熊 瑞，武 娟，張興興，楊玉婷，吳珊珊，王建科，李 瑋*，胡昌江

基于化學(xué)計量學(xué)的重樓（加格略）生品和蒸制品飲片HPLC指紋圖譜研究

熊 瑞1，武 娟1，張興興1，楊玉婷1，吳珊珊1，王建科1，李 瑋1*，胡昌江2

1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137

構(gòu)建重樓（加格略）蒸制前后的HPLC指紋圖譜，并借助化學(xué)計量學(xué)手段科學(xué)評價其蒸制前后的質(zhì)量差異。利用HPLC建立指紋圖譜分析測定方法，采用相似度軟件建立共有模式及確立共有峰，并運用SIMCA 14.1、SPSS 26等軟件進(jìn)行化學(xué)計量學(xué)分析，如系統(tǒng)聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。相似度結(jié)果顯示，重樓生品飲片和蒸制品飲片相似度相對較高，HCA和PCA結(jié)果顯示，重樓生品飲片及其蒸制品飲片基本能各自聚類，但仍存在小部分交叉，而采用OPLS-DA模型能有效體現(xiàn)重樓蒸制前后的差異，并篩選出12（重樓皂苷I）、9（重樓皂苷II）、4（loureiroside）和5（未知）號色譜峰可能是重樓蒸制前后差異性潛在關(guān)鍵性成分。構(gòu)建的重樓蒸制前后飲片HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的研究可以為完善重樓生、制飲片的質(zhì)量控制和品質(zhì)評價提供參考，為民族藥炮制的臨床用藥研究奠定基礎(chǔ)。

重樓（加格略）；蒸制；指紋圖譜；化學(xué)計量學(xué)；正交偏最小二乘-判別分析；系統(tǒng)聚類分析；主成分分析；重樓皂苷I；重樓皂苷II；loureiroside

重樓藥材的基原主要來自于百合科重樓屬植物云南重樓Smith var.(Franch.) Hand. Mazz.或七葉一枝花Smith var.(Franch.) Hara的干燥根莖[1]。重樓作為中藥使用時，以生品飲片入藥，歸屬于清熱藥，具有清熱解毒、消腫止痛和涼肝定驚的作用，用于疔瘡癰腫、咽喉腫痛、蛇蟲咬傷、跌撲傷痛、驚風(fēng)抽搐等疾病的治療。在苗醫(yī)藥中，重樓被稱之為加格略，采用蒸制的炮制方法后使用。《貴州苗藥·興仁卷》[2]及《苗鄉(xiāng)采藥習(xí)俗與方法》[3]等苗藥相關(guān)書籍中記載了重樓采用蒸制的炮制方法用于治療胃痛、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等胃腸性疾病，同時貴州民間食療亦有與糯米共蒸后打粉服用，用于治療如胃痛、胃潰瘍及十二指腸潰瘍等病的習(xí)慣，表明蒸制后的重樓在治療消化系統(tǒng)相關(guān)疾病具有較大潛力，但目前對于重樓蒸制工藝、質(zhì)量控制、蒸制前后化學(xué)成分變化等相關(guān)研究基礎(chǔ)較薄弱。

指紋圖譜技術(shù)，可以系統(tǒng)地反映中藥或民族藥化學(xué)成分整體成分信息（組成及含量分布狀況），從而成為一種質(zhì)量控制模式廣泛應(yīng)用于中藥或民族藥內(nèi)在質(zhì)量的客觀評價。隨著數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)的發(fā)展，指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析已廣泛應(yīng)用于中藥及民族藥的質(zhì)量評價及差異標(biāo)記物的篩選[4-6]。因此，本實驗通過運用HPLC技術(shù)構(gòu)建蒸制前后重樓的指紋圖譜，并結(jié)合相似度分析（similarity analysis，SA）以及化學(xué)計量學(xué)中多元統(tǒng)計分析的模式識別方法如系統(tǒng)聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）進(jìn)行模式識別和差異性成分的篩選，用于重樓生品飲片與蒸制品飲片的差異比較，以期為重樓不同炮制飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Shimadzu高效液相色譜儀，配備Essentia LC- 16×2泵，SIL-16自動進(jìn)樣器，CTO-16L柱溫箱，Essentia SPD-16紫外分光光度檢測器，DGU-20A脫氣機(jī)，CBM-20A控制器，島津儀器蘇州有限公司；Waters Xevo G2-S QTof質(zhì)譜系統(tǒng)，美國Waters公司；JFD-300T型粉碎機(jī)，武義海納電器有限公司；WP-UP-WF-20型超純水機(jī)，四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司；SK8200LHC型超聲波清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；ME204E型萬分之一天平，0.1 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LE403E型千分之一天平，1 mg，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 試劑與試藥

