曹天佑，屈會化，董利洋，程國良，姚景春，孫成宏，趙 琰*，張貴民*

荊防顆粒對馬兜鈴酸I致小鼠急性腎損傷的預防和保護作用研究

曹天佑1，屈會化2，董利洋3，程國良3，姚景春4，孫成宏4，趙 琰3*，張貴民4*

1. 北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029 2. 北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，北京 100029 3. 北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京 100029 4. 魯南制藥集團股份有限公司，中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276000

研究荊防顆粒對馬兜鈴酸I致小鼠急性腎損傷的預防和保護作用。雄性C57BL/6J小鼠隨機分為對照組、模型組和荊防顆粒低、中、高劑量（4、8、16 g/kg）組，各給藥組連續(xù)7 d ig相應藥物，第5天給藥2 h后，除對照組外，其余各組ip馬兜鈴酸I（10 mg/kg），連續(xù)3 d，建立急性腎損傷模型。末次給藥后，檢測血清中肌酐（creatinine，CRE）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平；蘇木素-伊紅（HE）染色檢測腎組織病理變化；采用TUNEL染色觀察小鼠腎組織細胞凋亡情況；檢測小鼠腎組織中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用ELISA檢測小鼠腎組織中單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6水平；采用Western blotting檢測腎組織蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、雙微體擴增基因2（murine double minute 2，MDm2）、p53、B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）蛋白表達。與對照組比較，模型組小鼠血清BUN和CRE水平顯著升高（＜0.01），腎臟出現(xiàn)明顯病理損傷；腎組織MCP-1、TNF-α、IL-1β、IL-6和MDA水平顯著升高（＜0.01），SOD活性及GSH水平顯著降低（＜0.01），提示腎臟細胞出現(xiàn)氧化應激損傷；腎組織中細胞凋亡數(shù)量明顯增多（＜0.01），促凋亡因子p53、Bax蛋白表達水平明顯升高（＜0.01），Akt、MDm2和Bcl-2蛋白表達受到抑制（＜0.01）。與模型組比較，荊防顆粒組能夠明顯改善小鼠腎組織病理損傷，降低血清中炎癥因子水平，調(diào)節(jié)氧化應激，上調(diào)腎組織Akt、MDm2和抗凋亡蛋白Bcl-2表達，抑制腎組織p53和Bax的表達，減少腎組織細胞凋亡（＜0.01）。荊防顆粒可以通過抗氧化應激和炎癥來減輕馬兜鈴酸造成的急性腎損傷，其作用機制可能與調(diào)控Akt/MDm2/ p53通路、抑制細胞凋亡有關。

荊防顆粒；馬兜鈴酸；急性腎損傷；炎癥反應；氧化應激；細胞凋亡；蛋白激酶B/雙微體擴增基因2/p53通路

馬兜鈴酸腎病（aristolochic acid nephropathy，AAN）是由馬兜鈴酸引起的快速進行性腎小管間質性腎炎[1]。短期攝入高劑量的馬兜鈴酸I可直接損傷近端腎小管上皮細胞，誘導腎組織炎癥反應，導致變性、壞死、凋亡，最終發(fā)展為終末期腎病[2]。雖然國家限制使用含有馬兜鈴酸的藥物或產(chǎn)品，但仍有新發(fā)的AAN病例不斷出現(xiàn)。目前臨床上，仍沒有有效的藥物可以逆轉馬兜鈴酸I引起的腎損傷。

中醫(yī)將AAN歸為“關格”“虛勞”等范疇，濕濁證和血瘀證貫穿其始終，是導致病變進行性惡化的主要因素[3]。荊防顆粒[4]是以古方荊防敗毒散為處方的現(xiàn)代中成藥，其中荊芥、防風、羌活、獨活、前胡為祛風勝濕藥，可疏風于外、勝濕于內(nèi)，可祛除腎臟代謝廢物；枳殼、川芎可行氣活血，改善腎臟微循環(huán)；茯苓利濕化濁，甘草補益正氣，二者相伍可扶正祛邪，故荊防顆粒不單只用于治療外感疾病，還可用于治療內(nèi)科腎病。對于荊防顆粒用于防治AAN的研究尚未有報道，本研究采用馬兜鈴酸I建立小鼠AAN模型，探究荊防顆粒對馬兜鈴酸I引起急性腎損傷的保護作用及其初步機制，為臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級C57BL/6J雄性小鼠40只，7～8周齡，體質量為20～23 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，合格證號SYXK（京）2020-0033。實驗期間動物均飼養(yǎng)于同一環(huán)境下，保持室溫（25±1）℃，空氣濕度55%～65%，12 h光暗循環(huán)，自由進食飲水，適應性喂養(yǎng)3 d后進行實驗。本實驗相關動物實驗遵循北京中醫(yī)藥大學有關實驗動物管理和使用的規(guī)定（動物實驗倫理批準號為BUCM-4-2021-092202-3084）。

