石雯 周抒

宮腔粘連（IUA）是由于各種宮腔內(nèi)操作導(dǎo)致子宮內(nèi)膜基底層損傷、宮內(nèi)感染以及機(jī)體內(nèi)源性雌激素水平低下等引起子宮頸和（或）子宮腔內(nèi)膜纖維化，宮腔容受性減小，出現(xiàn)部分或完全閉塞粘連。IUA 臨床表現(xiàn)為月經(jīng)量減少、閉經(jīng)、周期性下腹痛、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)及不孕等，是危害女性生殖及生理健康的一大疾病。IUA 具體的病因機(jī)制尚不清楚。大鼠具有與人類相似的月經(jīng)周期及子宮生理解剖結(jié)構(gòu)，且大鼠的雙子宮結(jié)構(gòu)提供了天然的實(shí)驗(yàn)對照，是建立IUA 模型進(jìn)行相關(guān)病因機(jī)制研究的良好實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。本研究通過模擬人類子宮內(nèi)膜機(jī)械損傷后IUA 狀態(tài)，選取性成熟、未交配雌性SD 大鼠制作子宮內(nèi)膜不同程度機(jī)械損傷動(dòng)物模型，在損傷后的不同時(shí)間段進(jìn)行取材切片后進(jìn)行免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色，觀察大鼠宮腔不同時(shí)期不同機(jī)械損傷程度下的內(nèi)膜情況，進(jìn)一步探討引起IUA 與子宮內(nèi)膜病理性再生的相關(guān)病因機(jī)制并提供穩(wěn)定、合適的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

材料與方法

一、材 料

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康、性成熟、未交配雌性SD 大鼠30 只，鼠齡9～11 周，體質(zhì)量200～250 g，購于大連醫(yī)科大學(xué)無特定病原體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。所有大鼠遵循周期一致性原則，溫度20～26 ℃，濕度50%～60%，光照晝夜比例統(tǒng)一，自由采食、飲水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和處理過程均符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)倫理規(guī)范。

2. 藥物與主要試劑

包括：生理鹽水，一抗為小鼠抗大鼠主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子（MHC Ⅱ）抗體（稀釋比1∶100）購自英國Abcam 公司，大鼠抗 5-溴脫氧尿苷（BrdU，稀釋比1 ∶10）購自美國Bio-Rad 公司；二抗山羊抗小鼠 Ig 堿性磷酸酶（ALP，稀釋比1∶100）購自英國Abcam 公司，山羊抗大鼠 Ig ALP（稀釋比1∶100）購自英國Jackson 公司；免疫組化染色試劑藍(lán)色堿性磷酸鹽底物購自美國Vector公司，新品紅基質(zhì)試劑盒購自日本N-Histofine公司；水合氯醛粉劑購自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

二、方 法

1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及處理

按照配對比較法隨機(jī)分組，將30 只雌性SD大鼠分成實(shí)驗(yàn)組與對照組，每組各15 只。其中，實(shí)驗(yàn)組大鼠左側(cè)子宮行子宮內(nèi)膜輕度機(jī)械損傷并設(shè)定為輕度機(jī)械損傷組，右側(cè)子宮行子宮內(nèi)膜重度機(jī)械損傷并設(shè)定為重度機(jī)械損傷組。對照組大鼠開腹后不進(jìn)行子宮內(nèi)膜損傷處理，進(jìn)行假手術(shù)對照。

2. 大鼠陰道涂片方法

用毛細(xì)玻璃管吸取約50 μL 生理鹽水，輕輕置入大鼠陰道內(nèi)約1 cm 處，反復(fù)輕柔抽吸3～5 次后，將陰道內(nèi)抽吸液取出，立即均勻涂于潔凈載玻片并編號(hào)標(biāo)記，待干3 min，顯微鏡下觀察陰道涂片各細(xì)胞的分布情況。統(tǒng)一選取大鼠動(dòng)情期（涂片在光學(xué)顯微鏡下幾乎全部為聚堆的無核角化上皮細(xì)胞，呈落葉狀，而白細(xì)胞和有核細(xì)胞極少）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以避免不同實(shí)驗(yàn)對象間子宮內(nèi)膜所處月經(jīng)周期不同和雌孕激素水平差異而導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)誤差。

