劉 毅，謝雁鳴，黎元元，崔 鑫，席俊羽

·數(shù)據(jù)挖掘與循證醫(yī)學·

基于生物信息學的乳腺癌細胞焦亡相關基因多組學分析及相關中藥篩選預測

劉 毅，謝雁鳴*，黎元元*，崔 鑫，席俊羽

中國中醫(yī)科學院中醫(yī)臨床基礎醫(yī)學研究所，北京 100700

基于生物信息學探究細胞焦亡相關基因在乳腺癌中的作用及臨床意義，并篩選可對細胞焦亡起調(diào)控作用的中藥。從TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫中獲取乳腺癌相關數(shù)據(jù)集；使用R、Perl語言對細胞焦亡相關基因在乳腺癌細胞中的表達、變異進行評估；對數(shù)據(jù)集分別進行細胞焦亡基因分型及預后差異基因分型，并對各分型進行多組學分析；構建預后模型、進行風險評分，按照風險評分分組進行亞組多組學分析并檢驗對生存的預測能力；以細胞焦亡基因為靶點，利用TCMSP數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件構建“細胞焦亡靶點-成分-中藥”網(wǎng)絡并進行拓撲學分析，進而得出核心中藥及其相關屬性。大多數(shù)細胞焦亡基因在乳腺癌中表達異常并具有拷貝數(shù)變異，細胞腫瘤抗原（cellular tumor antigen p53，）等11個基因發(fā)生了體細胞突變；細胞焦亡分型中A亞型預后好、細胞焦亡基因及免疫相關通路高表達、免疫細胞含量高；B型與之相反，且A、B兩亞型差異明顯，其分型差異基因有1223個。將不同的焦亡基因重新聚類，得到3個基因型，乳腺癌細胞焦亡預后差異基因分型中I組預后最好，II組最差，I組主要為基因及細胞焦亡基因高表達，II組主要呈現(xiàn)低表達。預后模型風險評分將患者分為高、低風險組，低風險組細胞焦亡基因高表達、預后好，高風險組相反，通過列線圖可對患者不同臨床特征進行預后評估；免疫細胞與風險評分相關性大多呈負相關；腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細胞、免疫細胞及總評分均為高風險組更低，腫瘤突變負荷則高風險組更高；干細胞與風險得分呈正相關?！凹毎雇霭悬c-成分-中藥”網(wǎng)絡得出木蝴蝶、紅花等17味中藥為核心藥物，其性味主要為苦寒，次以辛溫，輔以甘平之品，主要調(diào)節(jié)肝、肺、脾、胃等臟腑。細胞焦亡基因在乳腺癌的免疫中發(fā)揮重要作用，與乳腺癌患者預后具有明顯相關性，調(diào)控細胞焦亡基因的中藥主要有木蝴蝶、紅花等17味藥物，可為乳腺癌的診療及中藥干預研究提供思路與參考。

細胞焦亡；生物信息學；中藥；乳腺癌；多組學分析；木蝴蝶；紅花

細胞焦亡（pyroptosis）是一種由炎癥小體引發(fā)的裂解性程序性細胞死亡形式[1]，該過程由促炎性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-1、4、5、11的底物gasdermin D介導并伴隨炎癥和免疫反應[2]。研究發(fā)現(xiàn)細胞焦亡可以影響腫瘤的增殖、侵襲和轉移[3]。因此，有報道認為誘導腫瘤細胞焦亡是一種潛在的癌癥治療策略[4]。

乳腺癌（breast cancer）是目前最常見的惡性腫瘤之一，是女性癌癥死亡的最常見原因[5]，其終生患病概率為12.3%[6]，對女性群體有極大的危害性。受益于診斷及影像技術發(fā)展與早期篩查，乳腺癌的死亡率已經(jīng)大幅降低[7]，但由于存在一定復發(fā)及轉移風險，乳腺癌患者的預后仍然不佳[8-9]。目前乳腺癌的治療主要包括手術、內(nèi)分泌治療、放療、化療、靶向治療等[10-12]，但這些治療往往存在較嚴重的不良反應[13-15]。因此，鑒于細胞焦亡對癌癥存在調(diào)控作用，以此研究方向為指導或可開發(fā)更加安全、有效的新藥物。

中藥對于乳腺癌治療的有效性被廣泛報道[16]，而挖掘與細胞焦亡相關的中藥則更有利于指導相關研究與臨床應用。本研究通過生物信息學方法從多組學角度全面分析細胞焦亡相關基因的表達及其與乳腺癌生存、預后、免疫、腫瘤微環(huán)境等方面的相關性，并在此基礎上篩選出可能對細胞焦亡有調(diào)控作用的中藥。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集及處理

在TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）中分別獲取乳腺癌相關轉錄組、臨床、突變及拷貝數(shù)數(shù)據(jù)。對其數(shù)據(jù)進行解壓、ID轉換并將其格式由FPKM（fragments per kilobase per million）轉換為TPM（transcripts per million）。在GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索“breast cancer survival”并限定數(shù)據(jù)類型（expression profiling by array）及物種（homo sapiens）進行篩選，獲取基因表達及臨床數(shù)據(jù)，然后對其數(shù)據(jù)進行基因符號注釋。

