陳功森，林龍飛，劉宇靈，石國琳，楊安輝，李 慧, *

不同類型金屬有機骨架材料合成及載雷公藤紅素工藝研究

陳功森1，林龍飛1，劉宇靈1，石國琳1，楊安輝2, 3，李 慧1, 2, 3*

1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700 2. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)研究所，江西 南昌 330006 3. 江西中醫(yī)藥健康產(chǎn)業(yè)研究院，江西 南昌 330000

不同類型金屬有機骨架材料（metal organic frameworks，MOFs）制備工藝優(yōu)化及篩選，用于負載抗腫瘤單體成分雷公藤紅素（celastrol，Cel），從而改善其生物利用度并增強抗腫瘤藥效。以粒徑大小為指標，單因素考察結(jié)合正交試驗優(yōu)化MOFs制備工藝，選擇最佳MOFs；吸附法負載雷公藤紅素，單因素優(yōu)化載藥工藝，CCK-8法初步評價其抗腫瘤細胞藥效。UIO-66最佳工藝為苯甲酸為調(diào)節(jié)劑，投料比1∶1，溶劑60 mL，溶劑熱法反應(yīng)24 h，粒徑（172.3±3.0）nm，多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.166±0.023；ZIF-8最佳工藝為投料比1∶50，水10 mL，室溫密閉攪拌30 min，粒徑（154.0±1.4）nm，PDI為0.245±0.060；MIL-101（Fe）最佳工藝為投料比1∶1，溶劑10 mL，溶劑熱法反應(yīng)24 h，粒徑（553.5±36.2）nm，PDI為0.642±0.109；選擇ZIF-8進行雷公藤紅素的包載，最佳載藥工藝為ZIF-8與雷公藤紅素比例2∶1，載藥時間24 h，藥物質(zhì)量濃度為1 mg/mL，制得ZIF-8@Cel粒徑為（164.9±8.0）nm，PDI為0.297±0.029，載藥量為（23.47±0.26）%；實驗劑量下ZIF-8對HepG2細胞無毒，雷公藤紅素處理HepG2細胞24 h的半數(shù)致死濃度（half-inhibitory concentration，IC50）為3.821 μg/mL，ZIF-8@Cel的IC50值為3.289 μg/mL（以雷公藤紅素含量計）。優(yōu)選的ZIF-8材料制備及載藥工藝穩(wěn)定可行，粒子形狀規(guī)則，晶型良好，分布均勻，載藥量高，生物安全性好，載藥后可明顯增強藥物藥效，為雷公藤紅素抗腫瘤納米制劑的研究提供了基礎(chǔ)。

金屬有機骨架材料；雷公藤紅素；正交試驗設(shè)計；納米；載藥量；肝癌

雷公藤紅素（celastrol，Cel）是從雷公藤根皮中分離得到的五環(huán)三萜類活性化合物，分子式為C29H38O4?，F(xiàn)代藥理研究表明，雷公藤紅素具有抗腫瘤、抗炎、抗肥胖、免疫抑制及鎮(zhèn)痛等藥理活性，雜志將其列為最有可能發(fā)展為藥物的五種天然產(chǎn)物之一[1-5]。近年來，其抗腫瘤研究逐漸增多，雷公藤紅素對前列腺癌、肺癌、肝癌、白血病、結(jié)腸癌、卵巢癌、乳腺癌等腫瘤細胞具有明顯的抑制作用[6-10]。然而，在生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)（BCS）中，雷公藤紅素屬于BCS II類，其難溶于水，溶出慢，生物利用度低及大劑量下的肝腎毒性限制了其臨床應(yīng)用[11-12]。近年來納米載體的發(fā)展為雷公藤紅素的應(yīng)用提供了新方向。An等[13]制備了聚合物膠束用于雷公藤紅素的遞送以改善其水溶性，延長半衰期。Jin等[14]使用介孔二氧化硅裝載雷公藤紅素，制得的納米粒子可改善其溶解度和生物利用度。

傳統(tǒng)無機多孔材料如介孔二氧化硅、石墨烯等，其作為藥物載體載藥量高，但是存在體內(nèi)不易降解等不足；有機材料如納米脂質(zhì)體、膠束等可體內(nèi)降解完全，但載藥量相對較低。金屬有機骨架材料（metal organic frameworks，MOFs）作為一類新興的多孔材料，近年來在藥物載體領(lǐng)域發(fā)展迅速。其是由金屬離子或金屬團簇與有機配體通過配位鍵，輔助以范德華力或氫鍵等相互作用，自組裝形成的一類具有無限周期性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聚合物材料。MOFs具有種類多樣性、孔徑可調(diào)、可表面修飾及大比表面積等優(yōu)勢，可兼顧載藥量與體內(nèi)可降解性。目前，研究較多的主要有IRMOFs系列（isoreticular metal organic frameworks）、MILs系列（material institute lavoisier frameworks）、ZIFs系列（zeoliticim idazolate frameworks）、PCNs系列（porous coordination networks）、UIOs系列（university of oslo）以及CPLs系列（coordinational pillared layers），見表1。