1.2 藥品與試劑

荊防顆粒（批號80022202002）由魯南制藥集團股份有限公司提供；馬兜鈴酸I（質量分數(shù)＞98%，批號A800933）購自北京虹湖聯(lián)合化工產(chǎn)品有限公司；單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）檢測試劑盒（批號SEA087Mu）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒（批號SEA133Mu）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）檢測試劑盒（批號SEA563Mu）、IL-6檢測試劑盒（批號SEA079Mu）均購自武漢云克隆科技股份有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號A001-3-2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號A003-1-2）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（批號A006-2-1）均購自南京建成生物工程研究所；DAPI（批號G1012）、抗熒光淬滅封片劑（批號G1401）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；TUNEL試劑盒（批號11684817910）購自美國Roche公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號P0010）購自碧云天生物技術研究所；兔多抗B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2，批號Ab59348）、兔單抗Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax，批號Ab32503）購自英國Abcam公司；兔多抗p53（批號bs1277）購自南京Bioworld公司；兔多抗雙微體擴增基因2（murine double minute 2，MDm2，批號bs1277）購自武漢三鷹生物技術有限公司；兔單抗磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-Akt，批號4060）購自美國CST公司；小鼠單抗β-actin（批號BM0627）購自武漢博士德生物工程有限公司；HRP標記羊抗小鼠二抗（批號BA1051）和HRP標記羊抗兔二抗（批號BA1054）均購自武漢博士德生物工程有限公司；蒸餾水購自北京拜爾迪生物技術有限公司；去離子水由北京中醫(yī)藥大學科研樓提供。

1.3 儀器

AU-480型全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）；mμlISKANMK3型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；DYCZ-24DN型垂直電泳槽（北京六一儀器廠）；ECLIPSE C1型正置熒光顯微鏡、DS-U3型成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 分組、造模及給藥

C57BL/6J小鼠隨機分為對照組、模型組和荊防顆粒高、中、低劑量（16、8、4 g/kg）組，每組8只。各給藥組ig相應藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig生理鹽水，1次/d，持續(xù)7 d。第5天給藥2 h后，除對照組外，其余各組ip馬兜鈴酸I（10 mg/kg），連續(xù)3 d，建立急性腎損傷模型。末次給藥后，小鼠禁食12 h，自由飲水。

2.2 腎功能檢測

小鼠摘眼球取血，靜置4 h，3500 r/min離心10 min，收集上層血清，采用全自動生化分析儀檢測肌酐（creatinine，CRE）和血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）含量。

2.3 炎癥因子和氧化應激指標檢測

小鼠處死后立即取下腎臟，剝?nèi)ツI膜，將小鼠右腎在生理鹽水中沖洗，用濾紙將水分吸干，加入磷酸鹽緩沖液制成10%的組織勻漿液，4000 r/min離心10 min，取上清液，按照試劑盒說明書測定MCP-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、MDA、GSH水平及SOD活性。

2.4 腎組織病理學觀察

將小鼠左腎固定于4%多聚甲醛溶液中，經(jīng)梯度乙醇洗脫后，石蠟包埋，以4 μm厚度制作切片，進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學顯微鏡下觀察各組小鼠腎組織的病理變化。

2.5 TUNEL法檢測腎組織細胞凋亡

取各組小鼠腎組織石蠟切片，用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，蒸餾水漂洗再水化，加入蛋白酶K及TUNEL反應混合液，于37 ℃孵育2 h，用DAPI復染細胞核，用熒光顯微鏡采集圖像并拍照。每張幻燈片隨機5個視場計數(shù)所選區(qū)域TUNEL染色的凋亡細胞的數(shù)目。

2.6 Western blotting檢測p-Akt、MDm2、p53、Bax和Bcl-2蛋白表達

取各組小鼠腎組織，加入含有磷酸酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解液，提取總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，于5% BSA中封閉，加入相應一抗，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌后，加入二抗，于37 ℃孵育120 min，TBST洗滌3次后，加入ECL發(fā)光試劑顯色，使用Image J軟件分析條帶的灰度值。