1.2 乳腺癌細胞焦亡基因突變、拷貝數(shù)變異、差異、生存及預后分析

通過檢索細胞焦亡相關文獻獲得細胞焦亡相關基因，將樣品突變數(shù)據(jù)中的細胞焦亡相關基因利用R語言“maftools”包及Perl語言進行突變類型、頻率、數(shù)目、堿基改變及負荷的統(tǒng)計分析，并將結果以瀑布圖表示；然后檢索UCSC Xena（https:// xena.ucsc.edu/）數(shù)據(jù)庫并下載乳腺癌拷貝數(shù)相關數(shù)據(jù)，使用Perl語言提取樣品中細胞焦亡相關基因的拷貝數(shù)，再使用R語言將樣品細胞焦亡相關基因拷貝數(shù)結果繪制成拷貝數(shù)頻率圖及圈圖；將TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫中的樣品表達量數(shù)據(jù)使用R語言中的“l(fā)imma”和“sva”包進行合并，并提取細胞焦亡基因的表達量，再將2個數(shù)據(jù)庫所得臨床數(shù)據(jù)中的生存時間、生存狀態(tài)數(shù)據(jù)進行合并，使用R語言的“survival”和“surminer”包進行生存和預后分析并可視化。

1.3 乳腺癌細胞焦亡分型及分型基因生存分析、基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）、免疫細胞差異分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）和差異性分析

根據(jù)細胞焦亡的表達量使用R語言的“ConsensuClusterPlus”對乳腺癌細胞焦亡基因進行聚類分型，其中聚類算法為K-means，距離類型為歐氏距離；然后使用R語言的“RcolorBrewer”“GSVA”“PRGcluster”等將分型后的兩組細胞焦亡基因進行生存分析、細胞焦亡基因表達分析、GSVA、ssGSEA、PCA并可視化，最后將細胞焦亡分型的兩組樣品基因表達量進行差異分析，并獲得分型之間的差異基因。

1.4 乳腺癌細胞焦亡分型差異基因基因本體（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將“1.3”項所得的細胞焦亡分型之間的差異基因使用R語言的“clusterProfiler”和“enrichplot”包分別進行GO的生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）及細胞成分（cellular component，CC）富集分析和KEGG通路富集分析，按照＜0.005進行篩選，并繪制GO及KEGG分析的氣泡圖。

1.5 乳腺癌細胞焦亡分型預后相關差異基因再分型及其生存與表達分析

根據(jù)“1.3”項所得分型差異基因的生存分析結果探尋預后相關的差異基因，再通過R語言聚類分析將預后相關差異基因進行聚類分型，選取準確性最高的聚類結果作為分型結果。根據(jù)分型結果比較不同分型之間的生存情況，并繪制生存曲線與差異基因熱圖。然后將“1.3”項所得基因分型的結果與“1.2”項所得細胞焦亡基因表達量數(shù)據(jù)使用R語言進行差異分析并繪制箱線圖。

1.6 預后模型的構建、分析及其可視化

①將包含單因素顯著基因表達數(shù)據(jù)和臨床生存數(shù)據(jù)的集合進行隨機分組，分為訓練（train）組及驗證（test）組；然后構建基因表達量及生存時間、狀態(tài)的套索算法（least absolute shrinkage and selection operator，Lasso）回歸模型并進行交叉驗證，選擇其中誤差最小的點對應的基因作為Lasso回歸模型顯著基因，結合顯著基因與其表達量構建COX回歸模型。②利用訓練組得出模型計算公式，即基因表達量乘以系數(shù)再求和，進一步根據(jù)公式計算訓練組風險得分，根據(jù)得分中位數(shù)區(qū)分高、低風險組；驗證組同理，即通過公式計算風險得分，并根據(jù)訓練組的中位數(shù)區(qū)分驗證組的高、低風險組；進行生存差異分析并得出差異的值、受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）、風險曲線及列線圖。③將細胞焦亡分型、基因分型結果通過R語言分別進行預后分析，比較不同分型之間的差異性及風險得分并可視化；再分析高、低風險組之間細胞焦亡相關基因的差異性，并繪制箱線圖。

1.7 免疫細胞浸潤與免疫細胞含量分析

將“1.2”項中TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫所得數(shù)據(jù)的并集利用R語言CIBERSORT命令獲得總量為1的免疫細胞相對含量；將免疫細胞相對含量的數(shù)據(jù)結果根據(jù)＜0.05進行過濾，并與“1.6”項風險得分的結果取交集，最后對所有免疫細胞進行循環(huán)計算，得到風險得分、基因與免疫細胞的相關性結果。

1.8 腫瘤微環(huán)境分析、腫瘤突變負荷分析及干細胞分析

①將“1.2”項中TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫所得數(shù)據(jù)的并集使用R語言“estimate”包對腫瘤微環(huán)境進行基質(zhì)細胞、免疫細胞、腫瘤純度分析以及綜合評分；利用評分結果與“1.6”項所得高、低風險組進行腫瘤微環(huán)境差異分析，并采用小提琴圖表示。②將所有樣品的風險數(shù)據(jù)與染色體突變位置數(shù)據(jù)利用Perl語言分析得出其按照高、低風險組區(qū)分的腫瘤突變數(shù)據(jù)，并使用R語言繪制瀑布圖；利用R語言的“reshape2”包結合“1.7”項中樣品風險數(shù)據(jù)及“1.5”項中分型數(shù)據(jù)獲取腫瘤突變負荷數(shù)據(jù)，并以箱線圖表示。③將泛癌干細胞打分數(shù)據(jù)結合“1.7”項中樣品風險數(shù)據(jù)，利用R語言分析獲得相關性結果并繪制散點圖。

1.9 統(tǒng)計分析

使用R v.4.1.2軟件進行統(tǒng)計分析。2組獨立樣品數(shù)據(jù)比較采用檢驗。3組及以上的數(shù)據(jù)，則采用單因素方差分析（ANOVA）及Kruskal-Wallis秩和檢驗，以＜0.05表示存在統(tǒng)計學意義。

1.10 “細胞焦亡相關靶點-有效成分-中草藥”網(wǎng)絡構建與藥物篩選

將細胞焦亡相關靶基因使用TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）查找靶點相關的有效成分并根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug likeness，DL）≥0.18進行篩選，然后通過有效成分篩選相關中藥，使用CytoscapeV 3.8.0構建“靶點-成分-中藥”網(wǎng)絡并通過拓撲學分析獲取核心中藥。