本研究選擇在藥物載體領(lǐng)域最常用的3種MOFs：UIO-66、ZIF-8與MIL-101（Fe），以粒徑大小為指標，對其制備工藝進行正交優(yōu)選，并對制備MOFs的晶體性質(zhì)、形貌特征進行表征。篩選適宜MOFs，考察其對雷公藤紅素的載藥性能，同時對載藥材料對HepG2細胞的細胞藥效進行了初步評價，為后續(xù)體內(nèi)外研究提供基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

Mettler Toledo XP105型電子分析天平，梅特勒-托利多集團；DHG-9030A型鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；聚四氟乙烯內(nèi)襯不銹鋼反應(yīng)釜，上海予申儀器有限公司；真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；S3400掃描電子顯微鏡（SEM），日本日立公司；Zetasizer Nano S90馬爾文納米粒徑儀，英國馬爾文公司；Rigaku UItima IV X射線衍射儀（XRD），日本理學(xué)公司；LC-20AT型高效液相色譜儀，日本島津公司；F7000型熒光光譜儀，日本日立公司。

表1 常見MOFs介紹

Table1 Introduction of several common MOFs

名稱出現(xiàn)時間主要發(fā)明人金屬離子結(jié)構(gòu)代表特點 IRMOFs1999年美國密歇根大學(xué)Yaghi課題組二價鋅立方體網(wǎng)狀MOF-5 (IRMOF-1)比表面積大，孔道結(jié)構(gòu)規(guī)則，孔容積較大 MILs[15]2005年法國凡爾賽大學(xué)Férey小組三價鉻、釩、鋁、鐵菱形孔道結(jié)構(gòu)MIL-101 (Fe)多級分孔，部分具有呼吸現(xiàn)象 ZIFs[16]2006年美國密歇根大學(xué)Yaghi課題組二價鋅、鈷類沸石三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)ZIF-8具有腫瘤酸效應(yīng) PCNs[17]2006年美國德克薩斯A&M大學(xué)Zhou課題組二價銅孔籠和三維正交孔道結(jié)構(gòu)PCN-14比表面積大，孔隙率高 UIOs[18]2008年挪威奧斯陸大學(xué)Cavka J H小組四價鋯三維孔籠結(jié)構(gòu)UIO-66結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 CPLs[19]1999年日本京都大學(xué)Kitagawa研究組二價銅層狀結(jié)構(gòu)CPL-1具有“開孔”現(xiàn)象

HepG2細胞購買于廣州吉妮歐生物科技有限公司；四氯化鋯，批號C11495248，質(zhì)量分數(shù)＞98%，上海麥克林生化科技有限公司；對苯二甲酸、三氯化鐵，分析純，天津福晨化學(xué)試劑有限公司；,-二甲基甲酰胺（DMF），冰醋酸、鹽酸、磷酸、六水和硝酸鋅，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；苯甲酸、二甲基咪唑，分析純，天津光復(fù)科技發(fā)展有限公司；雷公藤紅素，批號YRL0094201022，質(zhì)量分數(shù)＞98%，寶雞翊瑞生物科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液、CCK8染色液，北京索萊寶科技有限公司；甲醇，色譜純，賽默飛世爾科技有限公司；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 UIO-66制備工藝考察

2.1.1 溶劑熱法合成UIO-66 分別精密稱定適量四氯化鋯和對苯二甲酸，加入一定體積DMF充分溶解，加適量調(diào)節(jié)劑。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至50 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜內(nèi)，在干燥箱內(nèi)升溫至120 ℃，恒溫反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取出產(chǎn)物。12 000 r/min離心（離心半徑75 mm）5 min，收集，沉淀分別依次用DMF和甲醇洗滌3次，置于真空干燥箱內(nèi)室溫干燥24 h。

2.1.2 調(diào)節(jié)劑種類單因素考察 比較不同種類調(diào)節(jié)劑乙酸、鹽酸與苯甲酸對UIO-66的影響，其余制備條件一致。使用納米粒徑儀分別測定其粒徑分布和多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）。表2結(jié)果表明，使用苯甲酸作為調(diào)節(jié)劑時，粒徑較小且PDI值小于0.3，表明粒子分布較均勻。

2.1.3 UIO-66制備正交試驗考察 以粒徑大小為指標，苯甲酸作為調(diào)節(jié)劑，采用3因素3水平正交實驗設(shè)計，考察投料比（A）、溶劑量（B）、反應(yīng)時間（C）對UIO-66粒徑大小的影響。正交試驗的因素水平、實驗設(shè)計與結(jié)果以及直觀分析見表3，方差分析見表4。

表2 UIO-66粒徑分布(, n = 3)