2.7 統(tǒng)計學處理

采用SPASS 25.0軟件對數(shù)據(jù)結果進行統(tǒng)計并分析，數(shù)據(jù)結果以表示，多組間差異通過單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計學分析。

3 結果

3.1 荊防顆粒對AAN小鼠腎功能的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中BUN和CRE水平均明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中BUN和CRE水平均明顯降低（＜0.01）。說明荊防顆粒能夠有效緩解馬兜鈴酸I致小鼠的急性腎損傷。

表1 荊防顆粒對AAN小鼠血清中BUN和CRE水平的影響(, n = 6)

Table 1 Effect of Jingfang Granules on BUN and CRE levels in serum of AAN mice(, n = 6)

組別劑量/(g·kg?1)BUN/(mmol·L?1)CRE/(μmol·L?1) 對照—8.22±1.317.90±1.10 模型—41.87±3.43##141.33±12.18## 荊防顆粒1629.12±1.92**101.72±5.66** 834.70±1.97**103.98±2.94** 430.32±2.79**104.63±3.36**

與對照組比較：##＜0.01；與模型組比較：**＜0.01，下表同

##< 0.01control group;**< 0.01model group, same as below tables

3.2 荊防顆粒對AAN小鼠腎組織病理變化的影響

如圖1所示，對照組小鼠腎組織未見病理變化；模型組小鼠腎組織受損較嚴重，出現(xiàn)腎小管擴張或萎縮，部分腎小管上皮細胞脫落、變性壞死，腎間質有炎性細胞浸潤、充血水腫，腎小球未出現(xiàn)明顯病變；荊防顆粒高劑量組小鼠腎小管擴張、間質擴張水腫明顯減輕，炎性細胞浸潤明顯減少，荊防顆粒中、低劑量組上述病理變化均有一定程度減輕。

3.3 荊防顆粒對AAN小鼠腎組織炎癥因子指標的影響

如表2所示，與對照組比較，模型組小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α、IL-6及IL-1β水平均明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α、IL-6及IL-1β水平均顯著降低（＜0.01）。

3.4 荊防顆粒對AAN小鼠腎組織氧化應激指標的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組小鼠腎組織中MDA水平明顯升高（＜0.01），SOD活性和GSH水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠腎組織中MDA水平顯著降低（＜0.01），SOD活性及GSH水平顯著升高（＜0.01）。

3.5 荊防顆粒AAN小鼠腎組織細胞凋亡的影響

如圖2所示，細胞核經(jīng)過DAPI復染后在紫外的激發(fā)下為藍色，陽性凋亡細胞核為綠色。如表4所示，與對照組比較，模型組凋亡的腎小管上皮細胞數(shù)目明顯增多（＜0.01）；與模型組比較，荊防顆粒各劑量組凋亡的陽性細胞數(shù)目明顯減少（＜0.01），且呈劑量相關性。

圖1 荊防顆粒對AAN小鼠腎組織病理變化的影響

表2 荊防顆粒對AAN小鼠腎組織中MCP-1、TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響(, n = 8)

Table 2 Effect of Jingfang Granules on MCP-1, TNF-α, IL-6 and IL-1β levels in kidney tissues of AAN mice (, n = 8)

組別劑量/(g·kg?1)MCP-1/(ng·mL?1)TNF-α/(ng·mL?1)IL-6/(ng·mL?1)IL-1β/(ng·mL?1) 對照—34.27±2.3114.81±0.833.64±0.288.73±1.19 模型—53.38±3.08##21.15±0.61##12.74±1.14##16.71±1.49## 荊防顆粒1638.47±3.02**16.07±1.00**7.84±0.50**10.13±1.12** 840.02±0.88**17.44±0.68**8.41±0.67**10.57±0.95** 440.60±2.87**17.95±1.34**8.69±0.52**11.38±1.38**

表3 荊防顆粒對AAN小鼠腎組織中SOD活性和MDA、GSH水平的影響(, n = 8)

Table 3 Effect of Jingfang Granules on SOD activity, MDA and GSH levels in kidney tissues of AAN mice(, n = 8)

組別劑量/(g·kg?1)SOD/(U·mg?1)MDA/(mmol·mg?1)GSH/(μmol·g?1) 對照—474.27±26.364.148±0.44811.636±1.331 模型—264.21±33.26##8.657±0.164##6.013±0.599## 荊防顆粒16386.85±36.75**5.661±0.729**10.021±0.847** 8370.48±40.68**5.873±0.627**9.492±1.004** 4345.89±11.18**6.058±0.658**8.367±0.684**

圖2 荊防顆粒對AAN小鼠腎組織細胞凋亡的影響(×200)