2 結果

2.1 數(shù)據(jù)收集與處理結果

通過檢索TCGA及GEO數(shù)據(jù)庫，獲得TCGA-乳腺癌中包含正常樣品113個，腫瘤樣品1109個；獲得的GEO數(shù)據(jù)（GSE146558）中包含腫瘤樣品109個。

2.2 乳腺癌細胞焦亡基因突變分析、拷貝數(shù)變異分析、差異分析、生存分析及預后分析結果

經(jīng)過檢索文獻獲得細胞焦亡基因52個，具體如表1所示。通過分析乳腺癌中細胞焦亡相關基因的拷貝數(shù)變異和基因突變的發(fā)生率，可知在986個突變數(shù)據(jù)樣品中有394個樣品發(fā)生了變異，突變比例占39.96%，其中突變率最高，達34%，其他為（2%）、（1%）、（1%）、（1%）、（1%）、（1%）、（1%）、（1%）、（1%）、（1%），如圖1-A所示；圖1-B則顯示大多數(shù)細胞焦亡相關基因存在拷貝數(shù)的變化，而拷貝增加較缺失頻率略大；由圖1-C可進一步看出拷貝數(shù)變化的細胞焦亡相關基因所在染色體的位置；由圖1-D可以看出71%的細胞焦亡基因在正常樣品和腫瘤樣品間表達存在顯著性差異，其中、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、為腫瘤組表達上調(diào)，、、、、、、、、、、、、、、為腫瘤組表達下調(diào)。將TCGA與GEO數(shù)據(jù)合并后進行生存分析，結果見表2，其中風險率（hazard ratio，HR）＞1的基因為高風險基因，＜0.05則說明該基因為預后相關，根據(jù)圖2-A可知，生存曲線中的預后相關基因有、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、，其大多為高表達則預后較好；然后進一步構建預后網(wǎng)絡，如圖2-B所示，其中紫色節(jié)點表示高風險基因，綠色節(jié)點表示低風險基因、節(jié)點大小表示值，紅色連線表示正向共表達，藍色連線表示負向共表達，由連線密度可知其中存在密切的聯(lián)系。

2.3 乳腺癌細胞焦亡分型及分型基因生存分析、GSVA、ssGSEA、PCA和差異分析結果

通過對細胞焦亡相關基因表達量數(shù)據(jù)進行聚類分析，可將樣品分為A和B 2個亞型（圖3-A）；對2個亞型進行生存分析，如圖3-B所示，可知其存在統(tǒng)計學差異（＜0.05），且A亞型預后較好；對2個亞型基因表達進行分析，如圖3-C所示，可得A亞型多數(shù)呈現(xiàn)高表達，B亞型則相反；通過GSVA分析，則能看出A亞型主要對免疫相關通路呈現(xiàn)高表達，B亞型主要表現(xiàn)為低表達（圖3-D）；從ssGSEA分析結果（圖3-E）可知，22個在兩亞型間存在統(tǒng)計學差異的免疫細胞，其中活化B細胞、活化的CD4細胞、活化的CD8細胞、活化的樹突狀細胞、CD56bright自然殺傷細胞、嗜酸性粒細胞、γδT細胞、未成熟B細胞、未成熟的樹突狀細胞、骨髓源性抑制細胞、巨噬細胞、肥大細胞、單核細胞、自然殺傷T細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、調(diào)節(jié)性T細胞、濾泡輔助T細胞、1型T輔助細胞、17型T輔助細胞、2型T輔助細胞均在A亞型中含量高；唯有CD56dim自然殺傷細胞在B亞型中含量高；PCA分析（圖3-F）顯示，根據(jù)細胞焦亡相關基因的表達量可將A與B亞型明顯區(qū)分；最后通過設置|log2FC|＞0.585、＜0.05，篩選出細胞焦亡分型的顯著差異基因有1223個。

2.4 乳腺癌細胞焦亡分型差異基因GO富集分析和KEGG通路富集分析

通過對1223個細胞焦亡分型的顯著差異基因進行GO分析，結果表明，BP主要涉及T細胞活化、細胞間黏附的調(diào)節(jié)、白細胞-細胞黏附、細胞因子產(chǎn)生的正調(diào)控、單核細胞分化、細胞活化的正調(diào)控、T細胞黏附的調(diào)節(jié)等免疫過程；MF主要涉及受體配體活性、信號受體激活劑活性、細胞因子受體結合、細胞因子活性、免疫受體等；CC主要涉及質(zhì)膜筏的外側、內(nèi)吞囊泡、膜筏、膜微區(qū)等（圖4-A）。KEGG通路富集分析顯示，主要包括細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號通路、細胞黏附分子、愛潑斯坦-巴爾病毒感染、人類T細胞白血病病毒1感染、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用、造血細胞譜系、結核、吞噬體、破骨細胞分化、類風濕關節(jié)炎、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路、Th17細胞分化、TNF信號通路等炎癥、免疫相關通路（圖4-B）。