甲醇，分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純，美國Tedia公司；流動相用水為超純水。對照品重樓皂苷I（批號MUST-20111714，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.82%）、重樓皂苷II（批號MUST- 21062804，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.97%）、重樓皂苷VI（批號MUST-21090811，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.43%）、重樓皂苷VII（批號GZDD-0606，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.72%），成都曼思特生物科技有限公司；重樓皂苷V，批號DST190513-252，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，成都德思特生物技術(shù)有限公司。

1.3 藥材

收集的重樓原藥材信息見表1，經(jīng)由貴州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室謝軍麗講師鑒定，基原均為《中國藥典》2020年版[1]中收載品種百合科重樓屬植物云南重樓Smith var.(Franch.) Hand. Mazz.的干燥根莖，且均符合《中國藥典》2020年版相關(guān)規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 重樓飲片的制備

2.1.1 重樓生品飲片制備 分別取重樓各批次原藥材（Y1～Y11），凈制后，加入83%蒸餾水悶潤至透心，切片（2～4 mm），46 ℃鼓風(fēng)烘干至完全干燥，即得生品飲片（編號S1～S11）。

表1 重樓原藥材采購信息及編號

Table 1 Information of ParidisRhizoma

編號產(chǎn)地采收時間編號產(chǎn)地采收時間 Y1云南昭通2020-11Y7云南麗江2020-07 Y2云南楚雄2020-09Y8云南文山2021-01 Y3貴州惠水2020-11Y9貴州小貞豐2020-10 Y4貴州普安2020-11Y10云南羅平2020-12 Y5貴州興義安龍2020-07Y11貴州紫云2020-11 Y6貴州安順2020-09

2.1.2 重樓蒸制品飲片制備 分別取重樓各批次原藥材（Y1～Y11），凈制后，加入83%蒸餾水悶潤至透心，切片（2～4 mm），再經(jīng)常壓蒸制87 min，46 ℃鼓風(fēng)烘干至完全干燥，即得蒸制品飲片（編號P1～P11）。

2.2 供試品溶液的制備[7]

將制備好的重樓生品飲片和蒸制品飲片粉碎，過篩。取過4號篩粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密量取甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W、頻率35 kHz）30 min，取出冷卻，稱定質(zhì)量后用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻濾過，取續(xù)濾液過0.45 μm有機(jī)微孔濾膜后作為供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取各對照品（重樓皂苷VII、II、I、VI、V）約10 mg，加甲醇溶解，并定容至10 mL，作為儲備液。分別量取適量該5種對照品儲備液，配制成一定質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱為Inertsustain C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），采用超純水和乙腈作為流動相，進(jìn)行梯度洗脫：0～11 min，20%～25%乙腈；11～14 min，25%～28%乙腈；14～24 min，28%～32%乙腈；24～34 min，32%～38%乙腈；34～43 min，38%～42%乙腈；43～49 min，42%～45%乙腈；49～64 min，45%乙腈；64～90 min，45%～70%乙腈；檢測波長為203 nm；柱溫為30 ℃；體積流量為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為15 μL；分析時間為90 min。

2.5 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式采集；掃描范圍質(zhì)荷比（/）為50～1500；低能量碰撞電壓為6 V；低能量碰撞電壓為20～60 V；毛細(xì)管電壓為3000 V；錐孔電壓為40 V；離子源溫度為120 ℃，輔助噴霧電離與去溶劑氣體為高純度N2；去溶劑化溫度500 ℃；錐孔氣體流量90 L/h；去溶劑化氣體流量800 L/h。

2.6 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗 取S1批次樣品粉末，依照“2.2”項下所述方法制備供試品溶液，并按“2.4”項下色譜條件下測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄測定結(jié)果。圖譜中第12號色譜峰響應(yīng)值相對較高，出峰較穩(wěn)定且分離度較好，故以其為參照計算其他主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果計算所得主要共有峰的相對保留時間的RSD均小于1%，相對峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜技術(shù)測定要求。