表4 荊防顆粒對AAN小鼠腎組織細胞凋亡的影響(, n = 5)

Table 4 Effect of Jingfang Granules on cell apoptosis in kidney tissues of AAN mice(, n = 5)

組別劑量/(g·kg?1)陽性凋亡細胞數(shù)/個 對照—0.00±0.00 模型—135.25±11.80## 荊防顆粒1628.40±3.72** 835.60±4.03** 449.40±3.50**

3.6 荊防顆粒對AAN小鼠腎組織Akt/MDm2/p53通路相關蛋白表達的影響

如圖3和表5所示，與對照組比較，模型組小鼠腎組織中p53、Bax蛋白表達水平顯著升高（＜0.01），p-Akt、MDm2和Bcl-2蛋白表達水平均顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠腎組織中p53、Bax蛋白表達水平顯著降低（＜0.01），p-Akt、MDm2和Bcl-2蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01）。

圖3 荊防顆粒對AAN小鼠腎組織中p-Akt、MDm2、p53、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

表5 荊防顆粒對AAN小鼠腎組織中p-Akt、MDm2、p53、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響(, n = 3)

Table 5 Effect of Jingfang Granules on protein expressions of p-Akt, MDm2, p53, Bax and Bcl-2 in kidney tissues of AAN mice(, n = 3)

組別劑量/(g·kg?1)蛋白相對表達量 p-AktMDm2p53BaxBcl-2 對照—1.16±0.081.17±0.080.18±0.040.31±0.151.16±0.01 模型—0.14±0.01##0.16±0.11##1.12±0.11##1.20±0.03##0.27±0.16## 荊防顆粒160.97±0.11**1.01±0.05**0.55±0.07**0.50±0.08**1.06±0.11** 80.77±0.06**0.81±0.08**0.79±0.12**0.77±0.11**0.88±0.06** 40.52±0.02**0.51±0.07**0.91±0.15**1.02±0.120.59±0.14**

4 討論

馬兜鈴酸是一種硝基菲羧酸的天然化合物，常見于細辛屬、馬兜鈴屬等馬兜鈴科植物中[5]。含馬兜鈴酸的中藥及中成藥廣泛應用于臨床，存在顯著的藥理活性[6]。作為馬兜鈴酸的主要成分之一，馬兜鈴酸I的腎毒性已經(jīng)被廣泛認識，為此許多含馬兜鈴酸I的中草藥被減毒處理、采用其他中藥來替代使用甚至禁用[2,6]。但這些措施仍無法徹底避免AAN發(fā)生，使得中藥安全使用遇到重大阻礙。目前在臨床中，還未建立起應對AAN的長期穩(wěn)定有效的用藥方案，大部分藥物研究仍停留在動物模型實驗階段，如丹參酮I[7]、17β-雌二醇[8]和環(huán)螺旋B肽[9]等。

中醫(yī)認為AAN的主要病機為“濕濁內(nèi)蘊，痰瘀互阻”，故治療以利濕化濁、益氣活血為主。溫病學家趙紹琴教授提出的疏風勝濕法、分消利濕法、益氣培元法對AAN的治療具有重大的指導價值[10-11]。荊防顆粒組方源自《攝生眾妙方》中的荊防敗毒散[12]，古人以治四時外感為主，經(jīng)過歷代醫(yī)家的拓展運用，現(xiàn)今已應用于各科疾病的治療[13-15]。荊防敗毒散治療腎病近年來已有相關報道[16-17]，方中以荊芥、防風相伍為君，以驅散一切外受風邪；羌活、獨活合用可除周身上下之寒濕；柴胡、前胡相配，一升一降，一疏一散，可調(diào)人體內(nèi)外之氣機；桔梗、枳殼相伍，升降相因，宣散有度，可通調(diào)三焦；川芎、茯苓可氣血水同治，川芎行氣活血，茯苓利水滲濕，二者可相伍則氣、血、水通行三焦，周身氣血運行無阻。藥理學實驗證實，方中大部分藥物具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用[18-20]。

