王方園，王 棟，孔憲斌，時(shí)浩洋，趙 爽，楊玉瑩，孟靜巖*

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接研究丹參-赤芍藥對治療結(jié)直腸癌的作用機(jī)制

王方園1，王 棟1，孔憲斌2，時(shí)浩洋1，趙 爽1，楊玉瑩1，孟靜巖2*

1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，天津 301600 2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 301600

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探究丹參-赤芍藥對治療結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）的作用機(jī)制，并進(jìn)一步運(yùn)用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出丹參-赤芍藥對活性成分及其對應(yīng)的靶點(diǎn)，通過檢索GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索獲得CRC相關(guān)靶點(diǎn)，將丹參-赤芍活性成分靶點(diǎn)與CRC靶點(diǎn)取交集，采用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用R語言進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析；選取關(guān)鍵靶點(diǎn)及核心活性成分，使用AutoDock軟件進(jìn)行分子對接。通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，分別采用MTT及劃痕實(shí)驗(yàn)檢測丹參-赤芍藥對對HCT116細(xì)胞增殖及遷移能力的影響，采用qRT-PCR及Western blotting檢測丹參-赤芍藥對對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)核心靶點(diǎn)表達(dá)的影響。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測顯示，丹參-赤芍藥對活性成分206個(gè)，共有352個(gè)對應(yīng)的靶基因，CRC疾病相關(guān)靶點(diǎn)9143個(gè)，得到交集靶點(diǎn)283個(gè)。通過PPI網(wǎng)絡(luò)篩選得到丹參-赤芍藥對治療CRC的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)3個(gè)：雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）、黏著連接蛋白β1（catenin β1，CTNNB1）和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1（retinoblastoma 1，RB1）。GO功能和KEGG通路分析顯示，關(guān)鍵靶點(diǎn)涉及磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、p53信號通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）、細(xì)胞凋亡等。分子對接結(jié)果顯示關(guān)鍵靶點(diǎn)與重要活性成分結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定，篩選出丹參-赤芍藥對治療CRC的核心活性成分主要是黃芩苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等。MTT及劃痕實(shí)驗(yàn)表明，丹參-赤芍藥對對HCT116細(xì)胞增殖和遷移能力具有明顯的抑制作用（＜0.05、0.01）；丹參-赤芍藥對顯著抑制和mRNA表達(dá)水平（＜0.05、0.01），顯著上調(diào)mRNA表達(dá)水平（＜0.05）；顯著下調(diào)ESR1、β-catenin、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）和聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01），顯著上調(diào)RB1蛋白表達(dá)水平（＜0.05、0.01）。丹參-赤芍藥對可能作用于ESR1、CTNNB1和RB1等靶點(diǎn)，通過PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路等相關(guān)通路，從而抑制CRC細(xì)胞的增殖和遷移能力。

丹參-赤芍藥對；結(jié)直腸癌；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；雌激素受體1；黏著連接蛋白β1；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，在最新統(tǒng)計(jì)的全球癌癥發(fā)病率和死亡率排名中均位居前列[1]，其高發(fā)病率和高死亡率嚴(yán)重威脅人們的生命健康。CRC的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制復(fù)雜，其中涉及多種腫瘤相關(guān)基因及腫瘤相關(guān)信號通路的改變。

近年來，中藥以其多途徑、多靶點(diǎn)的優(yōu)勢，在輔助治療CRC方面取得了良好的療效。丹參-赤芍是臨床上抑制惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展常用的活血化瘀藥對，其中，丹參是唇形科植物丹參Bge.的干燥根和根莖，《本草綱目》草部中記載其味苦，性微寒，無毒，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀生新、活血止痛的功效[2]。赤芍是為毛茛科植物芍藥Pall.或川赤芍Lynch的干燥根，味苦，性微寒，歸肝經(jīng)，具有清熱涼血、活血祛瘀的功效[3]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)篩選丹參-赤芍藥對治療CRC的相關(guān)靶點(diǎn)和通路，并將篩選后的活性成分與靶蛋白進(jìn)行分子對接，探討丹參-赤芍藥對是否能夠多靶點(diǎn)、多途徑抑制CRC的發(fā)生發(fā)展，并運(yùn)用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期為中醫(yī)藥防治CRC提供新思路。

