郁 萌，侯文成，馮 劍，陳 蘭，楊 云，劉洋洋*，魏建和*

結(jié)合非靶向代謝組學(xué)和指紋圖譜對(duì)通體結(jié)香技術(shù)產(chǎn)沉香與野生沉香化學(xué)成分的比較分析

郁 萌1, 2，侯文成1，馮 劍1，陳 蘭1，楊 云1，劉洋洋1, 2*，魏建和1, 2*

1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所海南分所，海南省南藥資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局沉香可持續(xù)利用重點(diǎn)研究室，海南 ?？?570311 2. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，瀕危藥材繁育國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

系統(tǒng)全面分析比較通體結(jié)香技術(shù)產(chǎn)沉香（簡(jiǎn)稱(chēng)通體香）與野生沉香化學(xué)成分，為通體結(jié)香技術(shù)進(jìn)一步的應(yīng)用和推廣提供科學(xué)可靠的依據(jù)。采用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q/TOF-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）結(jié)合非靶向代謝組學(xué)和指紋圖譜，對(duì)通體香與野生沉香的乙醇提取物和揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。16批通體香與16批野生沉香的共有成分相同，但通體香指紋圖譜相似度較高，且4個(gè)倍半萜、3個(gè)小分子芳香物質(zhì)和8個(gè)2-(2-苯乙基)色酮等共17個(gè)共有成分在通體香中含量較高。通體香和野生沉香主要化學(xué)成分組成相同，但不同批次間通體香的質(zhì)量更穩(wěn)定。

沉香；通體結(jié)香技術(shù)；2-(2-苯乙基)色酮；非靶向代謝組學(xué)；指紋圖譜；2,4-二叔丁基苯酚；6,7-二甲基-1,2,3,5,8,8a-六氫萘；去氫蜂斗菜酮

沉香為名貴香藥，《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定其為瑞香科植物白木香(Lour.) Gilg含有樹(shù)脂的木材[1]。自然情況下，白木香樹(shù)須受到外界傷害后，在其生長(zhǎng)過(guò)程中緩慢形成沉香[2]。為了減少對(duì)野生沉香資源的依賴(lài)，我國(guó)從20世紀(jì)90年代就開(kāi)始大力發(fā)展白木香種植，并探索人工結(jié)香方法。其中，魏建和等[3]發(fā)明的通體結(jié)香技術(shù)已成為目前我國(guó)乃至全世界范圍內(nèi)主要沉香產(chǎn)區(qū)應(yīng)用最廣泛的沉香結(jié)香技術(shù)。李浩洋等[4]對(duì)10批通體結(jié)香技術(shù)所產(chǎn)沉香（簡(jiǎn)稱(chēng)通體香）的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，認(rèn)為通體香的質(zhì)量符合《中國(guó)藥典》的規(guī)定，可代替野生沉香入藥。相關(guān)研究證明通體香對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的止嘔[5]、保肝[6]、抗心肌缺血[7]、抗胃潰瘍[8]和抗結(jié)腸炎[9]等作用與野生沉香相當(dāng)或優(yōu)于野生沉香。Li等[10]采用UPLC-Q/TOF-MS結(jié)合多元變量統(tǒng)計(jì)分析初步發(fā)現(xiàn)通體香和野生沉香中6,7-二甲氧基- 2-(2-苯乙基)色酮等14個(gè)2-(2-苯乙基)色酮類(lèi)成分在含量上存在一定差異。而劉洋洋[11]研究發(fā)現(xiàn)通體香乙醇提取物中主要成分為2-(2-苯乙基)色酮類(lèi)化合物（圖1），其揮發(fā)性成分主要為倍半萜類(lèi)化合物和小分子芳香物質(zhì)。已有研究尚未從全化學(xué)組成角度分析比較通體香與野生沉香化學(xué)成分的差異。

為了系統(tǒng)全面地分析和評(píng)價(jià)通體香藥材質(zhì)量，本研究收集我國(guó)沉香2大主要產(chǎn)區(qū)海南和廣東的具有代表性的通體香和野生沉香樣品，采用超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q/TOF- MS）和氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）分析沉香化學(xué)成分，基于中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)方法和非靶向代謝組學(xué)方法對(duì)通體香與野生沉香的化學(xué)成分進(jìn)行比較分析，從而評(píng)價(jià)通體香與野生沉香化學(xué)成分的組成差異，以期為通體結(jié)香技術(shù)的推廣以及通體香在醫(yī)藥和大健康產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

圖1 2-(2-苯乙基)色酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)

1 材料、儀器與試劑

1.1 材料

32批沉香樣品詳細(xì)信息見(jiàn)表1。其中16批為通體香樣品，16批為野生沉香樣品，所有樣品經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所海南分所劉洋洋研究員鑒定為瑞香科植物白木香(Lour.) Gilg含有樹(shù)脂的木材。

