不同濃度的自噬抑制劑3-MA處理，種子萌發(fā)率呈現(xiàn)不同程度的下降，說明了自噬激活與種子萌發(fā)速率的正相關性(圖3)；并且自噬突變體atg5-1、atg7-2種子的萌發(fā)速度比野生型種子的慢(圖4)，進一步證明自噬在種子萌發(fā)過程中的作用。

擬南芥種子的主要儲存物質(zhì)為油脂(主要成分為甘油三脂(triacylglycerol，TAG))，占種子干種的40%左右。種子中的TAG被一層半單位膜所包圍，形成許多大小不一的但相對穩(wěn)定的亞細胞微滴，這些小的亞細胞微滴被稱為油體(oil body)或油脂體(lipid body)或油質(zhì)體(oleosome)[29]。在種子萌發(fā)過程中，油體內(nèi)的TAG在TAG脂肪酶的作用下被氧化，形成甘油和脂肪酸，為種子的早期萌發(fā)和后期生長提供能量[22]。KELLY等[30]的研究表明，雖然TAG的降解不是擬南芥種子萌發(fā)所必需的，但也在萌發(fā)中發(fā)揮重要作用，TAG脂肪酶突變后，種子的萌發(fā)速度明顯慢于野生型種子的。最近對蓖麻的研究[31]發(fā)現(xiàn)，在萌發(fā)前期的胚乳中自噬基因表達持續(xù)上調(diào)，并且與脂類代謝基因的表達呈現(xiàn)明顯的正相關，表明自噬可能通過影響脂質(zhì)代謝而影響種子萌發(fā)過程。

2020年，F(xiàn)AN等[32]發(fā)現(xiàn)：細胞自噬參與調(diào)控饑餓誘導條件下擬南芥葉片內(nèi)油體的降解過程，進而參與調(diào)控植物脂肪代謝;黑暗誘導的碳饑餓會促使油體相關蛋白OLE1與mCherry-ATG8e標記的自噬體共定位，且誘導油體通過自噬途徑進入液泡降解，為植物生長提供能量。因此，在種子萌發(fā)過程中，細胞自噬也可能通過促進種子中油體的液泡降解而影響種子萌發(fā)速率。LUO等[4]的研究表明：在1/2 MS+1%蔗糖培養(yǎng)基中，擬南芥自噬突變體種子萌發(fā)速率與野生型種子的沒有明顯差別，說明外源添加碳源，可以恢復自噬突變體種子萌發(fā)變慢的表型。TAG脂肪酶缺失突變體的表型也類似[33]，說明自噬途徑介導脂質(zhì)的液泡降解和TAG脂肪酶介導的TAG氧化降解都對種子萌發(fā)起重要作用。

已有研究[2-4,6-8,10]表明營養(yǎng)脅迫、鹽脅迫、干旱脅迫、淹水脅迫和氧化脅迫等多種逆境脅迫對自噬突變體植物的生長發(fā)育具有明顯抑制作用，但對種子萌發(fā)過程的影響卻少有報道。2017年，LUO等[4]的研究發(fā)現(xiàn)：鹽脅迫處理可以明顯誘導植物細胞自噬；在150 mmol/LNaCl的處理條件下，自噬突變體種子的萌發(fā)明顯慢于野生型種子的，表明細胞自噬在緩解鹽脅迫抑制的種子萌發(fā)過程中發(fā)揮重要作用。高鹽條件下，擬南芥由于鹽形成的滲透勢阻礙種子吸水，同時促進種子內(nèi)ABA的積累并抑制GA的合成，從而降低種子萌發(fā)速率[34]。本研究發(fā)現(xiàn)：在添加GA合成抑制劑PAC的條件下，擬南芥自噬突變體種子的萌發(fā)速率顯著低于野生型種子的(圖5)，表明自噬途徑對緩解PAC抑制的種子萌發(fā)至關重要。以上研究表明：自噬途徑與種子萌發(fā)存在關聯(lián)，特別是在種子遭遇非生物脅迫條件下的萌發(fā)中發(fā)揮重要作用。

值得注意的是，擬南芥自噬突變體種子中積累的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)含量明顯低于野生型種子的[20,32]，因此不能完全排除種子質(zhì)量的下降導致萌發(fā)速度變慢。此外，3-MA對擬南芥野生型種子萌發(fā)速率的影響明顯強于對自噬突變體種子的(圖3,圖4)，說明3-MA還可能通過影響自噬途徑以外的其他途徑(如囊泡運輸途徑)而減慢種子的萌發(fā)速度[28]。但本研究證明：細胞自噬途徑在擬南芥種子萌發(fā)過程中被激活，而且自噬突變體種子的萌發(fā)速度慢于野生型種子的，且對GA合成抑制劑PAC處理超敏感。本研究解析了細胞自噬在油料種子萌發(fā)過程中的作用，并為研究細胞自噬在其他類型種子萌發(fā) (如水稻等淀粉種子)過程中的作用奠定了基礎。

4 結(jié)論

本研究證明自噬參與了種子萌發(fā)過程：在種子萌發(fā)過程中，自噬基因表達上調(diào)并且ATG8蛋白水平也上調(diào)，說明了自噬與種子萌發(fā)正相關；對自噬突變體種子萌發(fā)狀況的進一步探究結(jié)果表明自噬突變體種子的萌發(fā)速率明顯低于野生型種子的；自噬抑制劑導致擬南芥野生型種子的萌發(fā)速率降低，說明了自噬在種子萌發(fā)過程中至關重要。本研究結(jié)果可為淀粉作物和油料作物種子萌發(fā)過程中細胞自噬的研究提供理論依據(jù)。