1 材料

1.1 細(xì)胞

結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞購自ATCC細(xì)胞庫。

1.2 藥材

丹參（批號20190513）、赤芍（批號20190411）均購自北京同仁堂股份有限公司，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)孟靜巖教授鑒定分別為唇形科植物丹參Bge.的干燥根和根莖、毛茛科植物芍藥Pall.的干燥根。

根據(jù)孟靜巖教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)，丹參-赤芍藥對以1∶1配伍制成凍干粉，將凍干粉溶解于無血清培養(yǎng)基，配制成2 mg/mL的溶液（以生藥量計(jì)），通過0.22 μm濾器滅菌，將滅菌后的藥液保存在?20 ℃?zhèn)溆?。本課題組前期利用UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)對丹參-赤芍活性成分進(jìn)行鑒定[4]，篩選出18種丹參獨(dú)有成分及11種赤芍的獨(dú)有成分，如丹參素、苯甲酰芍藥苷、芍藥苷等。

1.3 藥品與試劑

MTT（批號M8180）、高效RIPA裂解液（批號R0010）、PMSF（批號P0100)、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物（批號P1261）購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞/組織總RNA提取試劑盒（批號19221ES50）、Hifair Ⅲ 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（批號11141ES60）、Hieff UNICON Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（批號11184ES08）購自上海翊圣生物科技有限公司；雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）抗體（批號WL00940）、β-catenin（批號WL0962a）、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1（retinoblastoma 1，RB1）抗體（批號WL02216）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（cystein-asparate protease-3，Caspase-3）抗體（批號WL04004）、聚腺苷酸二磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）抗體（批號WL01932）購自沈陽萬類生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔單克隆抗體（批號AS014）、β-actin抗體（批號AC026）購自愛博泰克生物技術(shù)公司。

1.4 儀器

311型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、MK3型多功能讀板機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；5418型冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；E200型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 丹參-赤芍藥對活性成分及靶點(diǎn)篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索丹參、赤芍的化學(xué)成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件篩選化學(xué)成分及對應(yīng)蛋白靶點(diǎn)，并通過參考文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充[5]。使用UniProt（https://uniprot.org/）校正化學(xué)成分靶點(diǎn)基因名稱，使蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息標(biāo)準(zhǔn)化[6]。

2.1.2 CRC相關(guān)基因查找及藥物-疾病交集基因獲取 通過GeneCards（http://www.genecards.org/）、OMIM（http://omim.org/）、PharmGkb（http:// www.pharmgkb.org/）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd）、及DrugBank（https://go.drugbank.com/）數(shù)據(jù)庫，以“colorectal cancer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行疾病相關(guān)基因查找。將各數(shù)據(jù)庫得到的疾病相關(guān)基因進(jìn)行并集并刪除重復(fù)基因，使用PERL軟件繪制Venn圖，對藥物預(yù)測潛在靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，即獲得丹參-赤芍藥對治療CRC的潛在靶點(diǎn)。

2.1.3 中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將丹參-赤芍的主要活性成分與潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件中，繪制“中藥-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。將交集靶點(diǎn)輸入到STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），物種設(shè)置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為最高置信度“highest confidence（0.9）”，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，再運(yùn)用Cytoscape 3.8.2軟件將PPI網(wǎng)絡(luò)做可視化處理。使用插件CytoNCA提取網(wǎng)絡(luò)中得分較高的節(jié)點(diǎn)，以介數(shù)和自由度的中位數(shù)作為截點(diǎn)，將截點(diǎn)之上的靶點(diǎn)視為關(guān)鍵靶點(diǎn)，并進(jìn)行后續(xù)研究。

2.1.4 基因本體（gene ontology，GO）功能及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 應(yīng)用R軟件中Bioconductor模塊軟件包“org.Hs.eg.db”運(yùn)行完entrez ID轉(zhuǎn)換。采用R軟件中的“colorspace”“stringi”“ggplot2”和“DOSE”“clusterProfiler”“enrichplot”模塊對關(guān)鍵靶基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，過濾條件為＞0.05，輸出氣泡圖，分析富集結(jié)果。運(yùn)行“pathview”模塊繪制通路圖[7]。