表1 細胞焦亡相關基因

Table 1 Information of pyroptosis-related genes

序號基因符號基因名稱 1BAK1B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）同源拮抗劑/殺傷劑（Bcl-2 homologous antagonist/killer） 2BAXBcl-2-相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein） 3CASP1半胱氨酸天冬氨酸酶-1（Caspase-1） 4CASP3半胱氨酸天冬氨酸酶-3（Caspase-3） 5CASP4半胱氨酸天冬氨酸酶-4（Caspase-4） 6CASP5半胱氨酸天冬氨酸酶-5（Caspase-5） 7CHMP2A帶電多泡體蛋白2a（charged multivesicular body protein 2a） 8CHMP2B帶電多泡體蛋白2b（charged multivesicular body protein 2b） 9CHMP3帶電多泡體蛋白3（charged multivesicular body protein 3） 10CHMP4A帶電多泡體蛋白4a（charged multivesicular body protein 4a） 11CHMP4B帶電多泡體蛋白4b（charged multivesicular body protein 4b） 12CHMP4C帶電多泡體蛋白4c（charged multivesicular body protein 4c） 13CHMP6帶電多泡體蛋白6（charged multivesicular body protein 6） 14CHMP7帶電多泡體蛋白7（charged multivesicular body protein 7） 15CYCS細胞色素C（cytochrome C） 16ELANE中性白細胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase） 17GSDMD焦孔素D（gasdermin D） 18GSDME焦孔素E（gasdermin E） 19GZMB粒酶B（granzyme B） 20HMGB1高遷移率基團蛋白B1（high mobility group protein B1） 21IL18白細胞介素-18（interleukin-18） 22IL1A白細胞介素-1α（interleukin-1alpha） 23IL1B白細胞介素-1β（interleukin-1beta） 24IRF1干擾素調(diào)節(jié)因子1（interferon regulatory factor 1） 25IRF2干擾素調(diào)節(jié)因子2（interferon regulatory factor 2） 26TP53細胞腫瘤抗原p53（cellular tumor antigen p53） 27TP63腫瘤蛋白63（tumor protein 63） 28AIM2干擾素誘導蛋白AIM2（interferon-inducible protein AIM2） 29CASP6半胱氨酸天冬氨酸酶-6（Caspase-6） 30CASP8半胱氨酸天冬氨酸酶-8（Caspase-8） 31CASP9半胱氨酸天冬氨酸酶-9（Caspase-9） 32GPX4磷脂過氧化氫谷胱甘肽過氧化物酶（phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase） 33GSDMA焦孔素A（gasdermin A） 34GSDMB焦孔素B（gasdermin B） 35GSDMC焦孔素C（gasdermin C） 36IL6白細胞介素6（interleukin-6） 37NLRC4含NLR家族CARD域蛋白4（NLR family CARD domain-containing protein 4） 38NLRP1核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白1（NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 1） 39NLRP2核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白2（NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 2） 40NLRP3核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 3） 41NLRP6核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白6（NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 6） 42NLRP7核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白7（NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 7） 43NOD1核苷酸結合寡聚化結構域蛋白1（nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 1） 44NOD2核苷酸結合寡聚化結構域蛋白2（nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein 2） 45PJVKpejvakin 46PLCG11-磷脂酰肌醇 4,5-二磷酸磷酸二酯酶γ-1（1-phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate phosphodiesterase gamma-1） 47PRKACAcAMP依賴性蛋白激酶催化亞基α（cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha） 48PYCARD含有 CARD 的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD） 49SCAF11富含絲氨酸/精氨酸的剪接因子2相互作用蛋白11（serine/arginine-rich splicing factor 2-interacting protein 11） 50TIRAP受體結構域的銜接蛋白（Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter protein Toll/interleukin-1） 51TNF腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor） 52GZMA顆粒酶A（granzyme A）

a-細胞焦亡基因突變頻率瀑布圖（圖中A為腺嘌呤，T為胸腺嘧啶，C為胞嘧啶，G為鳥嘌呤） b-拷貝數(shù)變異頻率統(tǒng)計圖 c-細胞焦亡基因拷貝數(shù)圈圖 d-細胞焦亡基因差異分析箱線圖 *P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下同

2.5 乳腺癌細胞焦亡分型預后相關差異基因再分型及其生存分析與表達分析結果

通過對1223個細胞焦亡分型預后顯著差異基因進行再分型，可得到3組分型基因，分別為I、II、III，如圖5-A所示；對這3組分型基因進行生存分析，3組分型差異存在顯著性差異（＜0.05），且其中I組預后最好，II組預后最差（圖5-B）；對3組分型基因進行表達分析，可見I組主要表現(xiàn)為高表達，II組主要呈現(xiàn)低表達（圖5-C），結合生存分析及基因表達分析可知，相關基因呈現(xiàn)高表達則預后較好，反之則預后較差，與預期一致；接下來對3組細胞焦亡基因分型進行差異分析，可知3組之間超過80%細胞焦亡基因存在顯著性差異，其中超過60%細胞焦亡基因為I組高表達，超過70%細胞焦亡基因為II組低表達（圖5-D）。

2.6 預后模型構建、預后分析及其可視化結果

2.6.1 預后模型Lasso回歸結果及交叉驗證 結果如圖6-A、B所示，COX回歸模型得出2組及總體的風險值；預后模型構建過程如圖6-C所示，即首先根據(jù)細胞焦亡相關基因的表達量將樣品分為2個亞型（A、B亞型），然后通過差異分析找出該2亞型中存在的差異基因，通過分析差異基因的表達量對基因進行分型（分型I、分型II和分型III）；對差異基因進行生存分析以找出預后相關的差異基因并構建預后相關模型；再根據(jù)預后模型將患者分為高、低風險組，最終根據(jù)預后模型預測患者的生存期。