2.6.2 重復(fù)性試驗 取6份平行的S1批次樣品粉末，精密稱定，依照“2.2”項下所述方法制備供試品溶液，并按“2.4”項下色譜條件下測定，記錄測定結(jié)果，以第12號峰為參照，計算各主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果測得各共有峰相對保留時間的RSD均小于2%，相對峰面積的RSD均小于3%，表明方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜檢測要求。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 取S1批次樣品粉末，精密稱量，依照“2.2”項下所述方法制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件測定，分別于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，記錄測定結(jié)果，以第12號峰為參照，計算各主要共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果測得各主要共有峰相對保留時間的RSD均小于2%，相對峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 蒸制前后重樓HPLC指紋圖譜的建立和相似度評價

2.7.1 指紋圖譜的建立 取蒸制前后的重樓飲片共22批次粉末，依照“2.2”項下所述方法制備相應(yīng)供試品溶液，并按“2.4”項下指紋圖譜色譜條件下分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，借助Origin Pro（version 2021，美國）作圖，結(jié)果如圖1所示。

2.7.2 指紋圖譜共有模式的建立及共有峰的標(biāo)定 將指紋圖譜結(jié)果分別導(dǎo)入國家藥典委員會相似度評價軟件《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（version 2012）軟件中，分別以S1號和P1號色譜圖為參照指紋圖譜，采用中位數(shù)法，時間窗寬度設(shè)為0.8 min，經(jīng)多點校正及全譜峰匹配后分別生成11批重樓蒸制前后指紋圖譜的共有模式（圖2、3），其中重樓生品飲片共有模式圖譜主要色譜峰為13個，蒸制品共有模式圖譜共有主要色譜峰9個。

2.7.3 相似度評價[8-10]11批蒸制前后重樓指紋圖譜的相似度結(jié)果分別見表2、3，不同批次重樓生品飲片指紋圖譜與其生成對應(yīng)的對照圖譜的相似度結(jié)果均大于0.8，蒸制品與其生成對應(yīng)的對照圖譜的相似度結(jié)果亦大于0.8，分別表明11個批次的重樓生品飲片和蒸制后的重樓飲片品質(zhì)均較為一致，相對穩(wěn)定。另外，將蒸制前后重樓分別生成的共有模式圖譜分別導(dǎo)入相似度評價軟件中，計算其相似度達(dá)到99.7%，說明采用相似度評價雖能很好地單獨反映重樓生品飲片和蒸制品飲片指紋圖譜的相似程度，但從二者共有模式相似度結(jié)果并不能體現(xiàn)出蒸制前后重樓的區(qū)分性及質(zhì)量差異，采用指紋圖譜相似度評價方法無法有效區(qū)分重樓生品飲片和蒸制品飲片。盡管指紋圖譜中主要峰群的整體面貌相似，但各色譜峰響應(yīng)值仍是有區(qū)別的，因此，需要進(jìn)一步采用化學(xué)計量學(xué)可對其差別進(jìn)行分析。

圖1 22批次蒸制前后重樓HPLC指紋圖譜疊加圖

圖3 11批重樓蒸制品飲片(P1～P11)指紋圖譜及其共有模式(R)

表2 11批重樓生品飲片相似度分析結(jié)果

Table 2 Results of similarity analysis between 11 batches of crude ParidisRhizoma

樣品相似度 S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11對照指紋圖譜 S11.0000.8910.9660.9600.9090.9700.9440.9140.9650.9130.9500.965 S20.8911.0000.9130.8340.8800.9040.7840.9720.8950.9720.9610.945 S30.9660.9131.0000.9450.9360.9880.9470.9500.9960.9600.9850.994 S40.9600.8340.9451.0000.8860.9620.9780.8460.9570.8480.9090.934 S50.9090.880.9360.8861.0000.9430.8850.9140.9400.9160.9360.942 S60.9700.9040.9880.9620.9431.0000.9560.9410.9900.9420.9740.987 S70.9440.7840.9470.9780.8850.9561.0000.8180.9610.8320.8920.923 S80.9140.9720.9500.8460.9140.9410.8181.0000.9350.9940.9870.974 S90.9650.8950.9960.9570.9400.9900.9610.9351.0000.9450.9760.989 S100.9130.9720.9600.8480.9160.9420.8320.9940.9451.0000.9910.979 S110.9500.9610.9850.9090.9360.9740.8920.9870.9760.9911.0000.997 對照指紋圖譜0.9650.9450.9940.9340.9420.9870.9230.9740.9890.9790.9971.000