2.1.5 潛在活性成分與核心靶蛋白的分子對接 將藥物活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，首先通過PubChem數(shù)據(jù)庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/）獲得化合物的3D結(jié)構(gòu)，并利用Open Babel 2.3.2軟件將獲得的SDF文件轉(zhuǎn)化為PDB格式。從PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb）獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)PDB格式，分子圖形系統(tǒng)PyMOL 2.5.1去除水分子和小分子配體。靶蛋白與化合物均使用AutoDockTools 1.5.6轉(zhuǎn)化為PDBQT格式。利用AutoDock Vina 1.1.2軟件Discovery Studio（DS，V2016）進(jìn)行對接，對結(jié)果進(jìn)行分析處理，分子對接構(gòu)象的結(jié)合能越低，則結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，反映受體分子與配體之間結(jié)合的可能性越大。故對接結(jié)果只保留每對分子對接的結(jié)合能絕對值最高者。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.2.1 MTT實(shí)驗(yàn) 收集處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，以5×105/mL接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁后加入不同質(zhì)量濃度（125、250、500、1000、2000 μg/mL）的丹參-赤芍溶液，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔（不接種細(xì)胞不含藥物）和對照孔（接種細(xì)胞不含藥物），置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），輕晃混勻，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h后，棄去上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，輕晃混勻，采用酶標(biāo)儀測定490 nm處的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。

細(xì)胞抑制率＝[(對照－調(diào)零)－(給藥－調(diào)零)]/(對照－調(diào)零)

2.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn) 將處于對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞以1×106/mL接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用10 μL的槍頭在孔內(nèi)劃線，用PBS緩沖液沿孔壁輕輕沖洗孔底2次，吸凈細(xì)胞殘?jiān)?，每孔加? mL不同質(zhì)量濃度（100、200、400 μg/mL）的丹參-赤芍溶液后，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。培養(yǎng)0、48 h后，于倒置顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J軟件計(jì)算劃痕面積。

2.2.3 qRT-PCR檢測、黏著連接蛋白β1（catenin beta 1，）和mRNA表達(dá) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

基因引物(5’-3’) ESR1F: CGCCTCTAACCTCGGGCTG R: AGTAGGGCCATCCCAGATGC CTNNB1F: CTGAGGAGCAGCTTCAGTCC R: GGCCATGTCCAACTCCATCA RB1F: GACTTCTACTCGAACACGAATGC R: GTGTCCACCAAGGTCCTGAG β-actinF: AGCGAGCATCCCCCAAAGTT R: GGGCACGAAGGCTCATCATT

2.2.4 Western blotting檢測ESR1、β-catenin、RB1、Caspase-3和PARP蛋白表達(dá) 按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，收集各組細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液，于冰上裂解，提取細(xì)胞總蛋白，于100 ℃水中加熱5～10 min使蛋白變性。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，封閉2 h，分別加入相應(yīng)一抗（1∶1000），室溫孵育1 h，4 ℃過夜孵育；洗膜后，加入二抗（1∶8000），室溫孵育1 h；洗膜后加入ECL發(fā)光液顯色，放置于凝膠成像系統(tǒng)運(yùn)行程序顯影成像，應(yīng)用Image J軟件分析條帶的灰度值。

3 結(jié)果

3.1 丹參-赤芍藥對活性成分及靶點(diǎn)的篩選

通過在TCMSP數(shù)據(jù)庫中查找到丹參-赤芍的活性成分并按照篩選條件進(jìn)行篩選，得到活性成分206個(gè)，藥物作用靶基因352個(gè)。

3.2 CRC相關(guān)靶點(diǎn)篩選和藥物-疾病交集靶點(diǎn)獲取

將GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD、DurgBank數(shù)據(jù)庫檢索的CRC相關(guān)靶點(diǎn)結(jié)果合并，去除重復(fù)數(shù)據(jù)，篩選得到CRC相關(guān)靶點(diǎn)9143個(gè)，見圖1。將丹參-赤芍藥對的潛在靶點(diǎn)與CRC相關(guān)靶點(diǎn)取交集映射，利用Perl軟件繪制韋恩圖，共得到283個(gè)交集靶點(diǎn)，見圖2。

圖1 CRC相關(guān)靶點(diǎn)

圖2 丹參-赤芍藥對與CRC靶點(diǎn)的Venn圖

3.3 “中藥-活性成分-潛在治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析

將篩選后的丹參-赤芍活性成分、交集靶點(diǎn)以及中藥信息導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行可視化分析，獲得“中藥-活性成分-潛在治療靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3。