本實驗通過連續(xù)3 d ip馬兜鈴酸I（10 mg/kg）成功建立馬兜鈴酸I致小鼠急性腎損傷模型，結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠血清中CRE、BUN水平顯著升高，表明小鼠腎功能出現(xiàn)損傷。同時小鼠腎組織病理切片顯示，模型組小鼠腎組織出現(xiàn)部分腎小管上皮細胞脫落、變性壞死，腎間質有炎性細胞浸潤、充血水腫等病變特征。從基因水平來看，相關研究已經(jīng)證實馬兜鈴酸I所致急性腎損傷可引起、、、、等基因的差異表達[21]。kap為腎臟雄激素調(diào)節(jié)蛋白，可保護腎小管細胞免受毒素的損傷；Spp1是一種細胞外基質趨化因子樣磷酸糖蛋白，與免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生和細胞信號傳導相關；Aldh1a2參與腎臟發(fā)育過程中內(nèi)源性全反式維甲酸的合成，而內(nèi)源性全反式維甲酸與細胞增殖、分化以及凋亡密切相關；Serpine1被發(fā)現(xiàn)與癌癥病變相關；Tnc是一種大分子細胞外基質糖蛋白，參與調(diào)節(jié)細胞的黏附、擴散、遷移和增殖，上述5種差異基因在炎癥信號通路、過氧化反應、糖代謝等途徑中富集明顯。本研究探索了荊防顆粒對馬兜鈴酸I致小鼠腎損傷的藥理作用以及潛在機制，結果發(fā)現(xiàn)模型小鼠經(jīng)過不同劑量的荊防顆粒預給藥后，腎組織破壞程度以及炎性細胞浸潤情況均得到了不同程度的改善。

炎癥反應與AAN發(fā)病機制密切相關[22]。AAN主要引起腎小管上皮細胞的DNA損傷，從而導致炎性細胞浸潤、趨化因子的分泌、細胞周期停滯和細胞凋亡[23]。MCP-1是炎癥反應中重要的趨化因子，對單核/巨噬細胞具有特異性趨化激活作用。同時巨噬細胞能夠分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子，誘導核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）活化和NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥小體相關蛋白表達[24-25]，進而導致炎癥和組織損傷。本研究結果顯示，荊防顆粒各劑量組均能明顯降低大鼠血清中MCP-1、TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，表明荊防顆粒能夠在一定程度上抑制炎癥細胞因子的分泌，從而發(fā)揮減輕急性腎損傷的作用。

多項研究證明，氧化應激是馬兜鈴酸I發(fā)揮細胞毒性的重要機制[26-27]。AAI通過激活絲裂原活化蛋白激酶/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（mitogen activated protein kinase/extracellular regulated protein kinases 1/2，MEK/ERK1/2）信號通路[28]，誘導腎組織細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量增加，破壞機體自由基生成與清除的動態(tài)平衡，造成氧化應激損傷[29]。MDA作為脂質過氧化反應生成的終末產(chǎn)物之一，可破壞細胞膜結構，其水平升高提示氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，可間接反映腎臟組織過氧化程度。SOD和GSH是體內(nèi)重要的抗氧化酶和自由基清除劑，能夠維護細胞穩(wěn)態(tài)，避免氧化損傷。結果顯示，AAI顯著升高腎組織中MDA水平，同時降低SOD活性和GSH水平，表明腎組織脂質過氧化受損嚴重；經(jīng)過各劑量荊防顆粒預給藥后，可顯著提高SOD活性和GSH水平，同時降低MDA水平。表明荊防顆粒能夠提高機體抗氧化能力，清除自由基，減輕AAI導致的腎損傷。

細胞凋亡是馬兜鈴酸I誘導腎小管上皮細胞病理損傷的主要機制[30]，已有多項研究表明激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路對AAN引起的細胞凋亡過程有抑制作用[31-33]。PI3K與表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）結合活化后，使下游靶蛋白Akt磷酸化，從而激活或抑制下游一系列底物，對促進細胞存活、生長、增殖和血管生成中發(fā)揮重要作用[34]。p53是PI3K/Akt下游的重要基因，研究表明馬兜鈴酸I可刺激其過表達誘導細胞周期停滯并促進細胞凋亡[35]。MDm2作為PI3K/Akt通路中的重要一環(huán)，主要負責調(diào)控下游p53蛋白在氧化應激情況下的表達狀況[36]。當細胞DNA受損或暴露于各種代謝應激時，p53蛋白轉錄活性大大增加。此時Akt磷酸化可以促進轉錄因子MDm2的穩(wěn)定化和核轉位，與p53形成復合物，阻斷轉錄作用的功能，從而引發(fā)p53的泛素化和降解[37]。MDm2-p53信號有助于p53功能在細胞應激反應停止后恢復到正常的穩(wěn)態(tài)水平[38]。結果顯示，模型組小鼠腎組織p53以及凋亡相關蛋白Bax表達水平顯著升高，p-Akt、MDm2蛋白表達受到抑制；經(jīng)過荊防顆粒預給藥處理后，可明顯提高p-Akt、MDm2以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，抑制p53表達。TUNEL染色結果也表明荊防顆粒預處理能夠顯著抑制馬兜鈴酸I誘導的小鼠腎組織細胞凋亡。