表3 11批重樓蒸制品飲片相似度分析結(jié)果

Table 3 Results of similarity analysis between 11 batches of steamed ParidisRhizoma

樣品相似度 P1P2P3P4P5P6P7P8P9P10P11對照指紋圖譜 P11.0000.8830.9510.8530.8810.9200.9360.8940.9430.8520.8900.940 P20.8831.0000.9140.9340.9040.9660.9190.9860.9180.9710.9870.974 P30.9510.9141.0000.8770.9170.9750.9840.9430.9960.9120.9320.977 P40.8530.9340.8771.0000.8530.9000.8520.9080.8680.9210.9220.929 P50.8810.9040.9170.8531.0000.9250.9200.9090.9230.8840.9090.940 P60.9200.9660.9750.9000.9251.0000.9800.9900.9800.9720.9820.994 P70.9360.9190.9840.8520.9200.9801.0000.9600.9920.9190.9390.977 P80.8940.9860.9430.9080.9090.9900.9601.0000.9510.9830.9920.987 P90.9430.9180.9960.8680.9230.9800.9920.9511.0000.9180.9370.979 P100.8520.9710.9120.9210.8840.9720.9190.9830.9181.0000.9930.969 P110.8900.9870.9320.9220.9090.9820.9390.9920.9370.9931.0000.984 對照指紋圖譜0.9400.9740.9770.9290.9400.9940.9770.9870.9790.9690.9841.000

2.7.4 共有特征峰的指認(rèn) 通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時間進(jìn)行定性對比，指認(rèn)出其中4個共有色譜峰，分別為重樓皂苷VII、II、I、V，而重樓皂苷VI為非共有峰，典型色譜圖見圖4。并進(jìn)一步采用“2.5”項下質(zhì)譜條件進(jìn)行HPLC-Q-TOF-MS分析，獲取共有峰的液質(zhì)聯(lián)用分析數(shù)據(jù)，并結(jié)合對照品及相關(guān)文獻(xiàn)報道[11-14]，鑒定了其中10個共有峰，結(jié)果如表4所示。

2.8 化學(xué)計量學(xué)分析

2.8.1 HCA[15-17]系統(tǒng)聚類分析能衡量數(shù)據(jù)間的相似程度，相似度越高表現(xiàn)在聚類樹狀圖上相隔愈近。分別以11批不同產(chǎn)地重樓生品飲片（編號S1～S11）和11批對應(yīng)的重樓蒸制品飲片（編號P1～P11），各主要共有峰的峰面積相對于稱樣量量化后再經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)作為識別數(shù)據(jù)集，采用SPSS（Version 26，美國）軟件分析及Origin Pro（Version 2021，美國）作圖，樣本間以組間連接法（average linkage between groups）連接，以平方歐氏距離（squared euclidean distance）作為距離系數(shù)，對數(shù)據(jù)集進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，輸出聚類熱圖（圖5）。