表1 樣品信息

Table 1 Information of samples

序號(hào)來(lái)源分類(lèi)序號(hào)來(lái)源分類(lèi) tt1廣東茂名通體香ys1海南五指山野生沉香 tt2廣東化州通體香ys2海南定安野生沉香 tt3廣東茂名通體香ys3海南定安野生沉香 tt4廣東湛江通體香ys4市售（購(gòu)買(mǎi)地廣東江門(mén)）野生沉香 tt5廣東湛江通體香ys5市售（購(gòu)買(mǎi)地廣東江門(mén)）野生沉香 tt6廣東化州通體香ys6市售（購(gòu)買(mǎi)地廣東江門(mén)）野生沉香 tt7廣東化州通體香ys7廣東化州野生沉香 tt8廣東電白通體香ys8廣東化州野生沉香 tt9廣東化州通體香ys9海南定安野生沉香 tt10海南瓊中通體香ys10海南定安野生沉香 tt11海南?？谕w香ys11海南定安野生沉香 tt12海南海口通體香ys12海南定安野生沉香 tt13海南定安通體香ys13市售（購(gòu)買(mǎi)地廣東江門(mén)）野生沉香 tt14海南瓊中通體香ys14海南定安野生沉香 tt15海南儋州通體香ys15海南定安野生沉香 tt16海南儋州通體香ys16市售（購(gòu)買(mǎi)地廣東江門(mén)）野生沉香

1.2 儀器

ASE 350型加速溶劑萃取儀（賽默飛世爾科技有限公司）；7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，安捷倫科技有限公司）；Xevo G2-XS型超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國(guó)沃特世科技有限公司）。

1.3 試劑

硅藻土（賽默飛世爾科技有限公司，粒徑大于三號(hào)篩），乙腈（賽默飛世爾科技有限公司，質(zhì)譜純），屈臣氏蒸餾水，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 UPLC-Q/TOF-MS分析方法

2.1.1 樣品溶液制備 精密稱(chēng)取沉香樣品粉末0.1 g，加50%乙醇10 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（40 kHz，600 W）提取30 min，靜置、冷卻，稱(chēng)定質(zhì)量，用50%乙醇補(bǔ)足質(zhì)量，取上清液作為UPLC分析用樣品溶液，待用。從以上32個(gè)樣品溶液中各取200 μL混合，制成質(zhì)控樣品[12]。

2.1.2 分析條件 采用UPLC-Q/TOF-MS分析32個(gè)樣品溶液，每6個(gè)樣品間插入1個(gè)質(zhì)控樣品。

（1）UPLC色譜條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×3 mm，1.7 μm），流動(dòng)相乙腈（A）-水（B）梯度洗脫（0～20 min，20%～50%A；20～30 min，50%～100%A），體積流量0.25 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量2 μL。

（2）質(zhì)譜條件：Q/TOF-MS采用電噴霧電離源（ESI）在正離子模式下以MSE模式采集，掃描范圍/100～1500，采用亮氨酸-腦啡肽（/556.277 1 [M＋H]+）實(shí)時(shí)校正。毛細(xì)管電離電壓3.0 kV；錐孔電壓40 V；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑N2體積流量600 L/h；錐孔反吹N2體積流量50 L/h。低能量掃描無(wú)碰撞能，高能量MSE模式掃描碰撞能35～45 eV，碰撞氣為氬氣。

2.2 GC-MS分析方法

2.2.1 樣品溶液制備 精密稱(chēng)取0.1 g沉香樣品粉末，與適量的硅藻土研磨混勻，裝入34 mL不銹鋼萃取池中，以硅藻土填滿(mǎn)萃取池，置于加速溶劑萃取儀中。加速溶劑萃取儀以水為提取劑，加熱溫度120 ℃，靜態(tài)時(shí)間5 min，沖洗體積為萃取池體積的30%，循環(huán)2次。所得提取液用5 mL正己烷萃取，制得GC-MS分析用樣品溶液，待用。從32個(gè)樣品溶液中各取200 μL混合，制成質(zhì)控樣品[12]。

2.2.2 分析條件 采用GC-MS以液體進(jìn)樣方式分析32個(gè)樣品溶液，記錄TIC圖。每6個(gè)樣品間插入1個(gè)質(zhì)控樣品。

（1）色譜條件：色譜柱為HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30 m×250 μm），進(jìn)樣口溫度240 ℃；柱溫50 ℃保持1 min，以15 ℃/min至140 ℃并保持8 min；以1 ℃/min至155 ℃并保持8 min；以10 ℃/min至175 ℃并保持7.5 min；以5 ℃/min至200 ℃并保持9.5 min；最后以20 ℃/min至260 ℃并保持5 min。進(jìn)樣量1 μL。