表2 細胞焦亡基因生存分析

Table 2 Survival analysis of pyroptosis genes

基因HRP值基因HRP值 BAK11.086 233 4160.087 484 657AIM20.931 151 0620.066 065 479 BAX0.970 691 3540.105 234 434CASP60.910 201 2930.084 018 105 CASP10.896 254 8790.010 444 668CASP80.818 232 0470.005 053 259 CASP31.067 483 8400.158 124 658CASP90.697 598 3540.002 007 942 CASP40.826 676 9950.014 357 829GPX40.852 816 8900.020 811 101 CASP50.928 306 5720.109 390 972GSDMB0.967 202 3440.064 985 900 CHMP2A0.848 139 8750.018 369 884GSDMC1.113 768 9640.004 412 956 CHMP2B1.345 011 5030.001 323 049IL61.004 507 1980.280 644 973 CHMP4B0.874 446 5480.046 762 979NLRC41.172 839 9550.030 111 467 CHMP4C1.190 235 2730.008 719 777NLRP10.942 709 2080.032 939 873 CHMP60.813 665 0390.005 475 246NLRP20.956 027 0220.068 839 075 CHMP70.943 839 4580.010 553 598NLRP30.944 446 0080.042 430 619 CYCS1.262 775 2940.005 881 638NLRP60.893 862 7040.022 686 052 ELANE0.877 124 5100.084 815 313NLRP70.928 231 6950.012 910 692 GSDMD0.917 067 5750.001 474 721NOD11.013 837 2360.087 182 922 GZMB0.880 111 2550.001 741 422NOD20.986 949 2810.054 333 534 HMGB11.001 715 0220.244 834 971PLCG11.035 148 3180.109 209 786 IL180.802 492 4070.000 842 706PRKACA1.082 406 9900.115 309 162 IL1A0.943 171 5880.008 360 707PYCARD0.872 856 3540.000 215 098 IL1B0.976 908 5220.050 530 822SCAF111.111 688 2610.036 312 269 IRF10.813 292 0160.001 267 743TIRAP1.223 149 4130.016 585 961 IRF20.636 756 1190.002 620 915TNF0.972 806 3410.129 396 207 TP531.125 176 5660.012 799 973GZMA0.867 120 1070.000 788 690 TP630.863 959 6550.000 120 009

A-預后存在統(tǒng)計學差異的細胞焦亡基因生存曲線 B-細胞焦亡基因預后網(wǎng)絡

A-BRCA細胞焦亡聚類分型結果（1-聚類1，2-聚類2） B-細胞焦亡分型生存曲線 C-細胞焦亡分型熱圖 D-細胞焦亡分型GSVA分析熱圖 E-細胞焦亡分型免疫細胞差異分析箱線圖 F-細胞焦亡分型PCA散點圖

2.6.2 細胞焦亡分型風險得分的差異分析 結果表明A、B兩亞型間差異有統(tǒng)計學意義，其中分型B的風險評分更高，如圖6-D所示；基因分型風險得分的差異分析結果表明分型I、II及分型II、III之間差異有統(tǒng)計學意義，分型I、III之間則無統(tǒng)計學意義，同時可以看出分型II的風險評分最高，如圖6-E所示。

圖4 細胞焦亡分型差異基因GO及KEGG富集分析氣泡圖

2.6.3 高、低風險組細胞焦亡基因表達量的差異分析 結果如圖6-F所示，高、低風險組中細胞焦亡基因絕大多數(shù)（41/52）存在顯著差異，且這些基因中除、、3個基因在高風險組為高表達外，其余均表現(xiàn)為低表達；此外由生存曲線（圖6-G）可知，不論訓練組、驗證組還是總體組（訓練組及驗證組的總和）其高、低風險組的生存時間都存在顯著差異，說明構建的預后模型可區(qū)分高、低風險組的患者；由ROC曲線（圖6-H）可知，訓練組線下面積最大而驗證組線下面積最小，因此通過預后模型預測生存期訓練組準確性最大而驗證組最小，而不論訓練組、驗證組還是總體組線下面積都大于0.65，因此預后模型預測生存期準確性均較高；列線圖可提供預后模型對患者不同臨床特征生存期的預測，由圖6-I可知女性、年齡62歲、高風險評分的患者預后差，其1年、3年、5年生存率分別為96.7%、83.4%、70.9%，圖6-J則顯示了列線圖生存率預測的準確性；最后根據(jù)患者高、低風險排序繪制風險曲線（圖6-K），不論訓練組、驗證組還是總體組3者都是隨風險值增高而死亡人數(shù)增多，與預測相符，而風險熱圖則提示所列基因皆為低風險基因。

2.7 免疫細胞浸潤與免疫細胞含量分析結果

通過CIBERSORT計算求得每種免疫細胞在每個樣品中的相對含量作為免疫細胞浸潤結果；利用該結果進一步得出風險得分與免疫細胞相關性，其中存在顯著負相關性的有幼稚B細胞、靜息樹突狀細胞、巨噬細胞M1、單核細胞、γδT細胞、CD8 T細胞、靜息肥大細胞、靜息CD4記憶T細胞、漿細胞；存在顯著正相關性的有活化樹突狀細胞、M0巨噬細胞、M2巨噬細胞、活化肥大細胞、靜息自然殺傷細胞，見圖7-A。參與模型構建的基因與免疫細胞相關性如圖7-B所示，其中大部分基因與免疫細胞存在相關性，且呈負相關性較正相關性者多。

2.8 腫瘤微環(huán)境分析、腫瘤突變負荷分析及干細胞分析結果

2.8.1 腫瘤微環(huán)境分析 首先獲得腫瘤微環(huán)境TCGA、GEO兩數(shù)據(jù)庫臨床樣品的評分結果，包含基質(zhì)細胞評分、免疫細胞評分、總評分以及腫瘤純度4個方面；然后將腫瘤微環(huán)境評分結果按照高、低風險分組進行差異分析，由圖8-A可知基質(zhì)細胞評分、免疫細胞評分及總評分在高、低風險組間均具有統(tǒng)計學差異，且腫瘤微環(huán)境評分均為高風險組更低；使用瀑布圖展示高、低風險組的突變數(shù)據(jù)，如圖8-B、C所示，2組的突變率較接近（84.12%、85.89%），而高風險組突變率略高于低風險組。