6-重樓皂苷VII 9-重樓皂苷II 12-重樓皂苷I 13-重樓皂苷V X-重樓皂苷VI

表4 共有峰的鑒定

Table 4 Identification of common peaks

峰號分子式準(zhǔn)分子離子峰[M＋H]+(m/z) 誤差/(×10?6)(+) MS and MSE (m/z)鑒定結(jié)果 實測值理論值 1C34H42O22803.223 21803.224 05?1.05120.081 06, 166.086 21, 803.220 50NA 2C51H62O14899.423 94899.421 233.01899.423 94, 753.365 78, 621.324 00NA 3C57H92O251 177.597 481 177.600 04?2.181 177.597 48, 885.482 78, 1 031.539 41pseudoproto Pb[11] 4C50H80O211 017.524 291 017.526 49?2.161 017.524 29, 739.425 08, 885.482 60, 577.322 69loureiroside[11] 5C24H47NO9494.332 08494.332 36?0.61494.332 08, 658.397 42, 739.225 25NA 6C51H82O211 031.539 021 031.542 14?3.021 031.539 02, 413.304 21, 395.293 50重樓皂苷VII[12-13] 7C45H72O18901.475 67901.479 14?3.86413.304 16, 353.228 54, 575.356 2412-OH-gracillin或其異構(gòu)體[12,14] 8C44H70O17871.466 42871.468 58?2.48413.304 44, 395.293 65, 575.356 93, 871.466 42重樓皂苷H[11-12] 9C51H82O201 015.543 911 015.547 22?3.261 015.543 91, 415.320 04, 723.429 64, 397.309 34重樓皂苷II[13-14] 10C50H80O201 001.528 461 001.531 57?3.111 001.528 46, 415.319 16, 723.427 69reclinatoside[11] 11C45H72O17885.480 31885.484 23?4.43415.319 05, 397.308 43, 885.480 31, 723.428 12纖細(xì)薯蕷皂苷[12] 12C44H70O16855.472 02855.473 66?1.92855.472 02, 415.321 99, 397.309 42, 723.429 54重樓皂苷I[12,14] 13C39H62O12723.428 23723.431 40?4.39397.308 29, 415.318 81, 723.428 23, 253.193 18重樓皂苷V[12-13]

NA表示尚未見報道

NA means that have not been previously reported

結(jié)果顯示，除了重樓生品飲片S5批次及對應(yīng)的蒸制品P5單獨聚為一類，另外20批次重樓飲片可分為2大類，生品飲片S1～S4和S6～S11聚為一類，蒸制品飲片P1～P4和P6～P11聚為另一類，聚類結(jié)果與重樓飲片類別基本一致，表明蒸制前后重樓飲片之間是存在質(zhì)量差異的，這與其加工炮制有關(guān)。另外，重樓生品飲片S6、S9、S7 3批樣本聚攏為一類，S10、S11、S3 2批樣本聚攏為一類，S8樣本為一類，S1、S2、S4 3批樣品聚攏為一類，再結(jié)合相似度評價結(jié)果，提示不同批次重樓生品飲片質(zhì)量存在一定差異，這可能是由于實驗購買的各批次的滇重樓藥材分別在產(chǎn)地、生長環(huán)境、采收時間存在一定差異性，而使不同批次的重樓生品飲片聚類呈交叉分布，說明重樓品質(zhì)易受到產(chǎn)地、采收時間、年限等諸多因素的影響。

圖5 重樓生品和蒸制品飲片聚類熱圖

2.8.2 PCA[18-19]PCA是可快速表征樣本的差異信息的化學(xué)計量學(xué)方法之一。在構(gòu)建生、制重樓HPLC指紋圖譜的基礎(chǔ)上，以蒸制前后各11批樣本為觀察對象（變量，編號依次為S1～S11和P1～P11），在重樓生品飲片及蒸制品飲片各自共有峰中，選取的主要共有峰（若蒸制品某一共有色譜峰在生品中未檢出，則在蒸制樣品中峰面積記為0），共計13個色譜峰（按保留時間依次編號為1號峰～13號峰），將峰面積相對于稱樣量量化后再經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)作為多元變量（變量），建立22×13的原始矩陣，采用SIMCA（Version 14.1，瑞典Umetrics公司）統(tǒng)計分析軟件以PCA on X-block模型進(jìn)行分析進(jìn)行統(tǒng)計分析，以觀察其HPLC指紋圖譜的差異性。由軟件進(jìn)行擬合后，自動提取了2個主成分，并得到代表樣本對自變量累積解釋能力模型參數(shù)2(cum)＝63.6%（＞0.4）和對因變量累積解釋能力模型參數(shù)2(cum)＝32.7%，表明PCA模型雖然能解釋63.6%變量的變化，但預(yù)測值只有32.7%，且從PCA二維得分圖（圖6）可看出，雖然運用PCA可將重樓生品飲片與蒸制品飲片基本上分為2類，但用此分類方法時，仍存在有樣品有一定的交叉。無監(jiān)督的PCA無法很好地區(qū)分組間樣本，因此，為了更加清晰地明確重樓生品和蒸制品差異性，尋求更適合本實驗的模式識別方法，將進(jìn)一步運用有監(jiān)督模式識別算法OPLS-DA，對生、蒸重樓樣品差異進(jìn)行評價。