（2）質(zhì)譜條件：EI離子源，離子阱溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，接口溫度260 ℃，質(zhì)量范圍/50～300。

2.3 共有峰分析

將16批通體香和16批野生沉香樣品的GC-MS總離子流和UPLC-Q/TOF-MS基峰圖（BPC，base peak chromatogram）分別導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件》（2012版），以質(zhì)控樣品Q(chēng)C指紋圖譜為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.5 s，經(jīng)多點(diǎn)校正、自動(dòng)匹配后，分別生成通體香的GC-MS、UPLC-Q/TOF-MS指紋圖譜和野生沉香GC-MS、UPLC-Q/TOF-MS指紋圖譜，并依次提取共有峰。

2.4 多元變量統(tǒng)計(jì)分析

采用MS-DIAL軟件[13]對(duì)GC-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、識(shí)別、對(duì)齊、歸一化、尺度化和缺失值填充等數(shù)據(jù)預(yù)處理，采用Waters Progenesis QI軟件[14]對(duì)UPLC-Q/TOF-MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、識(shí)別、對(duì)齊、歸一化、尺度化和缺失值填充等數(shù)據(jù)預(yù)處理，并分別輸出每個(gè)樣品標(biāo)準(zhǔn)化后得到的保留時(shí)間、精確質(zhì)荷比和峰面積組成的三維數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入至SIMCA 14.0軟件分別對(duì)GC-MS和UPLC-Q/TOF- MS數(shù)據(jù)進(jìn)行多元變量統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 指紋圖譜方法學(xué)考察

3.1.1 精密度試驗(yàn) 精密稱(chēng)取質(zhì)控樣品，分別按“2.1.1”和“2.2.1”項(xiàng)下方法制得樣品溶液，并分別按“2.1.2”和“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次。UPLC-Q/TOF-MS以2號(hào)峰為參照峰、GC-MS以3號(hào)峰為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值分別小于0.59%和3.30%、0.079%和2.49%，表明儀器精密度良好。

3.1.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取質(zhì)控樣品6份，分別按“2.1.1”和“2.2.1”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，并分別按“2.1.2”和“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，UPLC-Q/TOF-MS以2號(hào)峰為參照峰、GC-MS以3號(hào)峰為參照峰計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值分別小于0.93%和3.51%、0.084%和2.54%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱(chēng)質(zhì)控樣品，分別按“2.1.1”和“2.2.1”項(xiàng)下方法制得樣品溶液，并分別按“2.1.1”和“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣，UPLC-Q/TOF-MS以2號(hào)峰為參照峰、GC-MS以3號(hào)峰為參照峰計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD值分別小于0.76%和3.74%、0.05%和2.33%，表明24 h內(nèi)樣品溶液在室溫下的穩(wěn)定性良好。

3.2 指紋圖譜的建立及共有峰分析

采用UPLC-Q/TOF-MS對(duì)16批通體香和16批野生沉香50%乙醇提取物的化學(xué)成分指紋圖譜進(jìn)行分析，見(jiàn)圖2。結(jié)果表明16批通體香樣品之間相似度為0.598～0.869，而16批野生沉香樣品間的相似度僅為0.092～0.815，可見(jiàn)16批通體香醇提物化學(xué)成分的相似度較16批野生沉香醇提物化學(xué)成分相似度大。同時(shí)，基于MSE質(zhì)譜采集模式高能量場(chǎng)得到的碎片離子信息，并參考已有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)[10, 15-16]確認(rèn)了2-(2-苯乙基)色酮類(lèi)化合物色酮部分（A環(huán)）和苯乙基部分（B環(huán)）取代基的類(lèi)型和數(shù)目，進(jìn)而指認(rèn)了32個(gè)2-(2-苯乙基)色酮類(lèi)化合物，見(jiàn)表2。

根據(jù)指紋圖譜共有峰分析結(jié)果可知，通體香的UPLC-Q/TOF-MS指紋圖譜共有峰（RLC-tt，圖3-A）和野生沉香的UPLC-Q/TOF-MS指紋圖譜共有峰（RLC-ys，圖3-B）均為24個(gè)。可見(jiàn)，通體香和野生沉香50%乙醇提取物的主要化學(xué)成分一致，均為2-(2-苯乙基)色酮類(lèi)成分，且根據(jù)分子離子峰的相對(duì)豐度比較，各成分在通體香中的含量均高于野生沉香。

采用GC-MS分析16批通體香和16批野生沉香的揮發(fā)性成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16批通體香樣品之間相似度為0.846～0.995，16批野生沉香樣品間的相似度僅為0.393～0.974，可見(jiàn)16批通體香揮發(fā)性成分的相似度較16批野生沉香揮發(fā)性成分相似度大。