Table 2 Particle size distribution of UIO-66 (, n = 3)

調(diào)節(jié)劑種類粒徑/nmPDI 乙酸885.2±23.20.594±0.126 鹽酸1 684.0±26.80.312±0.098 苯甲酸240.9±5.70.144±0.022

表3 UIO-66正交試驗因素水平、實驗設(shè)計與結(jié)果

Table 3 Factors level, experimental design and result of orthogonal test ofUIO-66

序號AB/mLC/hD (誤差)粒徑/nm 11∶1 (1)20 (1)12 (1)(1)248.9 21∶1 (1)40 (2)24 (2)(2)221.4 31∶1 (1)60 (3)36 (3)(3)215.1 41∶2 (2)20 (1)24 (2)(3)384.6 51∶2 (2)40 (2)36 (3)(1)286.5 61∶2 (2)60 (3)12 (1)(2)218.4 71∶4 (3)20 (1)36 (3)(2)456.4 81∶4 (3)40 (2)12 (1)(3)893.8 91∶4 (3)60 (3)24 (2)(1)275.2 K1685.41 089.91 361.1810.6 K2889.51 401.7881.2896.2 K31 625.4708.7958.01 493.5 R940.0693.0479.9682.9

表4 UIO-66合成正交試驗方差分析結(jié)果

Table 4 Analysis results of variance of UIO-66

誤差來源離差平方和自由度方差F值P值 A162 978.402 2281 489.201 11.766 30.361 5 B80 309.075 6240 154.537 80.870 40.534 7 C44 299.095 6222 149.547 80.480 10.675 6 D (誤差)92 271.895 6246 135.947 8

方差分析結(jié)果表明，3因素各水平無顯著性差異。由直觀分析可知，各因素對實驗結(jié)果的影響依次為A＞B＞C，表明投料比對粒徑影響較大。因素水平分析（值分析）A為3＞2＞1，A1粒徑最小，即投料比四氯化鋯-對苯二甲酸為1∶1；B為2＞1＞3，B3粒徑最小，即溶劑量60 mL；C為1＞3＞2，C2粒徑最小，即反應(yīng)時間24 h。故UIO-66合成素最佳條件為A1B3C2，即投料比1∶1，溶劑60 mL，反應(yīng)24 h，此時制得UIO-66粒徑最小。對A1B3C2進行3批驗證，結(jié)果見表5。

3批驗證結(jié)果表明，UIO-66合成工藝穩(wěn)定可行，平均粒徑為172.3 nm，分散性良好。

2.2 ZIF-8制備工藝考察

2.2.1 室溫攪拌法合成ZIF-8 精密稱取2-甲基咪唑溶解于一定體積溶劑中，精密稱取六水硝酸鋅溶解于少量溶劑中。在室溫攪拌下，將六水硝酸鋅溶液逐滴滴加至2-甲基咪唑溶液中，密閉攪拌一段時間，ZIF-8納米粒自發(fā)形成，得到白色混懸液。12 000 r/min離心（離心半徑75 mm）5 min，得到白色沉淀，甲醇洗滌3次，室溫下真空干燥。

表5 UIO-66合成最優(yōu)結(jié)果3批驗證

Table 5 Verification of UIO-66 synthesis results

試驗號粒徑/nmPDI 1169.40.176 2172.1 0.140 3175.40.182

2.2.2 溶劑種類比較 ZIF-8合成常用溶劑有水、甲醇、氨水及DMF，其余條件保持一致，比較分別使用4種溶劑制備ZIF-8粒徑差異，結(jié)果見表6。水為溶劑合成ZIF-8粒徑在200 nm左右，甲醇為溶劑合成ZIF-8粒徑在600 nm左右，PDI均較低，分散均勻。12%氨水為溶劑合成ZIF-8粒徑在250 nm左右，PDI較高，而DMF為溶劑室溫下無明顯產(chǎn)物出現(xiàn)，推測可能因為DMF常用于溶劑熱法合成ZIF-8，室溫合成法不適用。經(jīng)比較，初步選擇水作為合成溶劑制備ZIF-8。

表6 ZIF-8粒徑分布(, n = 3)

Table 6 Particle size distribution of ZIF-8 (, n = 3)

溶劑粒徑/nmPDI 水195.0±6.50.108±0.009 甲醇597.8±12.60.099±0.011 氨水248.5±2.80.384±0.006 DMF??