2.8.3 OPLS-DA[20-24]在PCA的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過OPLS-DA建立判別模型，通過交叉驗證的方式自動擬合。自變量模型參數(shù)2(cum)＝97.6%（＞0.5），因變量模型參數(shù)2(cum)＝88.5%（＞0.5），表明模型穩(wěn)定性及預(yù)測力較好，且遠(yuǎn)高于PCA模型預(yù)測值；累積預(yù)測能力參數(shù)2(cum)＝75.7%（＞0.5），且2(cum)-2(cum)＜0.3（為0.128），表明預(yù)測模型具有較好的準(zhǔn)確性和可靠性。OPLS-DA得分圖見圖7、8。在得分圖中，每個點分別代表各批次樣品的均值，各個批次樣品間的差異程度可通過點對點的間隔表征。22批樣品中重樓飲片被明顯區(qū)別成2類，以中間軸為界，生品飲片聚集在左側(cè)，蒸制品聚集于右側(cè)，兩者分布于不同區(qū)域，表明蒸制前后重樓有明顯的差別。

圖6 PCA二維得分圖

圖7 OPLS-DA二維得分圖

圖8 OPLS-DA得分3D圖

除此之外，為了進(jìn)一步檢驗?zāi)Ｐ偷挠行曰驑颖鹃g是否有差異，利用SIMCA軟件對已建立OPLS- DA模型進(jìn)行200次迭代的置換檢驗（permutation test），結(jié)果如圖9所示。置換檢驗圖顯示代表模型解釋能力2、模型預(yù)測能力2均小于原始值，表明模型未過擬合，穩(wěn)健可信度較好。綜上均表明OPLS-DA更適宜作為重樓蒸制前后指紋圖譜的模式識別方法。

在載荷散點圖（圖10）中，圖中的點與色譜峰相對應(yīng)，距離中心點越遠(yuǎn)的色譜峰對區(qū)分樣品的貢獻(xiàn)作用越大。同時，基于OPLS-DA繪制反映貢獻(xiàn)率的S-plot圖（圖11），分布在右上角和左下角離原點越遠(yuǎn)的點代表區(qū)分貢獻(xiàn)度越大差異性色譜峰。為了進(jìn)一步確認(rèn)對樣品分類貢獻(xiàn)度較大的色譜峰，采用變量載荷評價參數(shù)值（VIP，圖12）進(jìn)行評價，從而輔助篩選質(zhì)量差異標(biāo)志峰，在0.95的置信區(qū)間內(nèi)，根據(jù)VIP＞1為標(biāo)準(zhǔn)篩選導(dǎo)致差異性的主要色譜峰，結(jié)合載荷圖可知色譜峰12號（重樓皂苷I，VIP＝2.40）、9號（重樓皂苷II，VIP＝1.47）、4號（loureiroside，VIP＝1.44）、5號（未知，VIP＝1.10）具有較高主成分載荷，在區(qū)分蒸制前后重樓起到重要作用，提示這4個色譜峰是有效區(qū)別重樓生品飲片和重樓蒸制品飲片的主要差異峰。

圖9 置換實驗驗證圖

圖10 OPLS-DA載荷圖

圖11 S-Plot圖

圖12 OPLS-DA模型中各共有峰的VIP值

3 討論

課題組前期已對重樓的常壓蒸制工藝以及重樓指紋圖譜供試品提取條件進(jìn)行了考察和優(yōu)化，并已通過指紋圖譜色譜條件優(yōu)化（流動相組成、梯度程序、體積流量、進(jìn)樣量等參數(shù)）和方法學(xué)考察，結(jié)果符合指紋圖譜的技術(shù)要求，確定了指紋圖譜條件穩(wěn)定可靠。