圖2 通體香(I) 和野生沉香(II) 的GC-MS (A) 和UPLC-Q/TOF-MS (B) 指紋圖譜

表2 通體香和野生沉香UPLC-Q/TOF-MS共有成分及差異化合物信息

Table 2 Overview of common compounds and potential markers from agarwood induced by Agar-Wit and natural agarwood analyzed in UPLC-Q/TOF-MS total ion chromatograms common models fingerprint

序號(hào)tR/min[M＋H]+誤差（×10?6）MSE碎片離子峰取代基分子式類(lèi)型名稱(chēng)差異成分A環(huán)B環(huán) 1*5.06340.259 0 未鑒定 2*5.37319.118 20301.108 0, 283.096 8, 255.102 04×OH C17H18O6THPEC2-(2-phenylethyl)-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone（isomer） 3*5.55407.790 8 未鑒定 4*6.04319.118 0?0.6301.108 9, 283.096 8, 255.105 44×OH C17H18O6THPEC2-(2-phenylethyl)-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone（isomer） 5*6.30319.118 0?0.6301.108 4, 283.096 5, 255.101 94×OH C17H18O6THPEC2-(2-phenylethyl)-5,6,7,8-tetrahydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone（isomer） 6*8.58329.102 3?0.6301.107 8, 301.107 8, 137.059 82×-O-OH; OCH3C18H16O6DEPECoxidoagarochromone C（isomer） 7*11.81331.117 2?3.0313.107 3, 285.112 0, 121.064 92×OH; -O-OCH3C18H18O6EPEC2-[2-(4'-methoxyphenyl)ethyl]-6,7-epoxy-5,8-dihydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone（isomer） 8*12.04301.109 04.6283.097 8, 255.103 8, 227.109 12×OH; -O- C17H16O5EPEC2-(2-phenylethyl)-6,7-epoxy-5,8-dihydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone（isomer） 9*14.33313.107 60283.112 5, 257.120 1, 121.068 52×-O-OCH3C18H16O5DEPECoxidoagarochromone B（isomer）L1 10*14.69283.097 10.3255.102 0, 227.107 1, 192.042 02×-O- C17H14O4DEPECoxidoagarochromone A（isomer）L2 11*17.47297.113 83.7137.060 0 OH; OCH3C18H16O4FTPEC2-[2-(2′-hydroxy-4′-methoxyphenyl)ethyl]chromone（isomer） 12*17.47327.123 20191.071 0, 137.059 9OCH3OH; OCH3C19H18O5FTPEC6-methoxy-2-[2-(3′-hydroxy-4′-methoxyphenyl)ethyl]chromone（isomer） 13*17.72327.123 40.6191.070 6, 137.060 2OCH3OH; OCH3C19H18O5FTPEC6-methoxy-2-[2-(3′-hydroxy-4′-methoxyphenyl)ethyl]chromone（isomer） 14*18.08297.113 83.7137.060 0 OH; OCH3C18H16O4FTPEC2-[2-(2′-hydroxy-4′-methoxyphenyl)ethyl]chromone（isomer） 15*19.06297.112 70137.060 6 OH; OCH3C18H16O4FTPEC2-[2-(2′-hydroxy-4′-methoxyphenyl)ethyl]chromone（isomer） 16*19.71267.102 72.2137.023 9, 176.047 4OH C17H14O3FTPEC2-[2-(4′-methoxyphenyl)ethyl]chromone（isomer）L3 17*20.94341.139 10.6121.069 12×OCH3OCH3C20H20O5FTPEC6,7-dimethoxy-2-[2-(4′-methoxyphenyl)ethyl]chromone（isomer）L4 18*21.61311.128 50.6121.067 8OCH3OCH3C19H18O4FTPEC6-methoxy-2-[2-(4′-methoxyphenyl)ethyl]chromone（isomer）L5 19*24.16251.107 61.6173.060 1, 121.029 3 C17H14O2FTPEC2-(2-phenylethyl)chromoneL6 20*24.47311.128 10.6121.065 0OCH3OCH3C19H18O4FTPEC6-methoxy-2-[2-(4′-methoxyphenyl)ethyl]chromone（isomer）L7 21*24.88281.117 90.3121.069 2 OCH3C18H16O3FTPEC2-[2-(4'-methoxyphenyl)ethyl]chromone（isomer）L8 22*25.14233.154 5 未鑒定 23*25.40255.154 6 未鑒定 L9 24*26.55549.191 1?0.3531.183 4, 458.136 8, 440.126 0; 283.097 5 C34H28O7PEC dimers 259.26301.107 60283.097 4, 255.102 52×OH; -O- C18H16O5DEPEC2-(2-phenylethyl)-6,7-epoxy-5,8-dihydroxy-5,6,7,8-tetrahydrochromone（isomer） 2610.93367.094 5?0.8349.084 2, 331.118 2, 313.107 63×OH; ClOCH3C18H20ClO6THPEC8-chloro-5,6,7-trihydroxy-5,6,7,8-tetrahydro-2-[2-(4′-methoxyphenyl)ethyl]chromone（isomer）