2.2.3 ZIF-8合成正交試驗考察 以粒徑大小為指標，水為合成溶劑，采用3因素3水平正交試驗設(shè)計，考察投料比（A）、溶劑量（B）、反應(yīng)時間（C）對ZIF-8粒徑大小的影響。因素水平表、實驗設(shè)計與結(jié)果以及直觀分析見表7，方差分析見表8。

方差分析結(jié)果表明，A因素投料比與B因素溶劑量有顯著性差異，C因素反應(yīng)時間無統(tǒng)計學(xué)差異；由直觀分析表可知，ZIF-8合成最優(yōu)工藝為A3B1C2，即投料比1∶50，溶劑10 mL，反應(yīng)30 min。對A3B1C2進行3批驗證，結(jié)果見表9。

3批驗證結(jié)果表明，ZIF-8合成工藝穩(wěn)定可行，粒徑均在154 nm左右，分散性良好。

2.3 MIL-101（Fe）合成正交試驗考察

2.3.1 溶劑熱法合成MIL-101（Fe） 分別精密稱定適量三氯化鐵和對苯二甲酸，加入一定體積 DMF充分溶解，加適量調(diào)節(jié)劑。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至50 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜內(nèi)，在干燥箱內(nèi)升溫至110 ℃，恒溫反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后取出產(chǎn)物。12 000 r/min離心（離心半徑75 mm）5 min收集，沉淀分別依次用DMF和甲醇洗滌3次，置于真空干燥箱內(nèi)室溫干燥24 h。

表7 ZIF-8正交試驗因素水平、實驗設(shè)計與結(jié)果

Table 7 Factors level, experimental design and result of orthogonal test ofZIF-8

序號AB/mLC/minD (誤差)粒徑/nm 11∶10 (1)10 (1)10 (1)(1)666.2 21∶10 (1)15 (2)30 (2)(2)650.9 31∶10 (1)20 (3)60 (3)(3)737.7 41∶30 (2)10 (1)30 (2)(3)149.3 51∶30 (2)15 (2)60 (3)(1)191.2 61∶30 (2)20 (3)10 (1)(2)271.2 71∶50 (3)10 (1)60 (3)(2)151.7 81∶50 (3)15 (2)10 (1)(3)144.0 91∶50 (3)20 (3)30 (2)(1)177.4 K12 054.8967.21 081.41 034.8 K2611.7986.1977.61 073.8 K3473.11 186.31 080.61 031.0 R1 581.7219.1103.842.8

表8 ZIF-8合成正交試驗方差分析結(jié)果

Table 8 Analysis results of variance of ZIF-8

誤差來源離差平方和自由度方差F值P值 A511 502.495 62255 751.247 81 367.133 80.000 7 B9 826.895 624 913.447 826.265 10.036 7 C2 376.008 921 188.004 46.350 50.136 0 D (誤差)374.142 22187.071 1

表9 ZIF-8合成最優(yōu)結(jié)果3批驗證

Table 9 Verification of ZIF-8 synthesis results

試驗號粒徑/nmPDI 1155.30.178 2154.10.296 3152.60.260

2.3.2 MIL-101（Fe）合成正交試驗 以粒徑大小為指標，采用3因素3水平正交試驗設(shè)計，考察投料比（A）、溶劑量（B）、反應(yīng)時間（C）對MIL-101（Fe）粒徑大小的影響。因素水平表、實驗設(shè)計與結(jié)果以及直觀分析見表10，方差分析見表11。

表10 MIL-101 (Fe) 正交因素水平、實驗設(shè)計與結(jié)果

Table 10 Factors level, experimental design and result of orthogonal test ofMIL-101 (Fe)

序號AB/mLC/minD (誤差)粒徑/nm 11∶1 (1)10 (1)12 (1)(1)398.1 21∶1 (1)20 (2)24 (2)(2)526.1 31∶1 (1)30 (3)36 (3)(3)497.2 41∶2 (2)10 (1)24 (2)(3)494.3 51∶2 (2)20 (2)36 (3)(1)689.9 61∶2 (2)30 (3)12 (1)(2)933.5 71∶3 (3)10 (1)36 (3)(2)584.8 81∶3 (3)20 (2)12 (1)(3)941.3 91∶3 (3)30 (3)24 (2)(1)609.1 K11 421.41 477.22 272.91 697.1 K22 117.72 157.31 629.52 044.4 K32 135.22 039.81 771.91 932.8 R7 13.8680.1643.4347.3

表11 MIL-101 (Fe) 合成正交試驗方差分析結(jié)果

Table 11 Analysis results of variance of MIL-101 (Fe)

誤差來源離差平方和自由度方差F值P值 A110 516.708 9255 258.354 45.273 10.159 4 B88 095.668 9244 047.834 44.203 30.192 2 C76 138.035 6238 069.017 83.632 80.215 9 D (誤差)20 958.482 2210 479.241 1

方差分析結(jié)果表明，3因素均無顯著性差異；由直觀分析表可知，MIL-101（Fe）合成最優(yōu)工藝為A1B1C2，即投料比1∶1，溶劑10 mL，反應(yīng)24 h。對A1B1C2進行3批驗證，結(jié)果見表12。