本實驗建立了重樓生品飲片及其蒸制品飲片的HPLC指紋圖譜，通過相似度評價結(jié)果及HCA結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同批次重樓生品飲片整體質(zhì)量相對穩(wěn)定，但仍存在一定差異，其品質(zhì)易受到產(chǎn)地、采收時間、年限等諸多因素的影響。另外，生品飲片與蒸制品飲片相似度較高，但可從指紋圖譜可以直觀看出，重樓生品飲片與蒸制品飲片雖然化學(xué)組成基本相同，但含量有所差異，提示重樓在蒸制過程中，某些成分可能發(fā)生了降解與轉(zhuǎn)化。同時，進(jìn)一步結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法，采用了HCA、PCA、OPLS-DA 3種模式識別方法分析重樓生品飲片和蒸制品飲片指紋圖譜差異，HCA和PCA下重樓生品飲片及其蒸制品飲片基本能聚類，但仍存在小部分交叉，而有監(jiān)督的OPLS-DA模型可有效區(qū)別2種飲片，最為適合作為重樓蒸制前后指紋圖譜的模式識別方法，并篩選出12、9、4、5號色譜峰可能是重樓蒸制前后差異的關(guān)鍵色譜峰，蒸制后4、5號色譜峰響應(yīng)值有一定程度降低，12、9號色譜峰有一定程度提高，而經(jīng)已有對照品和LC-MS分析比對，結(jié)合文獻(xiàn)分析，12、9、4號分別為重樓皂苷I、重樓皂苷II和loureiroside，5號峰目前未能指認(rèn)，后續(xù)實驗將收集更多對照品進(jìn)行比對以及結(jié)合LC-MS質(zhì)譜信息進(jìn)一步進(jìn)行指認(rèn)。

由于重樓蒸制的研究目前相對較少，其治療胃潰瘍的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚待進(jìn)一步研究，指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)可以從整體上評價生、蒸重樓飲片的質(zhì)量和明確其差異性，但由于藥效作用機(jī)制目前尚不明確，為此，后續(xù)還將進(jìn)一步開展藥效機(jī)制與內(nèi)在成分間的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典[S]. 一部. 2020: 271.

[2] 貴州苗藥興仁卷編委會. 貴州苗藥興仁卷（16開精裝本） [M]. 貴陽: 貴州民族出版社, 2014: 15.

[3] 滕建甲, 黃愛輝. 苗鄉(xiāng)采藥習(xí)俗與方法 [M]. 北京: 中醫(yī)古籍出版社, 2014, 186.

[4] 郭延生, 華永麗, 杜天璽,等. 基于化學(xué)計量學(xué)的HPLC指紋圖譜在當(dāng)歸炮制品質(zhì)量控制和識別中的應(yīng)用 [J]. 中國中藥雜志, 2010, 35(12): 1551-1555.

[5] 張景麗, 羅霞, 鄭林用, 等. 運用色譜指紋圖譜與化學(xué)計量學(xué)方法對靈芝進(jìn)行分類 [J]. 色譜, 2009, 27(6): 776-780.

[6] 蘇靜華, 張超, 孫磊, 等. 指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)用于香櫞品種鑒別的可行性分析 [J]. 中國中藥雜志, 2015, 40(12): 2318-2324.

[7] 張敏, 李瑋, 黃穎雪, 等. 加格略(重樓)蒸制前后HPLC 指紋圖譜對比研究 [J]. 貴州科學(xué), 2020, 38(4): 38-41.

[8] 譚樹慧, 任衛(wèi)瓊, 劉月新, 等. 不同產(chǎn)地生/醋炙烏藥指紋圖譜的建立及模式識別研究 [J]. 藥物分析雜志, 2018, 38(10): 1803-1809.

[9] 周冰倩, 高喜梅, 楊穎,等. 不同來源竹茹藥材HPLC指紋圖譜和化學(xué)計量學(xué)分析 [J]. 中草藥, 2022, 53(3): 853-857.

[10] 趙宏蘇, 趙茹, 喬金為,等. 基于指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別綠萼梅質(zhì)量標(biāo)志物的評價研究 [J]. 中草藥, 2022, 53(5): 1345-1353.

[11] Kang L P, Yu K T, Zhao Y,. Characterization of steroidal glycosides from the extract ofvar.by UPLC/Q-TOF MSE [J]., 2012, 62: 235-249.

[12] 黃圓圓. 15種重樓屬植物根莖的化學(xué)成分分析 [D]. 合肥: 安徽中醫(yī)藥大學(xué), 2018.

[13] Su F, Ye L, Zhou Z L,. Study of chemical compositions and anticancer effects ofvar.leaves [J]., 2022, 27(9): 2724.

[14] Qiao X, Qu C, Luo Q M,. UHPLC-qMS spectrum- effect relationships forextracts [J]., 2021, 194: 113770.

[15] 黃紫炎, 沈錢能, 李平,等.不同產(chǎn)地葛根飲片的UPLC指紋圖譜結(jié)合多成分含量測定研究 [J]. 中國中藥雜志, 2019, 44(10): 2051-2058.

[16] 何翠敏, 黃偉斌, 邱雨,等. 基于HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別分析相思子葉質(zhì)量 [J]. 中成藥, 2021, 43(6): 1521-1525.