3.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將藥物與疾病共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，得到PPI網(wǎng)絡(luò)（圖4），共有131個(gè)節(jié)點(diǎn)、520條邊。使用插件CytoNCA提取網(wǎng)絡(luò)中得分較高的節(jié)點(diǎn)，以介數(shù)和自由度的中位數(shù)作為截點(diǎn)，根據(jù)條件選擇排名前11的靶點(diǎn)為ESR1、CTNNB1、RB1、特化蛋白1（specialized protein 1，SP1）、原癌基因SRC、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun-terminal kinase，JUN）、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF1A）、周期依賴性激酶抑制劑1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）、細(xì)胞周期素D1（cyclin D1，CCND1），取排名前3的靶點(diǎn)即ESR1、CTNNB1、RB1作為關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖5），進(jìn)行后續(xù)研究。

藍(lán)色圓形代表丹參活性成分，紅色圓形代表赤芍活性成分，藍(lán)色方形代表潛在治療靶點(diǎn)

圓形節(jié)點(diǎn)表示每個(gè)基因?qū)?yīng)的蛋白，節(jié)點(diǎn)間連接的直線表示2個(gè)蛋白有相互作用，線越粗表示作用關(guān)系越強(qiáng)

3.5 GO功能富集分析

根據(jù)R語言程序設(shè)定條件進(jìn)行GO功能富集分析，富集結(jié)果按照值從小到大排序，選取前10條GO條目輸出氣泡圖。如圖6所示，丹參-赤芍藥對主要影響藥物反應(yīng)、氧化應(yīng)激響應(yīng)等生物過程（biological process，BP），影響膜筏、膜微域等細(xì)胞組分（cellular components，CC），參與酰胺結(jié)合、肽結(jié)合等分子功能（molecular function，MF）。

圖5 排名前11的靶點(diǎn)

圖6 共同靶點(diǎn)GO功能富集分析

3.6 KEGG通路富集分析

分析藥物與疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，根據(jù)值進(jìn)行排序，得到丹參-赤芍藥對治療CRC的相關(guān)通路30條，見圖7。通過分析氣泡圖結(jié)果并結(jié)合腫瘤相關(guān)通路研究可知，丹參-赤芍藥對治療CRC的潛在靶點(diǎn)主要集中在磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、細(xì)胞凋亡等信號通路上。

3.7 丹參-赤芍活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的對接

根據(jù)PPI分析結(jié)果，選取度值排名前3的靶基因（ESR1、CTNNB1和RB1）所編碼的靶蛋白（ESR1、β-catenin和RB1）與丹參-赤芍藥對的活性成分進(jìn)行分子對接，結(jié)果顯示，丹參-赤芍藥對中活性成分黃芩苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、木犀草素、芍藥苷、二沒食子酸、異歐前胡素、異隱丹參酮、淚柏醇、鞣花酸等與關(guān)鍵靶點(diǎn)對接穩(wěn)定（表2）。對結(jié)果進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，芍藥內(nèi)酯苷與ESR1結(jié)合能力較強(qiáng)，分別在LEU346、GLU353、ARG394形成H鍵，結(jié)合能為?67.481 kJ/mol；苯甲酰芍藥苷與β-catenin結(jié)合能力較強(qiáng)，分別在SER448、ARG474形成H鍵，結(jié)合能為?37.983 9 kJ/mol；苯甲酰芍藥苷與RB1結(jié)合能力較強(qiáng)，分別在LYS765、TYR756形成H鍵，結(jié)合能為?36.384 6 kJ/mol（圖8）。

圖7 共同靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

表2 活性成分與ESR1、β-catenin和RB1的對接結(jié)合能

Table 2 Docking binding energy of active ingredients with ESR1, β-catenin and RB1

化合物CAS號化學(xué)式結(jié)合能/(kJ·mol?1) ESR1β-cateninRB1 黃芩苷21967-41-9C21H18O11?59.839 7?36.287 8?31.935 1 芍藥內(nèi)酯苷39011-90-0C23H28O11?67.481 0?35.980 9?27.285 5 苯甲酰芍藥苷38642-49-8C30H32O12?43.502 0?37.983 9?36.384 6 木犀草素491-70-3C15H10O6?43.917 8?31.121 4?28.384 9 芍藥苷23180-57-6C23H28O11?57.785 0?36.094 9?34.370 7 二沒食子酸536-08-3C14H10O9?41.632 7?30.167 2?30.135 8 異歐前胡素482-45-1C16H14O4?40.261 3?26.367 9?24.423 8 異隱丹參酮22550-15-8C19H20O3?38.606 6?30.239 8?20.804 0 淚柏醇596-85-0C20H34O?38.050 1?29.017 5?24.494 1 鞣花酸476-66-4C14H6O8?41.694 3?28.035 6?20.353 2