另一方面，細胞內(nèi)過度產(chǎn)生的ROS能通過破壞DNA、蛋白質、細胞膜或線粒體等細胞成分而引發(fā)細胞凋亡，這主要通過與Bcl-2家族蛋白相關的線粒體途徑實現(xiàn)[39]。Bcl-2和Bax都是p53蛋白的轉錄靶點，在DNA損傷時誘導細胞周期阻滯或凋亡[40]。Bcl-2表達提高有利于增強細胞的抗凋亡功能，而Bax的增加則促進細胞凋亡。Bax/Bcl-2值通常用來表示細胞凋亡水平[41]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組小鼠腎組織促凋亡蛋白（p53、Bax）表達上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)。而荊防顆粒組可顯著促進p-Akt、MDm2蛋白表達來抑制p53，從而改變Bax/Bcl-2值。表明荊防顆粒通過調(diào)節(jié)線粒體凋亡通路和Akt/MDm2/p53信號通路相關蛋白的表達，抑制了馬兜鈴酸I誘導的腎細胞凋亡。

綜上所述，本研究證實荊防顆粒能夠預防和改善馬兜鈴酸I引起的小鼠急性腎損傷，主要通過抑制炎癥反應，降低腎臟中炎癥細胞因子MCP-1、TNF-α、IL-1β和IL-6水平，升高GSH水平和SOD活性，降低MDA水平，激活Akt/MDm2/p53通路改善凋亡相關蛋白的表達，從而發(fā)揮抗氧化、抗凋亡和抗炎作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 陽曉, 吳娟, 余學清. 馬兜鈴酸腎病: 仍需關注的全球性公共衛(wèi)生問題 [J]. 中華腎病研究電子雜志, 2018, 7(1): 4-7.

[2] 鄭浪. 含馬兜鈴酸中藥的研究進展 [J]. 中藥與臨床, 2020, 11(1): 74-80.

[3] 劉忠杰, 林禹舜, 王耀獻, 等. 馬兜鈴酸腎病的中醫(yī)證候與臨床因素相關性研究 [J]. 北京中醫(yī)藥大學學報: 中醫(yī)臨床版, 2013, 20(1): 31-35.

[4] 梁紅寶, 姜宇珺, 袁曉梅, 等. 基于GC-MS和UPLC-Q-Exactive MS技術的荊防顆?；瘜W成分研究[J]. 中草藥, 2022, 53(6): 1697-1708.

[5] 劉靜, 戴忠, 程顯隆, 等. 馬兜鈴酸類成分檢測與分析研究進展[J]. 藥物評價研究, 2019, 42(8): 1644-1650.

[6] 宋亞剛, 苗艷艷, 苗明三. 含馬兜鈴酸中藥毒性分析 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2018, 33(5): 1950-1954.

[7] Feng C C, Xie X F, Wu M J,. Tanshinone I protects mice from aristolochic acid I-induced kidney injury by induction of CYP1A [J]., 2013, 36(3): 850-857.

[8] Shi M, Ma L, Zhou L,. Renal protective effects of 17β-estradiol on mice with acute aristolochic acid nephropathy [J]., 2016, 21(10): E1391.

[9] Zeng Y G, Zheng L, Yang Z R,. Protective effects of cyclic helix B peptide on aristolochic acid induced acute kidney injury [J]., 2017, 94: 1167-1175.

[10] 孫曉光, 彭建中. 趙紹琴慢性腎病辨治理論和經(jīng)驗的傳承發(fā)展 [J]. 世界中西醫(yī)結合雜志, 2015, 10(3): 320-322.

[11] 趙文遠, 方萬紅. 趙紹琴教授倡導慢性腎病新論指導臨床探要 [J]. 中醫(yī)藥學刊, 2004, 22(7): 1168-1171.

[12] 明·張時徹輯, 張樹生點校. 攝生眾妙方 [M]. 北京: 中國中醫(yī)藥出版社, 2015: 194.

[13] 馮芹, 張貴民. 荊防敗毒散治療急性呼吸道感染的臨床應用以及作用機制的探討 [J]. 中藥與臨床, 2020, 11(3): 28-32.

[14] 朱新紅. 荊防敗毒散臨床運用拾零 [J]. 浙江中醫(yī)雜志, 2018, 53(7): 533.