續(xù)表2

序號(hào)tR/min[M＋H]+誤差（×10?6）MSE碎片離子峰取代基分子式類(lèi)型名稱(chēng)差異成分 A環(huán)B環(huán) 279.82361.129 72.8137.060 7-O-; OH; OCH3OH; OCH3C19H21O7EPEC2-[2-(3′-hydroxy-4′-methoxyphenyl)ethyl]-7,8-epoxy-5-methoxy-6-hydroxy-5,6,7,8- tetrahydrochromone（isomer） 2811.24337.084 1?0.6319.073 7, 301.062 6, 283.096 73×OH; Cl C17H18ClO5THPEC8-chloro-5,6,7-trihydroxy-5,6,7,8-tetrahydro-2-(2-phenylethyl)chromone（isomer） 2912.42313.107 70.3285.112 8 OCH3C18H16O5DEPECoxidoagarochromone B（isomer） 3016.75267.102 51.5189.073 3, 176.047 5OH C17H14O3FTPEC2-[2-hydroxy-2-(2-phenylethyl)]chromone（isomer） 3116.05267.102 10173.056 2, 161.059 9 OHC17H14O3FTPEC2-[2-(3′-hydroxyphenyl)ethyl]chromone（isomer） 3216.69297.113 01.0137.060 5 OH; OCH3C18H16O4FTPEC2-[2-(2′-hydroxy-4′-methoxyphenyl)ethyl]chromone（isomer） 3317.11297.112 90.7137.059 6 OH; OCH3C18H16O4FTPEC2-[2-(2′-hydroxy-4′-methoxyphenyl)ethyl]chromone（isomer） 3418.34327.125 77.6137.059 3OCH3OH; OCH3C19H18O5FTPEC6-methoxy-2-[2-(3′-hydroxy-4′-methoxyphenyl) ethyl]chromone（isomer） 3523.57281.117 4?1.4151.039 3OCH3 C18H16O3FTPEC6-methoxy-2-(2-phenylethyl)chromone（isomer） 3625.88297.112 90.7206.057 5, 191.034 5, 167.034 6OH; OCH3 C18H16O4FTPEC6-hydroxy-7-methoxy-2-(2-phenylethyl)chromone（isomer）

DEPEC-雙氧環(huán)四氫色酮 EPEC-單氧環(huán)四氫色酮 THPEC-四羥基四氫2-(2-苯乙基)色酮 FTPEC-簡(jiǎn)單2-(2-苯乙基)色酮 PEC dimers-2-(2-苯乙基)色酮二聚體；“*”為指紋圖譜共有成分；L1～L9代表顯著差異性成分

DEPEC-diepoxy-2-(2-phenylethyl)chromones EPEC-epoxy-2-(2-phenylethyl)chromones THPEC-5,6,7,8-tetrahydro-2-(2-phenylethyl)chromones FTPEC-flindersia type 2-(2-phenylethyl)chromones PEC dimers 2-(2-phenylethyl)chromone dimers;“*”the common components in the fingerprint；L1—L9 represent significantly different components

圖中編號(hào)與表2對(duì)應(yīng)

根據(jù)指紋圖譜共有峰分析結(jié)果可知，通體香的GC-MS指紋圖譜共有峰（RGC-tt，圖4-A）和野生沉香的GC-MS指紋圖譜共有峰（RGC-ys，圖4-B）均為32個(gè)。通過(guò)檢索NIST17譜庫(kù)并結(jié)合已有文獻(xiàn)對(duì)共有峰進(jìn)行解析，指認(rèn)了其中20個(gè)共有成分，見(jiàn)表3。包括9個(gè)倍半萜類(lèi)化合物、8個(gè)小分子芳香化合物、2個(gè)2-(2-苯乙基)色酮類(lèi)化合物以及1個(gè)酚酸類(lèi)化合物。由此可見(jiàn)，通體香和野生沉香含有的主要揮發(fā)性成分一致。

圖中編號(hào)與表3對(duì)應(yīng)

3.3 差異性分析

為了進(jìn)一步探究通體香和野生沉香化學(xué)組成的差異，采用有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）模型分析數(shù)據(jù)。結(jié)合OPLS-DA模型與獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，根據(jù)VIP值、S-Plot（即PC1方差貢獻(xiàn)率（p[1]）和變量相關(guān)系數(shù)（p(corr)[1]）以及值（閾值0.05）篩選差異變量。