表12 MIL-101 (Fe) 合成最優(yōu)結(jié)果3批驗證

Table 12 Verification of MIL-101(Fe) synthesis results

試驗號粒徑/nmPDI 1559.00.535 2586.70.753 3514.90.638

3批MIL-101（Fe）粒徑均在550 nm左右，工藝較穩(wěn)定。但粒子PDI均較大，分布不均勻。

2.4 3種MOFs粒子的表征

使用SEM和XRD分別對上述合成的3種MOFs粒子的形貌大小和晶體特征進行表征。

2.4.1 SEM 取粉末樣品各微量，甲醇超聲分散后，滴1滴于空白玻片表面，室溫揮干溶劑，在樣品表面噴金2.5 min后，進行SEM觀察，記錄SEM圖譜，觀察晶體形貌大小。3種材料的SEM形貌如圖1所示。UIO-66粒子呈類球形多面體形狀，粒子大小均勻，形狀規(guī)則；ZIF-8呈六面體形狀，分散均勻，粒徑較?。籑IL-101（Fe）呈八面體形，形狀規(guī)則，但粒子大小有差異，均勻性較差。

圖1 UIO-66 (A)、ZIF-8 (B)、MIL-101 (Fe) (C) 的SEM圖

2.4.2 XRD 取樣品粉末各10 mg左右，在Cu-Kα（＝1.541 nm），高壓40 kV，管流40 mA，掃描速度2°/min的條件下進行X射線衍射，得到衍射圖譜（圖2），測定樣品的結(jié)晶度和純度。UIO-66在27.54°、8.70°、25.90°、30.90°等處的衍射峰與文獻報道一致[20]，且無其他材料衍射峰出現(xiàn)。ZIF-8衍射峰在27.50°、10.54°、12.90°、16.62°及18.20°，均符合文獻已報道的ZIF-8衍射峰[21]。MIL-101（Fe）在25.44°、8.70°、9.30°、10.52°及16.68°處均出現(xiàn)明顯的吸收峰，與已報道的MIL-101型的標準XRD特征峰一致[22]。

綜合上述合成及表征結(jié)果，ZIF-8制備簡便，粒徑小，分布均勻，工藝穩(wěn)定，較符合藥物載體要求選擇ZIF-8進行后續(xù)載藥實驗。

2.5 ZIF-8裝載雷公藤紅素制備納米粒（ZIF-8@ Cel）的性能研究

2.5.1 ZIF-8裝載雷公藤紅素工藝 采用吸附法進行載藥。將適量ZIF-8粉末置于雷公藤紅素甲醇溶液中，室溫密閉攪拌一定時間，12 000 r/min離心（離心半徑75 mm）5 min，甲醇多次洗滌，室溫下真空干燥，即得ZIF-8@Cel載藥納米粒。

圖2 UIO-66 (A)、ZIF-8 (B)、MIL-101 (Fe) (C) 的XRD圖

2.5.2 載藥量測定

（1）雷公藤紅素色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸水水溶液（80∶20），等度洗脫；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長244 nm；進樣量10 μL。

（2）對照品溶液的制備：精密稱取雷公藤紅素5 mg于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為儲備液。精確量取儲備液2 mL于5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，即得含雷公藤紅素0.2 mg/mL的對照品溶液。

（3）供試品溶液的制備：取ZIF-8@Cel約5 mg，精密稱定，加1 mL冰醋酸，加適量甲醇超聲處理（功率150 W、頻率40 kHz）20 min，定容至10 mL量瓶中，搖勻，即得。

（4）陰性供試品溶液的制備：取空白材料約5 mg，精密稱定，按照“2.5.2（2）”項方法制成陰性供試品溶液。

（5）專屬性考察：分別吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各1 mL，經(jīng)微孔濾膜濾過后，按照“2.5.2（1）”項下色譜條件，進高效液相檢測，色譜圖見圖3。

（6）線性關(guān)系考察：精密稱取雷公藤紅素對照品5.0 mg置于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的對照品母液。精密吸取母液適量，依次用甲醇稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005 mg/mL系列對照品溶液。按“2.5.2（1）”項下方法檢測，以峰面積為縱坐標（），質(zhì)量濃度為橫坐標（），繪制標準曲線并進行線性回歸，得雷公藤紅素的回歸方程為＝12 125 696.90＋14 234.01，2＝1.000 0，表明雷公藤紅素在0.005～0.5 mg/mL線性關(guān)系良好。

圖3 ZIF-8 (A)、雷公藤紅素對照品(B) 及ZIF-8@Cel (C) 的HPLC圖

（7）檢測限與定量限：精確吸取“2.5.2（2）”項中對照品溶液，甲醇稀釋，按照“2.5.2（1）”項色譜條件進行測定。樣品峰高為儀器噪聲高度3倍時的樣品質(zhì)量濃度即為樣品的檢出限，樣品峰高為儀器噪聲高度10倍時的樣品質(zhì)量濃度即為樣品的定量限。結(jié)果顯示，雷公藤紅素的檢測限為0.06 μg/mL，定量限為0.20 μg/mL。