[17] 劉興勇, 邵金良, 陳興連, 等. 不同陳化年限普洱茶HPLC指紋圖譜及年份判別 [J]. 分析試驗室, 2015, 34(10): 1159-1163.

[18] 韓忠耀, 曹芳, 江品良,等. 基于高效液相色譜指紋圖譜和化學(xué)模式識別法評價不同采收期水冬瓜樹皮藥材質(zhì)量 [J]. 理化檢驗: 化學(xué)分冊, 2021, 57(3): 204-209.

[19] 郭麗, 楊忠杰, 于曉濤, 等. 南、北五味子藥材的HPLC指紋圖譜建立及化學(xué)模式識別分析 [J]. 中國藥房, 2020, 31(18): 2224-2229.

[20] Ma Q D, Chen X X, Zhang K,. Chemical fingerprint analysis for discovering markers and identifyingby HPLC coupled with OPLS-DA [J]., 2020, 2020: 7560710.

[21] 張夢晨, 謝輝, 陸兔林,等.基于指紋圖譜、化學(xué)計量學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的半夏湯洗前后質(zhì)量評價 [J]. 中草藥, 2021, 52(10): 2897-2908.

[22] 石麗霞, 李科, 秦雪梅, 等. 基于糖特征圖譜的不同柴胡的品種鑒別 [J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2020, 55(12): 2968-2975.

[23] 郭威, 孫蓉, 王亮,等. 基于指紋圖譜和OPLS-DA的越南和國產(chǎn)土茯苓差異性化合物探索 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2017, 23(14): 62-67.

[24] 荊文光, 郭曉晗, 李楚, 等. 基于質(zhì)量源于生產(chǎn)的廣藿香質(zhì)量標(biāo)志物的確立 [J]. 中草藥, 2021, 52(15): 4496- 4506.

HPLC fingerprint analysis of crude and steamed(jab gib liod) based on chemometrics

XIONG Rui1, WU Juan1, ZHANG Xing-xing1, YANG Yu-ting1, WU Shan-shan1, WANG Jian-ke1, LI Wei1, HU Chang-jiang2

1. College Pharmacy, Guizhou University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China 2. College Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To establish the HPLC fingerprint of Chonglou () before and after steaming processing, and to evaluate the difference between processed products by chemometrics.The chromatographic fingerprint analysis was carried out respectively by HPLC, and the common pattern was conducted by similarity evaluation. In addition, for quality evaluation, the results were taken to perform the chemometric analyses, such as hierarchical cluster analysis (HCA), principal component analysis (PCA) and orthogonal partial least square-discriminant analysis (OPLS-DA), by using SIMCA 14.1, SPSS 26, and other software.The similarity evaluation results indicated that the crudeand the steamedcould have high similarity. The HCA and PCA results showed the processed products could be basically cluster separately, but there was still crossover. The applied OPLS-DA results showed the processed products could be ideally classified by five characteristic peaks (12-chonglou saponin I, 9-chonglou saponin II, 4-loureiroside, 5-unknown). These chromatographic peaks can be used as potential key quality markers for the difference before and after steaming.The establishment of HPLC fingerprint combined with chemometrics could be considered as a comprehensive reference and powerful strategy for quality evaluation ofand lay the foundation for the further clinical medicine research of ethnic medicine processing.

(jab gib liod); steaming processing; fingerprint; chemometrics; orthogonal partial least square discriminant analysis; hierarchical cluster analysis; principal component analysis; chonglou saponin I; chonglou saponin II; loureiroside

R283.6

A

0253 - 2670(2022)18 - 5663 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.009

2022-03-30

2020年度貴州省中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專項課題（QZYY-2020-011）；2020年貴州省教育廳自然科學(xué)研究項目（黔教合KY字[2021]200）；2021年度貴州省基礎(chǔ)研究項目（自然科學(xué)類）（黔科合基礎(chǔ)-ZK[2022]一般496）；貴州中醫(yī)藥大學(xué)博士啟動基金項目（2019[48]號）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81773899）

熊 瑞（1991—），女，講師，主要從事中藥、民族藥炮制工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及炮制原理研究。E-mail: rui342296918@163.com

李 瑋（1964—），男，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制學(xué)的教學(xué)和科研工作。E-mail: 3158433860@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]