根據(jù)32批沉香樣品的UPLC-Q/TOF-MS分析結(jié)果，以VIP值＞8、分布在S-plot左下角（p[1]＜?0.1且p(corr)[1]＜?0.5）以及＜0.05為篩選條件（圖5-A），得到9個(gè)顯著差異性成分L1～L9，其中，L1和L2屬于三元氧環(huán)四氫色酮（DEPECs），L3、L4、L5、L6、L7以及L8屬于2-(2-苯乙基)色酮（FTPECs）。但是由表2可知，該9個(gè)成分均為通體香和野生沉香UPLC-Q/TOF-MS指紋圖譜中的共有成分，且從S-plot圖（圖5）可發(fā)現(xiàn)，L1～L9等9個(gè)差異成分均位于X軸負(fù)半軸，表明其在通體香中的含量均顯著高于野生沉香。根據(jù)32批沉香樣品的GC-MS分析結(jié)果，以VIP值＞1且分布在S-plot左下角（p[1]＜?0.07且p(corr)[1]＜?0.15）和右上角（p[1]＞0.045且p(corr)[1]＞0.5）以及＜0.05為篩選條件（圖5-B），得到12個(gè)顯著差異性成分G1～G12，包括3個(gè)小分子芳香化合物（G1、G2、G5）、5個(gè)倍半萜類(lèi)化合物（G4、G7～G10）、2個(gè)2-(2-苯乙基)色酮類(lèi)化合物（G11、G12）、1個(gè)烯烴類(lèi)（G6）以及1個(gè)酚酸類(lèi)化合物（G3），其中顯著差異性成分2-(2-苯乙基)色酮（G15）與UPLC-Q/TOF-MS分析所得顯著差異性成分2-(2-苯乙基)色酮（L6）相同。但是由表3可知，該12個(gè)成分均為通體香和野生沉香GC指紋圖譜中的共有成分，且從S-plot圖（圖5）可發(fā)現(xiàn)，2,4-二叔丁基苯酚（G3）、6,7-二甲基- 1,2,3,5,8,8a-六氫萘（G6）、以及去氫蜂斗菜酮（G7）等3個(gè)成分在野生沉香中的含量顯著高于通體香，其余9個(gè)成分在通體香中的含量均顯著高于野生沉香。

表3 通體香和野生沉香GC-MS指紋圖譜已鑒定共有成分及差異化合物信息

Table 3 Overview of identified common compounds and potential markers from agarwood induced by Agar-Wit and natural agarwood analyzed in GC-MS total ion chromatograms common models’ fingerprint

峰號(hào)tR/min化合物名稱(chēng)碎片離子 (m/z)匹配度分子式差異成分 16.02苯甲醛105.1, 77.1, 51.198.3C7H6OG1 39.75芐基丙酮148.1, 105.1, 91.1, 43.199.3C10H12OG2 510.744-甲氧基苯甲醛135.0, 77.0, 63.096.0C8H8O2 715.152,4-二叔丁基苯酚206.0, 191.0, 57.095.5C14H22OG3 818.51α-檀香醇206.0, 191.0, 57.080.1C15H24OG4 920.624-(4-甲氧基苯基)-2-丁酮178.0, 121.0, 43.093.8C11H14O2G5 1021.75沉香螺旋醇204.2, 161.1, 119.1, 59.193.1C15H26O 1122.57(–)-馬兜鈴烯161.1, 105.191.190.1C15H24 1223.422-((2R,8R,8aS)-8,8a-二甲基-1,2,3,4,6,7,8,8a-八氫萘-2-甲基)異丙基-2-醇204.2, 161.1, 59.190.7C15H26O 1323.96(4aS,8R)-4a,8-二甲氧基-4,4a,5,6,7,8-六氫萘-2(3H)-酮136.1, 121.0, 107.185.5C12H18O 1426.121,3-二(1-甲基乙基)苯162.0, 147.0, 105.0, 59.080.9C12H18 1526.656,7-二甲基-1,2,3,5,8,8a-六氫萘162.2, 147.1, 59.196.4C12H14O4G6 1940.32(4aR-cis)-4,4a,5,6,7,8-六氫-4a,5-二甲基-3-(1-甲基亞乙基)-2(3H)-萘175.0, 161.0, 147.089.0C15H22O 2143.08[3S-(3α,4aα,5α)]-3,4,4a,5,6,7-六氫-4a,5-二甲基-3-(1-甲基乙烯基)-1(2H)-萘177.1, 147.0, 91.179.9C15H22OG7 2653.68(4aR,5S)-1-羥基-4a,5-二甲基-3-亞丙基-4,4a,5,6-四氫萘-2(3H)-酮232.2, 217.0, 91.1, 77.183.1C15H20O2G8 2753.945,8-二羥基-4a-甲基-4,4a,4b,5,6,7,8,8a,9,10-十氫-2(3H)-菲酮185.2, 105.1, 91.182.0C15H22O3G9 2957.88(2aS,3aR,5aS,9bR)-2a,5a,9-三甲基-2a,4,5,5a,6,7,8,9b-八氫-2H-萘并 [1,2-b]環(huán)氧基[2,3-c]呋喃261.0, 105.0, 91.067.9C15H22O2G10 3067.022,2′-亞甲基雙[6-(1,1-二甲基乙基)-4-甲基苯酚340.0, 177.0, 161.097.0C23H32O2 3168.022-(2-苯乙基)色酮250.1, 91.194.7C17H14O2G11 3272.436-甲氧基-2-(2-苯乙基)色酮280.0, 91.083.4C18H16O3G12