[15] 周寶寬, 周探. 荊防敗毒散治療過敏性皮膚病驗案 [J]. 中國民族民間醫(yī)藥, 2012, 21(1): 36.

[16] 張挺, 陳慧娟, 朱凌凌, 等. 荊防敗毒散對阿霉素腎病大鼠足細胞Nephrin、CD2相關蛋白及ILK通路的影響 [J]. 上海中醫(yī)藥雜志, 2018, 52(5): 71-74.

[17] 金燦明. 荊防敗毒散加減治療腎病蛋白尿 [J]. 浙江中西醫(yī)結合雜志, 2007, 17(7): 458.

[18] 譚朦. 藏荊芥提取物抑制腎小球系膜細胞凋亡與改善糖尿病腎病的作用及其機制研究 [D]. 青島: 青島科技大學, 2021.

[19] 吳浩, 符麗珍, 趙勇, 等. 桔梗皂苷D通過介導PI3K/Akt/mTOR信號通路調(diào)節(jié)氧化應激改善糖尿病腎病模型大鼠腎損傷 [J]. 中國藥理學與毒理學雜志, 2022, 36(3): 170-176.

[20] 蔣欣, 曲青山, 梁韶峰, 等. 川芎素對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的作用及其機制 [J]. 青島大學學報: 醫(yī)學版, 2021, 57(5): 725-730.

[21] 王帆, 王靜, 黃愷, 等. 馬兜鈴酸I致急性腎損傷的分子機制研究 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2022, 34(5): 848-855.

[22] Anger E E, Yu F, Li J. Aristolochic acid-induced nephrotoxicity: Molecular mechanisms and potential protective approaches [J]., 2020, 21(3): 1157.

[23] Bai Y H, Lu H, Hu L P,. Effect ofBUNGE extract on aristolochic acid-induced renal tubular epithelial cell injury [J]., 2014, 124(4): 445-456.

[24] Dai X Y, Huang X R, Zhou L,. Targeting c-fms kinase attenuates chronic aristolochic acid nephropathy in mice [J]., 2016, 7(10): 10841-10856.

[25] Wang S F, Fan J J, Mei X B,. Interleukin-22 attenuated renal tubular injury in aristolochic acid nephropathy via suppressing activation of NLRP3 inflammasome [J]., 2019, 10: 2277.

[26] Kim J Y, Leem J, Jeon E J. Protective effects of melatonin against aristolochic acid-induced nephropathy in mice [J]., 2019, 10(1): 11.

[27] 張良, 楊召聰, 顧亞琴, 等. 馬兜鈴酸I致大鼠腎損傷后血清miRNA差異表達的研究 [J]. 中草藥, 2016, 47(11): 1903-1907.

[28] Yu F Y, Wu T S, Chen T W,. Aristolochic acid I induced oxidative DNA damage associated with glutathione depletion and ERK1/2 activation in human cells [J]., 2011, 25(4): 810-816.

[29] Wu T K, Wei C W, Pan Y R,. Vitamin C attenuates the toxic effect of aristolochic acid on renal tubular cells via decreasing oxidative stress?mediated cell death pathways [J]., 2015, 12(4): 6086-6092.

[30] Kim J W, Jo J, Kim J Y,. Melatonin attenuates cisplatin-induced acute kidney injury through dual suppression of apoptosis and necroptosis [J]., 2019, 8(3): E64.

[31] Yang X, Thorngren D, Chen Q,. Protective role of relaxin in a mouse model of aristolochic acid nephropathy [J]., 2019, 115: 108917.

[32] Xie X C, Zhao N, Xu Q H,. Relaxin attenuates aristolochic acid induced human tubular epithelial cell apoptosisby activation of the PI3K/Akt signaling pathway [J]., 2017, 22(6): 769-776.

[33] Shi H, Feng J M. Aristolochic acid induces apoptosis of human umbilical vein endothelial cellsby suppressing PI3K/Akt signaling pathway [J]., 2011, 32(8): 1025-1030.

[34] Cantley L C. The phosphoinositide 3-kinase pathway [J]., 2002, 296(5573): 1655-1657.

[35] Li M, Li W, Ren F Q,. miRNA-186 improves sepsis induced renal injury via PTEN/PI3K/AKT/P53 pathway [J]., 2020, 15: 254-260.

[36] Thomasova D, Anders H J. Cell cycle control in the kidney [J]., 2015, 30(10): 1622-1630.

[37] Xu W L, Gao L S, Li T,. Mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor (MANF) protects against neuronal apoptosis via activation of Akt/MDM2/p53 signaling pathway in a rat model of intracerebral hemorrhage [J]., 2018, 11: 176.