A-芍藥內(nèi)酯苷與ESR1對接；B-甲苯酰芍藥苷與β-catenin對接；C-甲苯酰芍藥苷與RB1對接

3.8 丹參-赤芍藥對抑制HCT116細(xì)胞增殖

如表3所示，不同質(zhì)量濃度的丹參-赤芍對HCT116細(xì)胞均有一定的抑制作用，且呈劑量相關(guān)性。運(yùn)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算出藥物作用于HCT116細(xì)胞48 h的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為459.303 μg/mL。根據(jù)IC50值和本課題組前期實(shí)驗(yàn)，給藥質(zhì)量濃度選擇在459.303 μg/mL以下。選擇100、200、400 μg/mL的丹參-赤芍進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.9 丹參-赤芍藥對抑制HCT116細(xì)胞遷移

如圖9所示，與對照組比較，各給藥組細(xì)胞遷移率顯著降低（＜0.05、0.01），其中丹參-赤芍高劑量組作用最佳。

表3 丹參-赤芍藥對對HCT116細(xì)胞活力的影響(, n= 3)

與對照組比較：**＜0.01

**< 0.01control group

與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.10 丹參-赤芍藥對對HCT116細(xì)胞ESR1、CTNNB1和RB1 mRNA表達(dá)的影響

如圖10所示，與對照組比較，丹參-赤芍藥對各劑量組mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01），丹參-赤芍藥對高劑量組mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），丹參-赤芍藥對中、高劑量組mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。

3.11 丹參-赤芍藥對對HCT116細(xì)胞ESR1、β-catenin和RB1蛋白表達(dá)的影響

如圖11所示，與對照組比較，丹參-赤芍藥對各劑量組ESR1和β-catenin蛋白表達(dá)水平均顯著降低，RB1蛋白表達(dá)水平明顯升高（＜0.05、0.01）。

圖10 丹參-赤芍藥對對HCT116細(xì)胞ESR1、CTNNB1和RB1 mRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

3.12 丹參-赤芍藥對HCT116細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

如圖12所示，與對照組比較，丹參-赤芍藥對高劑量組Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），丹參-赤芍藥對中、高劑量組PARP蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖11 丹參-赤芍藥對對HCT116細(xì)胞ESR1、β-catenin和RB1蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

圖12 丹參-赤芍藥對對HCT116細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響(,n = 3)