G1～G12代表顯著差異性成分

G1-G12 represent significantly different components

圖5 通體香和野生沉香UPLC-Q/TOF-MS和GC-MS的S-Plot圖

將以上20個(gè)差異成分導(dǎo)入到Metaboanalyst軟件中繪制熱圖，距離度量方法為皮爾森積矩相關(guān)系數(shù)，聚類(lèi)方法為平均連接法，結(jié)果見(jiàn)圖6，通體香和野生沉香各聚為一類(lèi)?？梢?jiàn)，20個(gè)差異成分可以區(qū)分通體香和野生沉香，即通體香和野生沉香組間化學(xué)成分的差異遠(yuǎn)大于其組內(nèi)差異。通過(guò)熱圖的顏色變化發(fā)現(xiàn)，除了揮發(fā)性成分中G3、G6和G7在野生沉香中的含量顯著高于通體香，其余17個(gè)成分在通體香中的含量均顯著高于野生沉香，且具有顯著差異的2-(2-苯乙基)色酮類(lèi)化合物均在通體香中具有較高的含量。

4 討論

4.1 樣品前處理方法的選擇

本研究在UPLC-Q/TOF-MS的樣品前處理過(guò)程中對(duì)不同濃度甲醇溶液和乙醇溶液的熱回流提取效果進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，50%乙醇溶液和無(wú)水甲醇的提取效果較好，但采用無(wú)水甲醇溶解待測(cè)樣品時(shí)對(duì)其極性較大成分有溶劑效應(yīng)，導(dǎo)致在UPLC上分離度較差。因此，本研究選擇50%乙醇溶液進(jìn)行熱回流作為UPLC-Q/TOF-MS的樣品前處理方式。此外，本研究GC-MS的樣品前處理采用了加速溶劑萃取法代替水蒸氣蒸餾法，以水作為提取溶劑，通過(guò)提高溫度與壓力，在120 ℃提取沉香揮發(fā)性成分，可實(shí)現(xiàn)名貴藥材沉香的微量取樣，及其揮發(fā)性成分的高效、標(biāo)準(zhǔn)化提取。

4.2 通體香與野生沉香的主要化學(xué)成分相同

中藥指紋圖譜是采用一定分析手段得到的反應(yīng)該中藥主要化學(xué)成分的共有峰圖譜，作為一種半定量鑒別手段，常用于中藥質(zhì)量控制[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，通體香和野生沉香UPLC-Q/TOF-MS指紋圖譜共有峰均為24個(gè)，主要為2-(2-苯乙基)色酮類(lèi)化合物；而二者GC-MS指紋圖譜共有峰均為32個(gè)，主要為小分子芳香化合物和倍半萜。由于倍半萜和2-(2-苯乙基)色酮類(lèi)等成分均是因白木香樹(shù)受到外界傷害產(chǎn)生防御反應(yīng)后產(chǎn)生的防御性物質(zhì)[2]。可見(jiàn)，通體香和野生沉香在形成過(guò)程中產(chǎn)生的主要化學(xué)成分相同，這可能也是通體香乙醇提取物抗胃潰瘍[8]、抗結(jié)腸炎[9]等作用與野生沉香作用相當(dāng)?shù)脑颉?/p>

中藥指紋圖譜可全面反映中藥所含的物質(zhì)群，其相似度系數(shù)反映了不同批次樣品間化學(xué)組成的整體波動(dòng)程度，即中藥材質(zhì)量的穩(wěn)定性[17-18]。沉香化學(xué)成分與其結(jié)香時(shí)間、生長(zhǎng)環(huán)境和結(jié)香原因等因素有關(guān)[19]。Gao等[20]基于GC-MS指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)野生沉香和不同人工結(jié)香方法所產(chǎn)沉香的主要揮發(fā)性成分一致，但是不同人工結(jié)香方法所產(chǎn)沉香的指紋圖譜相似度較低，僅為0.180～0.811。而本研究發(fā)現(xiàn)16批采用通體結(jié)香技術(shù)誘導(dǎo)白木香樹(shù)所產(chǎn)沉香UPLC-Q/TOF-MS指紋圖譜和GC-MS指紋圖譜相似度較高，分別為0.598～0.869和0.846～0.995，且相似度高于野生沉香?？梢?jiàn)，不同批次通體香的化學(xué)組成相對(duì)于野生沉香更穩(wěn)定，可能與通體結(jié)香技術(shù)所采用的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)香、種植方式有關(guān)[21]。而16批野生沉香化學(xué)成分的相似度較16批通體香化學(xué)成分相似度小，可能與野生沉香生長(zhǎng)環(huán)境、結(jié)香原因和產(chǎn)地加工等復(fù)雜因素有關(guān)，且其結(jié)香時(shí)間通常為數(shù)年至數(shù)十年不等[22-23]。