[38] Chibaya L, Karim B, Zhang H,. Mdm2 phosphorylation by Akt regulates the p53 response to oxidative stress to promote cell proliferation and tumorigenesis [J]., 2021, 118(4): e2003193118.

[39] Wang Y, Ma X L, Zhou C,. Aristolochic acid induces mitochondrial apoptosis through oxidative stress in rats, leading to liver damage [J]., 2021, 31(8): 609-618.

[40] Basu A, Haldar S. The relationship between BcI2, Bax and p53: Consequences for cell cycle progression and cell death [J]., 1998, 4(12): 1099-1109.

[41] Jin C N, Miao X, Zhong Y J,. The renoprotective effect of diosgenin on aristolochic acid I-induced renal injury in rats: Impact on apoptosis, mitochondrial dynamics and autophagy [J]., 2020, 11(9): 7456-7467.

Preventive and protective effects of Jingfang Granules on aristolocholic acid I-induced acute kidney injury in mice

CAO Tian-you1, QU Hui-hua2, DONG Li-yang3, CHENG Guo-liang3, YAO Jing-chun4, SUN Cheng-hong4, ZHAO Yan3, ZHANG Gui-min4

1. School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 10029, China 2. Institute of Chinese Medicine Research, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 10029, China 3. School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese medicine, Beijing 10029, China 4. State Key Laboratory of Generic Technology of Traditional Chinese Medicine Pharmaceuticals, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276000, China

To study the preventive and protective effects of Jingfang Granules (荊防顆粒) on aristolochic acid I-induced acute kidney injury in mice.Male C57BL/6J mice were randomly divided into control group, model group and Jingfang Granules low-, medium-and high-dose (4, 8, 16 g/kg) groups. After 2 h of administration, except the control group, the other groups were ip aristolochic acid I (10 mg/kg) for three consecutive days to establish an acute kidney injury model. After the last administration, creatinine (CRE) and blood urea nitrogen (BUN) levels in serum were detected; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to detect the pathological changes of renal tissue; TUNEL staining was used to observe cells apoptosis of renal tissue; Malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) levels and superoxide dismutase (SOD) activity in kidney tissue of mice were detected; ELISA was used to detect monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and IL-6 levels in kidney tissue; Western blotting was used to detect protein kinase B (Akt), murine double minute 2 (MDm2), p53, B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), Bcl-2 associated X protein (Bax) protein expressions in kidney tissue.Compared with control group, levels of BUN and CRE in serum of mice in model group were significantly increased (< 0.01), and kidneys had obvious pathological damage, levels of MCP-1, TNF-α, IL-1β, IL-6 and MDA in kidney tissue were significantly increased (< 0.01), SOD activity and GSH level in kidney tissue were significantly decreased (< 0.01), indicating that renal cells were damaged by oxidative stress; Number of apoptosis cells in renal tissue was significantly increased (< 0.01), pro-apoptotic factors p53 and Bax protein expressions were significantly increased (< 0.01), while Akt, MDm2 and Bcl-2 protein expressions were inhibited (< 0.01). Compared with model group, Jingfang Granules significantly improved the pathological damage of kidney tissue of mice, reduced the level of inflammatory factors in serum, regulated oxidative stress, up-regulated the expressions of Akt, MDm2 and anti-apoptotic protein Bcl-2 in renal tissue, and inhibited p53 and Bax expressions in renal tissue, reduced the apoptosis of renal tissue cells (< 0.01).Jingfang Granules can alleviate acute kidney injury caused by aristolochic acid by resisting oxidative stress and inflammation, and its mechanism may be related to regulating Akt/MDm2/p53 pathway and inhibiting apoptosis.

Jingfang Granules; aristolochic acids; acute kidney injury; inflammatory response; oxidative stress; cell apoptosis; protein kinase B/murine double minute 2/p53 signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)18 - 5742 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.017

2022-07-04

荊防顆粒二次開發(fā)研究項目（2180071720113）

曹天佑，男，碩士研究生，研究方向為經(jīng)方的現(xiàn)代應用。E-mail: tycao221@163.com

趙 琰（1973—），女，博士生導師，教授，研究方向為經(jīng)方的現(xiàn)代應用。Tel: (010)64286705 E-mail: zhaoyandr@bucm.edu.cn

張貴民（1969—），男，工程碩士，工程應用研究員，研究方向為新藥研發(fā)。E-mail: lunanzhangguimin@163.com

[責任編輯 李亞楠]