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為CRC病位在大腸，與脾胃密切相關(guān)?！鹅`樞·百病始生》提到：“腸胃之絡(luò)傷，則血溢于腸外，腸外有寒，汁沫與血相摶，則并合凝聚不得散，而積成矣。”患者多因脾失健運(yùn)，血行不暢，日久致瘀，瘀血搏結(jié)腸道，損傷腸絡(luò)，日久成癰而致癌腫，常見腹痛拒按、舌質(zhì)紫暗或有瘀斑、脈澀等臨床表現(xiàn)，故臨床治療CRC多加入丹參、赤芍等活血類中藥[8]。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，深入挖掘丹參-赤芍治療CRC的有效成分、潛在靶點(diǎn)和作用機(jī)制。共篩選到丹參-赤芍藥對的活性成分206個(gè)，丹參-赤芍藥對治療CRC的潛在靶點(diǎn)283個(gè)，并通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選出ESR1、CTNNB1及RB1為關(guān)鍵核心靶點(diǎn)。其中，ESR1是CRC發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中最重要的調(diào)節(jié)基因，是誘導(dǎo)CRC的潛在機(jī)制[9]。一項(xiàng)基于GSCA的遺傳改變分析表明，基因的突變可能是誘發(fā)CRC致癌的潛在機(jī)制，并且與生物學(xué)進(jìn)展與免疫反應(yīng)有關(guān)[10]。CTNNB1基因編碼蛋白β-catenin是Wnt信號傳導(dǎo)的關(guān)鍵組成部分，在CRC進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用[11-12]。β-catenin在正常結(jié)直腸上皮組織中定位于細(xì)胞膜，而在癌變過程中β-catenin從細(xì)胞膜游離，在CRC癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。其在CRC癌組織中異常高表達(dá)與腫瘤的分化、侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[13]。研究顯示，槲皮素、木犀草素、芹菜素等中藥單體通過Wnt/β-catenin通路對CRC的不同階段（包括癌前病變、CRC早期和晚期）發(fā)揮抗腫瘤作用[14]。β-catenin可能是CRC患者的臨床預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。RB1是腫瘤抑制基因，RB1表達(dá)水平與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床預(yù)后密切相關(guān)，RB1可以通過限制細(xì)胞周期進(jìn)展從而抑制腫瘤的發(fā)展進(jìn)程[15]。有研究發(fā)現(xiàn)RB1在前列腺癌、乳腺癌、CRC、非小細(xì)胞肺癌等多種惡性腫瘤進(jìn)展過程中失活[15-18]。腫瘤細(xì)胞中的RB1缺失會誘導(dǎo)脂肪酸氧化并激活JNK，激活后的JNK通過刺激IL-6的產(chǎn)生，進(jìn)而促進(jìn)STAT3介導(dǎo)的干細(xì)胞樣行為和惡性進(jìn)展。也有研究分析發(fā)現(xiàn)，RB1是CRC發(fā)生晚期肝轉(zhuǎn)移及腹膜轉(zhuǎn)移的核心基因，并且可能與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞相關(guān)途徑有關(guān)[19]。本研究通過MTT及劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了丹參-赤芍藥對對HCT116細(xì)胞的增殖和遷移能力具有明顯的抑制作用，并且通過qRT-PCR及Western blotting實(shí)驗(yàn)分別在基因和蛋白水平驗(yàn)證了丹參-赤芍藥對對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的核心基因ESR1及CTNNB1（編碼蛋白β-catenin）的表達(dá)具有明顯的抑制作用，對RB1表達(dá)具有明顯的促進(jìn)作用。因此，核心基因ESR1、CTNNB1及RB1有可能在丹參-赤芍藥對抑制CRC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)丹參-赤芍藥對對藥物反應(yīng)、氧化應(yīng)激等BP，膜筏、膜微域等CC，酰胺結(jié)合、肽結(jié)合等MF產(chǎn)生影響，并且KEGG通路富集分析得到丹參-赤芍藥對主要通過PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、細(xì)胞凋亡等信號通路抑制CRC的發(fā)生發(fā)展。其中PI3K/Akt是與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號通路，在調(diào)控CRC細(xì)胞增殖、侵襲、細(xì)胞周期等行為上發(fā)揮重要的作用。研究表明，HER2在CRC癌組織中的高表達(dá)水平與PI3K/Akt通路的激活有關(guān)，PI3K可以驅(qū)動HER2的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞增殖能力[20]。杠柳次苷是一種潛在的抗癌化合物，研究發(fā)現(xiàn)杠柳次苷可以通過靶向PI3K/Akt通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗CRC作用[21]。TNF-α是CRC中常見的促炎細(xì)胞因子，可通過激活JNK信號通路調(diào)節(jié)BaP和PhIP誘導(dǎo)的CRC上皮細(xì)胞DNA損傷。TNF-α誘導(dǎo)的DNA損傷又能被功能性p53抑制[22]。CRC中增強(qiáng)的糖酵解和磷酸戊糖途徑與HIF-1α表達(dá)增加有關(guān)，活性氧（reactive oxygen species，ROS）/ PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信號激活HIF-1α誘導(dǎo)的代謝重編程，從而在CRC治療過程中促進(jìn)機(jī)體對5-氟尿嘧啶產(chǎn)生耐藥性，降低臨床療效[23]。故PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路、細(xì)胞凋亡等信號通路與CRC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