（8）精密度試驗：精密吸取質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的雷公藤紅素對照品溶液1 mL，按照“2.5.2（1）”項下色譜條件每天連續(xù)進樣6次，連續(xù)進樣3 d，記錄峰面積，計算RSD值。結(jié)果日內(nèi)精密度RSD為1.62%，日間精密度RSD為0.32%，表明其精密度良好。

（9）穩(wěn)定性試驗：精密移取ZIF-8@Cel供試品溶液1 mL，按照“2.5.2（1）”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，記錄峰面積，計算RSD值，測得峰面積的RSD值為0.37%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

（10）重復(fù)性試驗：重復(fù)制備6份ZIF-8@Cel供試品溶液，分別精密吸取上述供試品溶液各1 mL，按照“2.5.2（1）”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果ZIF-8@Cel樣品中雷公藤紅素的平均載藥量為23.36%，其RSD值為1.15%，表明測定方法的重復(fù)性良好。

（11）加樣回收率試驗：精密稱定ZIF-8@Cel樣品2.5 mg，加入0.5 mg/mL對照品溶液1 mL，按照“2.5.2（3）”項下方法制備加樣回收供試品溶液6份，測得加樣回收率為97.77%，RSD小于5%，表明該方法回收率符合要求。

2.5.3 ZIF-8@CEL載藥工藝單因素考察

（1）ZIF-8與雷公藤紅素質(zhì)量比考察：根據(jù)文獻調(diào)研及預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)置ZIF-8與雷公藤紅素質(zhì)量比分別為1∶2、1∶1、2∶1、3∶1，藥液質(zhì)量濃度5 mg/mL，載藥時間24 h，比較載藥粒子粒徑大小及載藥量。結(jié)果（表13）表明，隨著ZIF-8比例的增大，粒徑呈減小趨勢，變化幅度逐漸減小，比例為2∶1與3∶1粒徑接近；載藥量隨著ZIF-8比例的增大而減小。綜合粒徑與載藥量結(jié)果，選擇ZIF-8與CEL比例2∶1進行后續(xù)實驗。

表13 ZIF-8與雷公藤紅素質(zhì)量比單因素考察結(jié)果(, n = 3)

Table 13 Results of single factor investigation of the ratio of ZIF-8 to CEL (, n = 3)

ZIF-8與雷公藤紅素質(zhì)量比粒徑/nmPDI載藥量/% 1∶2451.8±4.50.347±0.02541.32±2.34 1∶1272.6±2.30.296±0.03632.17±2.15 2∶1176.4±2.50.211±0.01924.58±1.98 3∶1174.0±1.90.205±0.02620.65±1.69

（2）載藥時間考察：載藥時間的長短也對載藥行為影響較大。暫定ZIF-8與CEL比例2∶1，藥液質(zhì)量濃度5 mg/mL，設(shè)置載藥時間24、12、6 h進行考察。結(jié)果（表14）表明，時間越短粒子粒徑越小，載藥量越低，最終確定載藥時間24 h。

（3）藥液質(zhì)量濃度考察：固定ZIF-8與CEL比例2∶1，載藥時間24 h，比較藥液質(zhì)量濃度1、2、5、10、20 mg/mL的影響。結(jié)果（表15）表明，藥物質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，粒徑相對較小，同時載藥量較高。

綜合上述單因素結(jié)果，確定最佳載藥工藝為ZIF-8與CEL質(zhì)量比2∶1，載藥時間24 h，藥物質(zhì)量濃度為1 mg/mL。進行3批最佳工藝驗證，結(jié)果ZIF-8@CEL的平均粒徑為（164.9±8.0）nm，PDI為0.297±0.029，載藥量為（23.47±0.26）%，工藝穩(wěn)定可行。

表14 載藥時間單因素考察結(jié)果(, n = 3)

Table 14 Results of single factor investigation of drug loading time (, n = 3)

t/h粒徑/nmPDI載藥量/% 24176.4±2.50.211±0.01924.58±1.98 12162.5±1.60.288±0.05520.59±1.56 6162.3±1.50.255±0.04615.31±1.45

表15 藥物質(zhì)量濃度單因素考察結(jié)果(, n = 3)

Table 15 Results of single factor investigation of drug concentration (, n = 3)

質(zhì)量濃度/(mg?mL?1)粒徑/nmPDI載藥量/% 1162.9±2.40.296±0.03423.82±1.88 2188.3±2.70.355±0.05921.09±1.98 5179.1±3.50.308±0.04522.72±1.66 10189.2±4.60.351±0.05622.19±1.75 20174.5±1.90.276±0.02922.01±1.77

2.6 細胞水平藥效評價

HepG2細胞在含有10%胎牛血清和抗生素（100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)2～3 d。