圖6 通體香和野生沉香差異成分熱圖分析

4.3 通體香中部分主要化學(xué)成分的含量高于野生沉香

中藥材化學(xué)成分是其質(zhì)量?jī)?yōu)劣和藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[24-25]。本研究基于UPLC-Q/TOF-MS和GC-MS并采用多元變量統(tǒng)計(jì)分析方法，從通體香和野生沉香中找出20個(gè)差異成分，但該20個(gè)成分均為二者的共有成分，在通體香和野生沉香中的含量存在差異。其中α-santalol等5個(gè)倍半萜和5個(gè)小分子芳香物質(zhì)以及8個(gè)2-(2-苯乙基)色酮類(lèi)成分在通體香中的含量均顯著高于野生沉香。這可能是通體香乙醇提取物對(duì)家鴿的止嘔作用[5]、對(duì)四氯化碳致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用[26]和改善異丙腎上腺素誘導(dǎo)的小鼠心肌缺血作用[7]優(yōu)于野生沉香的主要原因。其中，沉香乙醇提取物可通過(guò)降低多巴胺D2和5-羥色胺2A發(fā)揮止嘔作用[5]。α-santalol是多巴胺D2和5-羥色胺2A受體拮抗劑[27]，而本研究發(fā)現(xiàn)通體香中的α-santalol比野生沉香高，可進(jìn)一步解釋通體香止嘔作用優(yōu)于野生沉香。但是通體香中其他含量較高的化學(xué)成分及其藥理作用與機(jī)制還有待開(kāi)展深入研究。

此外，以本研究篩選出的20個(gè)差異成分通過(guò)聚類(lèi)分析可將通體香和野生沉香各自聚為一類(lèi)，可見(jiàn)20個(gè)主要成分在通體香和野生沉香組間的差異遠(yuǎn)大于其組內(nèi)差異，因此可作為通體香和野生沉香的鑒定依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparative analysis of chemical constituents between the agarwood produced by Whole-tree agarwood-inducing technique and natural agarwood based on the combination of non-targeted metabolomics and fingerprint

YU Meng1, 2, HOU Wen-cheng1, FENG Jian1, CHEN Lan1, YANG Yun1, LIU Yang-yang1, 2, WEI Jian-he1, 2

1. Hainan Provincial Key Laboratory of Resources Conservation and Development of Southern Medicine & Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine for Agarwood Sustainable Utilization, Hainan Branch of the Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Haikou 570311, China 2. Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education & National Engineering Laboratory for Breeding of Endangered Medicinal Materials, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China

To provide scientific basis for the advanced application and popularization of agarwood produced by Whole-tree agarwood-inducing technique (Agar-Wit), the compositional differences between agarwood induced by Agar-Wit and natural agarwood were analyzed and compared in the study.The ethanol extracts and volatile components of samples were analyzed by ultra-performance liquid chromatography tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) and gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) combined with non-targeted metabolomics and fingerprint in this study.The common components of agarwood induced by Agar-Wit were consistent with natural agarwood. The similarity coefficients among Agar-Wit agarwood were higher than that in natural agarwood. In addition, the content of three low-molecular-weight aromatic compounds, four kinds of sesquiterpenes and eight 2-(2-phenylethyl)chromones were richer in agarwood induced by Agar-Wit.The main chemical composition of agarwood induced by Agar-Wit, which is more stable, is proved to be in accordance with wild agarwood.

agarwood; whole-tree agarwood-inducing technique (Agar-Wit); wild agarwood; non-targeted metabolomics; fingerprint

R284.1

A

0253 - 2670(2022)18 - 5625 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.005

2022-02-20

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2018YFC1706403）；海南省自然科學(xué)基金高層次人才項(xiàng)目（2019RC340）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（CARS-21）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（2016-I2M-2-003）；2021年國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高課題（2021Z14）

郁 萌，碩士研究生，研究方向?yàn)槌料阗|(zhì)量分析。E-mail: jokeryml@163.com

劉洋洋，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制技術(shù)及其應(yīng)用。Tel/Fax: (0898)31589000 E-mail: eadchris@163.com

魏建和，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗幱弥参锘蛸Y源、分子育種及次生代謝產(chǎn)物調(diào)控研究。Tel: (010)57833016 E-mail: wjianh@263.net

[責(zé)任編輯 王文倩]