2.8.2 腫瘤突變負荷相關性分析 結果顯示高、低風險組間腫瘤突變負荷存在統(tǒng)計學差異，其中高風險組患者的腫瘤突變負荷較高（圖8-D）；對3組基因分型樣品的風險評分及腫瘤突變負荷進行相關性分析，由圖8-E可知二者相關性有統(tǒng)計學意義，且呈正相關。

A-細胞焦亡分型預后差異基因再聚類分型結果 B-預后差異基因分型生存曲線 C-預后差異基因分型熱圖 D-預后差異基因分型的細胞焦亡基因差異分析箱線圖

2.8.3 干細胞相關性分析 結果（圖8-F）顯示干細胞指數(shù)與風險評分之間存在相關性（＜0.05），且二者呈正相關。

2.9 “細胞焦亡靶點-成分-中藥”網(wǎng)絡構建與中藥篩選結果

通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，找到18個細胞焦亡靶點數(shù)據(jù)，將與該18個細胞焦亡靶點相關聯(lián)的34種有效成分（表3）及380味中藥進行網(wǎng)絡構建（圖9-A）并進行分析，分別通過節(jié)點度（degree）值篩選核心成分和核心中藥，核心成分（度值＞2.5倍中位數(shù)）主要包括槲皮素（quercetin）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、β-胡蘿卜素（β-carotene）、金合歡素（acacetin）、黃芩素（baicalein）、漢黃芩素（wogonin）、蘆薈大黃素（aloe-emodin）、表沒食子兒茶精沒食子酸酯 [(?)-epigallocatechin-3-gallate]、川陳皮素（nobiletin）、人參皂苷Rh2（ginsenoside Rh2）、柚皮素（naringenin）；核心中藥（度值＞2.5倍中位數(shù)）主要包括木蝴蝶、紅花、余甘子、白果、半枝蓮、牛膝、菊花、香薷、馬齒莧、連翹、連錢草、敗醬草、枇杷葉、關黃柏、皂角刺、馬鞭草、金銀花17味。對380味中藥進行性味歸經(jīng)統(tǒng)計分析，其中四氣以溫、寒、微寒、平為主；五味以苦、辛、甘為主；歸經(jīng)主要歸肝、肺經(jīng)，見圖9-B、C、D。

A-Lasso回歸模型圖 B-交叉驗證圖 C-預后模型構建過程?；鶊D D-細胞焦亡分型風險得分差異分析圖 E-預后差異基因分型風險得分差異分析圖 F-高、低風險組細胞焦亡基因表達差異分析箱線圖 G-訓練組、驗證組、總體組的高低風險生存分析曲線 H-訓練組、驗證組、總體組ROC曲線 I-生存期預測列線圖 J-列線圖校準曲線 K-訓練組、驗證組、總體組風險曲線

A-diagram of model of lasso regression B-cross-validation results C-alluvial diagram of prognostic model construction process D-diagram of differential analysis of risk score in different clusters of pyroptosis genes E-diagram of differential analysis of risk score in different clusters of prognostic differential genes F-box plot of differential analysis of pyroptosis genes’ expression in group of high or low risk G-survival curves of high or low risk in train, test and total groups H-ROC curves in train, test and total groups I-nomogram of life time prediction J-nomogram calibration curve K-risk curves of train, test and total groups

圖6 預后模型構建、預后分析及其可視化結果

Fig. 6 Results of construction of prognostic model, prognostic analysis and their visualization

3 討論

細胞焦亡作為一種受調(diào)節(jié)的促炎形式的細胞死亡，其在形態(tài)學、機制學和病理生理學上不同于包括細胞凋亡和壞死在內(nèi)的其他形式的細胞死亡，其特點是質(zhì)膜快速破裂，隨后釋放細胞內(nèi)容物和促炎介質(zhì)，包括IL-1β、IL-18和警報素高遷移率族蛋白1（high mobility group protein B1，HMGB-1）等[17]。細胞焦亡已被確認與心血管疾病、傳染病、卵巢癌、肺癌等疾病有關，但是其與乳腺癌的關系卻仍缺少相關研究證實[18-20]，且相關的生物信息學研究也缺乏涉及中藥方面的分析，因此本研究對3者的關系進行了一定程度探究。

本研究首先根據(jù)乳腺癌細胞焦亡基因突變分析可知突變頻率遠高于其他基因，而研究證實的突變可能是除乳腺癌1型易感蛋白（breast cancer type 1 susceptibility protein，）、乳腺癌2型易感蛋白（Breast cancer type 2 susceptibility protein，）外的另一個導致乳腺癌的關鍵因素，其與三陰性乳腺癌有關[21]；腫瘤組和正常組的對比則可發(fā)現(xiàn)細胞焦亡相關基因的表達大多數(shù)在二者中存在顯著差異，而腫瘤組表達上調(diào)者略多于表達下調(diào)者，研究認為[4]細胞焦亡與癌癥的關系復雜，不同組織和遺傳背景的細胞焦亡對癌癥的影響不同而呈現(xiàn)促癌和抑癌2種作用。乳腺癌細胞焦亡基因生存分析顯示，生存曲線差異顯著且高風險的基因中高表達與乳腺癌患者較差的存活率相關[22]，并可介導癌細胞中的非典型細胞焦亡途徑，導致腫瘤壞死；在腫瘤組中低表達，有動物實驗證明其表達上調(diào)可促進乳腺癌細胞凋亡[23]；作為磷脂酶C的主要亞型，是細胞信號傳導的重要介質(zhì)，其在各種癌癥中經(jīng)常富集和突變，并參與腫瘤發(fā)生的過程，包括增殖、遷移和侵襲[24]；有文獻報道稱其可作為乳腺癌細胞凋亡的生物標志物在化療后表達增加[25]；分析研究認為與乳腺癌的骨轉移有關[26]；所參與的通路則有促成雌激素誘導的乳腺癌細胞增殖和內(nèi)分泌抵抗的作用[27]；在包括乳腺癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中過度表達，且在乳腺癌生長、轉移及治療抵抗方面起作用[28]?？傮w來說細胞焦亡基因在乳腺癌中突變頻率不高，但其突變大部分與預后相關。