在比較游離CEL和ZIF-8@CEL的細胞毒性作用之前，采用CCK-8法檢測空白ZIF-8對HepG2細胞的體外細胞毒性。當細胞覆蓋培養(yǎng)瓶底部的80%以上面積時，用胰蛋白酶消化收集細胞，并在新鮮培養(yǎng)基中重懸。細胞接種于96孔板，接種密度為100 μL/孔，接種數(shù)量為6000個/孔，培養(yǎng)過夜。然后用不同質(zhì)量濃度的ZIF-8處理細胞24 h，棄上清液，每孔加入含10% CCK-8的100 μL培養(yǎng)基溶液，37 ℃避光孵育3 h。用酶標儀測定了在450 nm波長處的吸光度（）值。根據(jù)表16，不同質(zhì)量濃度的ZIF-8（0、10、20、30、40 μg/mL）孵育24 h后，細胞存活率無顯著降低，說明ZIF-8在實驗劑量下是無毒的。接著，CCK-8法比較了游離雷公藤紅素和ZIF- 8@CEL對HepG2細胞的毒性。結(jié)果（表17）顯示隨著質(zhì)量濃度升高，細胞存活率逐漸降低，具有明顯質(zhì)量濃度相關(guān)性。雷公藤紅素的半數(shù)致死濃度（half-inhibitory concentration，IC50）值為3.821 μg/mL，ZIF-8@CEL的IC50值為3.289 μg/mL（以雷公藤紅素計）。含相同質(zhì)量濃度雷公藤紅素條件下，ZIF-8@CEL對HepG2細胞抑制效果更強，IC50值更小。

3 討論

MOFs結(jié)合了有機材料的可降解性及無機材料的高載藥量的優(yōu)勢。其是由金屬配位鍵、范德華力等作用力結(jié)合，其相對較弱的結(jié)合力會在體內(nèi)被逐漸解離，變?yōu)樾》肿佑袡C物及金屬離子，小分子可直接被代謝，金屬離子為體內(nèi)存在的鋅、鐵等離子，可被吸收代謝，具有良好的安全性[23]。Baati等[24]制備了MIL88B、MIL88A及MIL100等多種鐵基MOFs，并靜脈注射到大鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)其在體內(nèi)會被肝臟和脾臟分解成鐵離子和有機配體，并通過尿液和糞便排除，基本不存在代謝毒性。

表16 不同質(zhì)量濃度ZIF-8作用24 h后HepG2細胞的存活率(, n = 4)

Table 16 Survival rate of HepG2 cells after different concentrations of ZIF-8 for 24 h (, n = 4)

質(zhì)量濃度/(μg?mL?1)細胞存活率/% 0100.00±0.00 10101.87±4.14 20103.13±5.00 30105.44±3.16 40105.88±4.41

表17 雷公藤紅素與ZIF-8@CEL對HepG2細胞毒性CCK8結(jié)果(, n = 4)

Table 17 CCK8 results of CEL and ZIF-8@CEL on HepG2 cytotoxicity (, n = 4)

質(zhì)量濃度/(μg?mL?1)（以雷公藤紅素計）細胞存活率/% 雷公藤紅素ZIF-8@Cel 空白對照100.00±0.00100.00±0.00 0.592.03±4.45*89.70±5.30* 172.13±3.65*77.04±1.91* 242.04±3.98*46.09±2.76* 436.72±3.53*40.02±3.89* 819.12±2.16*25.92±2.56*

與空白對照比較：*＜0.05

*< 0.05control group

本實驗選擇的3類MOFs分別屬于UIOs系列、ZIFs系列與MILs系列。文獻研究表明，這3類MOFs在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用較多。UIO-66、ZIF-8與MIL-101（Fe）分別為3類MOFs中的代表，其金屬中心依次為四價鋯、二價鋅及三價鐵，包括了不同金屬類型及價位，且3類材料具有不同的晶體結(jié)構(gòu)，具有良好的代表性。目前，這3種MOFs作為藥物載體的研究受到較多關(guān)注[25-26]。Haddad等[27]使用UIO-66負載抗腫瘤藥物二氯乙酸，同時修飾了定位于線粒體的三苯基膦，具有良好的抗腫瘤效果和靶向性。Zhang等[28]使用ZIF-8負載抗腫瘤前藥，進一步使用透明質(zhì)酸功能化修飾，制備的納米粒子具有良好的抗腫瘤效果。Cai等[29]將葉酸和5-羧酸熒光素用于修飾MIL-101（Fe）以構(gòu)建功能化納米平臺，同時遞送抗腫瘤藥物雷公藤甲素，具有優(yōu)異的熒光成像和協(xié)同靶向抗癌活性。本實驗通過單因素考察結(jié)合正交試驗分別對3類MOFs的合成工藝進行了優(yōu)化，得到最佳制備工藝。經(jīng)比較，ZIF-8粒徑在154 nm左右，形狀規(guī)則，晶型良好，分布均勻，適宜作為藥物載體用于后續(xù)實驗。