利用分子對接技術(shù)篩選出丹參-赤芍藥對中有效成分黃芩苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、木犀草素、芍藥苷等與關(guān)鍵核心靶點(diǎn)對接能力較強(qiáng)，這與本課題組前期進(jìn)行的UPLC-Q-TOF/MF實(shí)驗(yàn)篩選出的藥物有效成分相一致[4]。其中，黃芩苷介導(dǎo)了多種癌癥相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)[24]，其可以通過上調(diào)孕酮誘導(dǎo)的蛻膜蛋白（decidual protein induced by progesterone，DEPP）和激活Ras/Raf/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MEK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)CRC細(xì)胞的衰老[25]，也可以通過減少c-Myc的表達(dá)來誘導(dǎo)CRC細(xì)胞凋亡并抑制腫瘤生長[26]；芍藥內(nèi)酯苷可通過核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）信號通路抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠發(fā)生炎癥反應(yīng)，抑制結(jié)腸組織氧化反應(yīng)，減輕結(jié)腸組織病變，從而阻斷CRC“炎-癌”轉(zhuǎn)化進(jìn)程[27]；苯甲酰芍藥苷、木犀草素、芍藥苷等也具有很好的抗腫瘤活性作用[28-30]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接技術(shù)及體外實(shí)驗(yàn)證明了丹參-赤芍藥對能夠通過多通路、多靶點(diǎn)在CRC治療中發(fā)揮重要的作用，為丹參-赤芍藥對治療CRC提供了客觀依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism ofet-drug pair in treatment of colorectal cancer based on network pharmacology and molecular docking

WANG Fang-yuan1, WANG Dong1, KONG Xian-bin2, SHI Hao-yang1, ZHAO Shuang1, YANG Yu-ying1,MENG Jing-yan2

1. Graduate School, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301600, China 2. College of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301600, China

To explore the mechanism of Danshen (et)-Chishao () drug pair in treatment of colorectal cancer (CRC), and further verified by icell experiments.Active ingredients ofet-drug pair and corresponding targets were screened out through TCMSP, targets related to CRC were obtained by GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD and DrugBank databases, CRC-related targets were obtained by searching GeneCards, OMIM, PharmGkb, TTD and DrugBank databases. Active ingredients targets ofet-drug pair were intersected with CRC targets, Cytoscape 3.8.2 software was used to construct “drug-active ingredient-disease-target” network, STRING database was used to construct protein-protein interaction (PPI) network, R language was used for gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analysis; Key targets and core active components were selected, and AutoDock software was performed for molecular docking. The results of network pharmacology were verified bycell experiments. MTT and scratch experiments were used to detect the effects ofet-drug pair on proliferation and migration of HCT116 cells. qRT-PCR and Western blotting were used to detect the effect ofet-drug pair on network pharmacology core targets expression.Network pharmacology prediction showed 206 active ingredients ofet-drug pair, with a total of 352 corresponding target and 9143 CRC-related targets, and 283 intersecting targets were obtained. Three key therapeutic targets ofet-drug pair in treatment of CRC were identified by PPI network screening: estrogen receptor 1 (ESR1), catenin β1 (CTNNB1) and retinoblastoma 1 (RB1). GO function and KEGG pathway analysis showed that key targets involved phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)-protein kinase B (Akt) signaling pathway, tumor necrosis factor (TNF) signaling pathway, p53 signaling pathway, hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1), apoptosis, etc. Molecular docking results showed that key targets and important active components were bound in a stable conformation. The core active components ofet-drug pair in treatment of CRC were mainly baicalin, paeoniflorin and benzoylpaeoniflorin. MTT and scratch experiments showed thatet-drug pair significantly inhibited the proliferation and migration of HCT116 cells (< 0.05, 0.01), significantly inhibited mRNA expression levels ofand(< 0.05, 0.01), up-regulatedmRNA expression level (< 0.05), down-regulated ESR1, β-catenin, cysteine-aspartate protease-3 (Caspase-3) and poly-ADP-ribose polymerase (PARP) protein expressions (< 0.05, 0.01), up-regulated RB1 protein expression level (< 0.05, 0.01).et-drug pair may act on ESR1, CTNNB, RB1 and other targets, and inhibit the proliferation and migration of CRC cells through PI3K-Akt signaling pathway, TNF signaling pathway, p53 signaling pathway, HIF-1 signaling pathway and other related pathways, thereby inhibiting the proliferation and migration ability of CRC cells.

et-drug pair; colorectal cancer; network pharmacology; molecular docking; experimental verification; estrogen receptor 1; catenin β1; retinoblastoma 1

R285.5

A

0253 - 2670(2022)18 - 5731 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.016

2022-07-21

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81973728）；天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（18JCZDJC36600）

王方園，在讀博士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥抗腫瘤的基礎(chǔ)研究。E-mail: 18132398088@163.com

孟靜巖，博士生導(dǎo)師，教授，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥抗腫瘤的基礎(chǔ)研究。E-mail: mengjy@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]