A-風險得分與免疫細胞相關性圖 B-模型構建基因與免疫細胞相關性熱圖

通過將乳腺癌細胞焦亡基因進行聚類及分型，發(fā)現(xiàn)A亞型患者生存結局優(yōu)于B亞型，且A亞型中細胞焦亡基因多數(shù)呈現(xiàn)高表達；GSVA、ssGSEA分析顯示，炎癥相關通路、免疫細胞均在A亞型中富集，A亞型特征為細胞焦亡基因高表達、免疫激活和免疫細胞浸潤、有生存優(yōu)勢，B亞型與之相反。對細胞焦亡基因分型進行預后差異分析，得出差異基因1223個，并將之再次聚類獲得3組基因分型，同樣得到I組細胞焦亡基因表達最高、生存預期最好，II組細胞焦亡基因表達最低、生存預期最差，2次分型結果一致。通過構建預后模型并進行風險評分，得出高風險組預后差，低風險組細胞焦亡基因高表達，且有較高的準確性。不論免疫浸潤還是腫瘤微環(huán)境分析都得出同一個結論，即高風險組預后較差、細胞焦亡基因低表達、生存期較短、免疫細胞浸潤少；低風險組則與之相反，這也反映了細胞焦亡與乳腺癌及其腫瘤微環(huán)境、免疫反應之間的關系。研究認為，腫瘤微環(huán)境與乳腺癌的產(chǎn)生與進展密切相關[29-30]，而其則表現(xiàn)為大量炎性細胞浸潤，如B細胞浸潤與晚期乳腺癌相關、CD4+、CD8+T細胞的浸潤與乳腺癌預后相關[30-31]。

A-高、低風險組腫瘤微環(huán)境差異分析小提琴圖 B-低風險組基因突變頻率瀑布圖 C-高風險組基因突變頻率瀑布圖 D-高、低風險組腫瘤突變負荷差異分析箱線圖 E-風險評分與腫瘤突變負荷相關性散點圖 F-風險評分與干細胞相關性分析散點圖

表3 18個細胞焦亡靶點相關成分

Table 3 Related ingredients of 18 pyroptosis genes

MOLID化學成分OB/%DLMOLID化學成分OB/%DL MOL006821(?)-epigallocatechin-3-gallate55.090.77MOL003187triptolide51.290.68 MOL009135ellipticine30.820.28MOL005944matrine63.770.25 MOL000422kaempferol41.880.24MOL007154tanshinone iia49.890.40 MOL010616eckol87.060.63MOL002773β-carotene37.180.58 MOL000358β-sitosterol36.910.75MOL002928oroxylin A41.370.23 MOL005828nobiletin61.670.52MOL001592piperine42.520.23 MOL013179fisetin52.600.24MOL001714podophyllotoxin59.940.86 MOL000471aloe-emodin83.380.24MOL005916irisolidone37.780.30 MOL001689acacetin34.970.24MOL000546diosgenin80.880.81 MOL002714baicalein33.520.21MOL012920sinomenine30.980.46 MOL009593verticinone60.070.67MOL001924paeoniflorin53.870.79 MOL000173wogonin30.680.23MOL003627sophocarpine64.260.25 MOL005344ginsenoside Rh236.320.56MOL003680sophoridine60.070.25 MOL000098quercetin46.430.28MOL013079dl-praeruptorin A46.460.53 MOL004328naringenin59.290.21MOL004575astilbin36.460.74 MOL000006luteolin36.160.25MOL002662rutaecarpine40.300.60 MOL001439arachidonic acid45.570.20MOL002322isovitexin31.290.72

A-“細胞焦亡靶點-成分-中藥”網(wǎng)絡圖 B-細胞焦亡相關中藥四氣分布 C-細胞焦亡相關中藥五味分布 D-細胞焦亡相關中藥歸經(jīng)分布

從上述分析可知，細胞焦亡與乳腺癌有顯著的相關性，因此挖掘可調(diào)控細胞焦亡靶基因的中藥則可為乳腺癌治療藥物的研發(fā)提供參考。乳腺癌屬中醫(yī)“乳巖”范疇，其發(fā)病主要為情志失調(diào)、脾胃損傷、沖任失調(diào)，痰濁、瘀血乘結乳房而生[32]。從數(shù)據(jù)挖掘結果來看，所得核心中藥木蝴蝶、紅花、余甘子、白果、半枝蓮、牛膝、菊花、香薷、馬齒莧、連翹、連錢草、敗醬草、枇杷葉、關黃柏、皂角刺、馬鞭草、金銀花[33-49]等均具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫及抗炎作用，其所含成分中山柰酚可通過抑制Caspase-1的表達和活性、增加Toll樣受體4和NLRP3的蛋白表達以及抑制GSDMD的分解來減少細胞焦亡[50]；動物實驗證明槲皮素可阻斷氧化應激誘導的軟骨細胞焦亡來抑制骨關節(jié)炎[51]；木犀草素則被報道有助于減輕膿毒癥誘導的肺損傷小鼠模型肺組織中Caspase-11依賴的細胞焦亡[52]；黃芩素可上調(diào)微小RNA-192-5p（miR-192-5p）/硫氧還蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）軸而抑制NLRP3/Caspase-1通路，從而調(diào)控細胞焦亡和炎癥[53]；漢黃芩素可通過抑制GSDMD介導的細胞焦亡，減輕順鉑誘導的小鼠心臟毒性[54]；表沒食子兒茶精沒食子酸酯可抑制Caspase-1激活和IL-1β分泌[55]；柚皮素可通過調(diào)節(jié)微小RNA-200b（miR-200b）/鋅指蛋白802（zinc finger protein 802，JAZF1）軸抑制乳腺癌的發(fā)生[56]。根據(jù)生物信息學分析表明，乳腺癌中細胞焦亡過程涉及免疫浸潤與炎性因子聚集，而炎性因子聚集多造成局部炎癥發(fā)熱，該過程與中醫(yī)的“火毒”存在一定的相似性[57]，因此其治療用藥以苦、寒為主；而內(nèi)火多因“郁”而成，毒則為“聚而不散”所致，故用藥應當辛散溫通；中醫(yī)歷來強調(diào)顧護正氣，正氣存內(nèi)，邪不可干，故甘平補益之品當為輔。從歸經(jīng)來看細胞焦亡相關藥物主要歸肝、肺、脾、胃經(jīng)，因龍虎回環(huán)、脾升胃降皆為周身氣機之樞，故細胞焦亡、乳腺癌此類“郁”所致的病理過程或疾患應以此為歸經(jīng)。