對于CEL的包載，常用方法有“一步法”與吸附法?！耙徊椒ā睘樗幬锱c合成原料同時加入，在材料合成的同時，將藥物分子包裹在材料孔隙內(nèi)；吸附法為先合成空白材料，再將材料置于一定質(zhì)量濃度藥液中密閉攪拌一定時間，依靠材料吸附性進行藥物裝載。前期預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，“一步法”制備的載藥粒子載藥量均較低，增加藥物濃度以提高載藥量的同時，粒徑也急劇增大，載藥量5%左右時粒徑接近900 nm。經(jīng)分析可能是由于雷公藤紅素中含有羧基基團，其在二甲基咪唑形成的堿性溶液里與金屬離子配位結(jié)合產(chǎn)生絡(luò)合物，導(dǎo)致形成的ZIF-8金屬中心數(shù)量少，粒子粒徑大，同時載藥量較低。因此最終采用吸附法進行載藥，通過單因素試驗，考察影響吸附法載藥的3個因素載體藥物比、載藥時間與藥物濃度，最終確定載藥工藝為ZIF-8與雷公藤紅素比例2∶1，載藥時間24 h，藥物質(zhì)量濃度為1 mg/mL，得到ZIF-8@CEL粒徑為165 nm左右，分散均勻，載藥量約23%，工藝穩(wěn)定可行。

最后，CCK-8細胞毒性試驗評價了ZIF-8、CEL及ZIF-8@CEL對HepG2細胞的抑制作用，結(jié)果表明ZIF-8在實驗劑量下安全性良好，ZIF-8@CEL相較于雷公藤紅素抑制效果更強，IC50值更小。后續(xù)細胞毒性機制及體內(nèi)抗腫瘤試驗將進一步驗證納米載體的優(yōu)勢。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on synthesis of different types of metal organic frameworks and technology of celastrol loading

CHEN Gong-sen1, LIN Long-fei1, LIU Yu-ling1, SHI Guo-lin1, YANG An-hui2, 3, LI Hui1, 2, 3

1. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China 2. Institute of Traditional Chinese Medicine Health Industry, China Academy of Chinese Medical Sciences, Nanchang 330006, China 3. Jiangxi Health Industry Institute of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330000, China

The preparation process optimization and screening of different types of metal organic frameworks (MOFs), which are used to load the antitumor monomer celastrol (Cel), so as to improve its bioavailability and enhance the antitumor efficacy.Taking the particle size as the index, the preparation process of MOFs was optimized by single factor investigation and orthogonal test, and then the best MOFs was selected. Celastrol was loaded by adsorption method, and the drug loading process was optimized by single factor experiment. The anti-tumor effect was preliminarily evaluated by CCK-8 method.The optimum process of UIO-66 is as follows: benzoic acid as regulator, feed ratio 1:1, solvent 60 mL, solvothermal reaction for 24 h, particle size (172.3 ± 3.0) nm, PDI 0.166 ± 0.023. The optimum process of ZIF-8 is as follows: feed ratio 1:50, water 10 mL, airtight stirring at room temperature for 30 min, particle size (154.0 ± 1.4) nm and PDI 0.245 ± 0.060. The optimum process of MIL-101(Fe) is as follows: the feed ratio is 1:1, the solvent is 10 mL, the solvothermal reaction is 24 h, the particle size is (553.5 ± 36.2) nm, and the PDI is 0.642 ± 0.109. ZIF-8 was selected for the encapsulation of celastrol. The optimal drug loading process was that the ratio of ZIF-8 to celastrol was 2:1, the drug loading time was 24 h, and the drug concentration was 1 mg/mL. The particle size of ZIF-8@Cel was (164.9 ± 8.0) nm, the PDI was 0.297 ± 0.029, and the drug loading was (23.47 ± 0.26)%. ZIF-8 was non-toxic to HepG2 cells at the experimental dose. The IC50value of HepG2 cells treated with celastrol for 24 h was 3.821 μg/mL, and the IC50value of ZIF-8@Cel was 3.289 μg/mL (calculated by celastrol content).The optimized ZIF-8 material has stable and feasible preparation and drug loading process, regular particle shape, good crystal form, uniform distribution, high drug loading and good biosafety. ZIF-8@Cel can significantly enhance the drug cell efficacy, which provides a basis for the research of celastrol antitumor nano preparation.

metal organic frameworks; celastrol; orthogonal experimental design; nanometer; drug loading; liver cancer

R283.6

A

0253 - 2670(2022)18 - 5673 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.010

2022-04-02

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助（ZXKT21012）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助（ZZ13- 035-08）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助（CI2021A04301）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助（ZZ13-YQ-059）

陳功森，博士研究生，研究方向為中藥新制劑與新劑型。E-mail: gongsenchen@163.com

李 慧，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥新劑型與新藥開發(fā)研究。E-mail: lihuiyiren@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]