4 結論

本研究采用生物信息學方法對TCGA、GEO數(shù)據(jù)庫的乳腺癌數(shù)據(jù)進行細胞焦亡相關多組學分析，從而得出細胞焦亡與乳腺癌有顯著的相關性，其涉及腫瘤微環(huán)境免疫細胞浸潤相關機制。而對細胞焦亡起調(diào)控作用的中藥主要為木蝴蝶、紅花、余甘子、白果、半枝蓮、牛膝、菊花、香薷、馬齒莧、連翹、連錢草、敗醬草、枇杷葉、關黃柏、皂角刺、馬鞭草、金銀花，其主要為苦寒，次為辛溫，輔以甘平之品，而主要調(diào)節(jié)肝、肺、脾、胃等臟腑，發(fā)揮清熱解毒、調(diào)和肝脾之功。本研究結果可為中藥的臨床應用與進一步研究提供指導與參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Multi-omics analysis of pyroptosis-related genes in breast cancer and screening prediction of related traditional Chinese medicines based on bioinformatics

LIU Yi, XIE Yan-ming, LI Yuan-yuan, CUI Xin, XI Jun-yu

Institute of Basic Research in Clinical Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

To explore the role and clinical significance of pyroptosis related genes in breast cancer and screen traditional Chinese medicines (TCMs) that can regulate pyroptosis based on bioinformatics.Breast cancer related data sets were obtained from TCGA and GEO databases; The expression and variation of pyroptosis related genes in breast cancer was evaluate by R and Perl language; Pyroptosis genotyping and prognostic differential genotyping were performed on the data sets, and multi-omics analysis was performed for each genotype; The prognostic model were constructed, risk scores were performed, and sub-group multi-omics analysis was carried out according to risk scores to test the predictive power of survival. Finally, the pyroptosis related genes were used as the targets, and the TCMSP database and Cytoscape software were used to construct “target-component-Chinese herbal medicine” network and topological analysis to obtain core TCMs and their related attributes.Most genes related to pyroptosis were abnormally expressed in breast cancer and had copy number variation; Eleven genes such as cellular tumor antigen p53 () had somatic mutations. The A subtype of pyroptosis had good prognosis, high expression of pyroptosis genes and immune-related pathways, and high content of immune cells. Type B was the opposite, and type A and B had obvious differences, the number of differential genes was 1223. The differential genes of pyroptosis were reclustered to generate three genotypes. Among them, group I had the best prognosis, group II had the worst prognosis, and pyroptosis related genes were mainly highly expressed in group I, and lowly expressed in group II. The patients were divided into high and low risk groups according to risk scores of prognostic model. The low risk group showed high expression of pyroptosis gene and good prognosis, while the high risk group showed the opposit. The prognostic evaluation of different clinical characteristics of patients could be carried out through the nomogram; The correlation analysis of immune cells and risk scores showed that most of them were negatively correlated; In the tumor microenvironment, the stromal cell score, immune cell score and total score were lower in all high risk group, and tumor mutation burden was higher in the high risk group. Stem cells were also positively correlated with the risk score. The network of “target of pyroptosis-component-TCMs” obtained 17 TCMs, such as Muhudie () and Honghua (). Their nature and flavor were mainly bitter and cold, followed by pungent and warm, supplemented by sweet and light medicines, which mainly regulate the liver, lungs, spleen and stomach, etc.The pyroptosis genes play an important role in the immunity of breast cancer, and have obvious correlation with the prognosis of breast cancer patients. The main TCMs that regulate pyroptosis include 17 medicines such asand. The conclusion can provide ideas and references for further research.

pyroptosis; bioinformatics; traditional Chinese medicine; breast cancer; multi-omics analysis;;

R285

A

0253 - 2670(2022)18 - 5768 - 18

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.020

2022-02-20

國家重點研發(fā)計劃“中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究”項目（2018YFC1707400）；中國中醫(yī)科學院科技創(chuàng)新工程中醫(yī)臨床基礎學科創(chuàng)新團隊項目（CI2021B003）；2021年岐黃學者支持項目

劉 毅（1993—），男，山西長治人，博士研究生在讀，研究方向為基于中成藥真實世界證據(jù)與價值評估研究。E-mail: 709473245@qq.com

謝雁鳴（1959—），女，教授，研究員，博士生導師，中國中醫(yī)科學院首席研究員，研究方向為中藥上市后再評價方法學研究、中西醫(yī)結合臨床、老年病學。E-mail: ktzu2018@163.com

黎元元，博士，研究員，研究方向為中藥上市后再評價。Tel: (010)64014411-3351 E-mail: chibjyy@163.com

[責任編輯 潘明佳]