3. 建模方法

所有實(shí)驗(yàn)對象于術(shù)前禁食、禁飲12 h，動(dòng)物電推剪取下腹正中部剃毛（面積約3 cm×4 cm），腹腔注射麻醉，嚴(yán)格遵循無菌操作原則，碘伏棉球腹壁消毒3 次，以無菌紗布鋪巾（圖1A）。取實(shí)驗(yàn)對象腹部正中線、距離尿道口約3～4 cm 處用大號(hào)直剪作縱行切口1.5 cm，鈍銳結(jié)合分離腹直肌層及腹膜，進(jìn)入腹腔（圖1B）；用2 根無菌棉簽輕探腹腔，完整暴露膀胱后方“V”形子宮（圖1C）；無齒尖頭直鑷提起單側(cè)子宮，盡量避開子宮旁血管網(wǎng)，于子宮1/2 總長度處使用眼科剪橫向剪開子宮至橫切面直徑3/4 處（圖1D），采用自制2 mm直徑不銹鋼刮匙探入手術(shù)側(cè)子宮切口上、下側(cè)宮腔，反復(fù)進(jìn)行宮腔搔刮操作。實(shí)驗(yàn)組采用自身對照將大鼠左側(cè)子宮內(nèi)膜輕度搔刮作為輕度機(jī)械損傷組（圖1E、F），反復(fù)搔刮左側(cè)宮腔至刮出宮腔內(nèi)組織1～2 刮匙、宮腔內(nèi)少量積血、左側(cè)子宮外觀輕度充血、半透明、宮腔壁輕度塌陷，彈性欠佳；右側(cè)子宮內(nèi)膜重度搔刮作為重度機(jī)械損傷組（圖1G、H），以不刮破子宮壁為標(biāo)準(zhǔn)反復(fù)搔刮右側(cè)宮腔、刮出宮腔內(nèi)容物3～4 刮匙、宮腔內(nèi)大量新鮮積血，右側(cè)子宮外觀極度充血、近透明狀、宮腔壁塌陷，彈性極差，無菌紗布清理切口處少量鮮血，7-0 帶針縫合線間斷縫合子宮切口3 針，查子宮切口無明顯出血，使用無菌棉簽輕輕還納術(shù)側(cè)子宮；處置完畢后清點(diǎn)手術(shù)器械與術(shù)前一致，逐層關(guān)腹（圖1I、J）；對照組同法進(jìn)行開腹，暴露相同手術(shù)時(shí)長后關(guān)腹，不進(jìn)行宮腔搔刮操作。術(shù)后將實(shí)驗(yàn)對象安全轉(zhuǎn)至術(shù)后專用鼠籠，溫水瓶保暖，等待麻醉復(fù)蘇；蘇醒后觀察30 min、轉(zhuǎn)至新的普通鼠籠；清洗手術(shù)器械、消毒備用，清掃操作臺(tái)面，及時(shí)記錄手術(shù)過程。

圖1 SD 大鼠輕、重度機(jī)械損傷術(shù)程圖

4. 動(dòng)物處理及取材

實(shí)驗(yàn)組和對照組分別在術(shù)后0 h、24 h、72 h、5 d、7 d 進(jìn)行取材。取材前1 h 進(jìn)行10% BrdU 1 mL活體大鼠尾靜脈注射，實(shí)驗(yàn)組、對照組各取材3只。其中各組術(shù)后0 h 取材的實(shí)驗(yàn)對象需在進(jìn)行宮腔機(jī)械損傷前1 h 進(jìn)行BrdU 注射后再進(jìn)行手術(shù)，術(shù)后立即取材包埋，BrdU 注射成功后1 h 及時(shí)將各實(shí)驗(yàn)對象左、右側(cè)子宮組織等完整取出，分別進(jìn)行同側(cè)組織快速冰凍包埋后凍存于?80 ℃冰箱備用。4 μm 厚度標(biāo)準(zhǔn)下冰凍切片機(jī)快速切片，并于?80 ℃冰箱密封保存。

5. 免疫組化染色

取冰凍組織切片，風(fēng)干、固定、標(biāo)記染色范圍。第一重免疫組化選用MHC Ⅱ 60 μL 為一抗，抗鼠 Ig ALP 60 μL 為二抗，Vector Blue 堿性磷酸鹽顯色劑60 μL 顯色，倒置相差顯微鏡下觀察染色情況。第二重免疫組化選用抗鼠BrdU 60 μL 為一抗，抗鼠Ig ALP 60 μL 為二抗，New Fuchsin 顯色劑顯色，倒置相差顯微鏡下觀察染色情況。之后再次以甲醛鈣固定玻片、封片，風(fēng)干后室溫保存，倒置相差顯微鏡下觀察各切片組織形態(tài)改變及染色情況。

6. 大鼠子宮內(nèi)膜腺體檢測

術(shù)后7 d 在倒置相差顯微鏡下觀察大鼠的子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化以及腺體數(shù)量，子宮內(nèi)膜腺體的計(jì)數(shù)：每份組織隨機(jī)選取3 張切片，置于鏡下進(jìn)行整個(gè)視野的子宮內(nèi)膜腺體計(jì)數(shù)，每份組織取3 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值為該組織腺體個(gè)數(shù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、動(dòng)情期大鼠陰道細(xì)胞涂片的情況

大鼠的動(dòng)情周期約4～5 d。大鼠動(dòng)情期陰道涂片在光學(xué)顯微鏡下幾乎全部為聚堆的無核角化上皮細(xì)胞，呈落葉狀，白細(xì)胞和有核細(xì)胞極少，見圖2。

圖2 SD 大鼠動(dòng)情期陰道細(xì)胞涂片在光學(xué)顯微鏡下的表現(xiàn)（×100）

二、大鼠輕、重度機(jī)械損傷后各個(gè)時(shí)期子宮形態(tài)與正常子宮解剖形態(tài)的比較

所有大鼠術(shù)后一般狀況良好，精神可，飲食佳，大小便正常，體質(zhì)量無明顯改變，術(shù)后均存活。正常大鼠子宮外觀顏色粉紅，血運(yùn)豐富，無充血，管腔粗細(xì)均勻，管壁膨隆、彈性好，剖視子宮內(nèi)膜層結(jié)構(gòu)完整，無異常出血及破損（圖1C）；輕度機(jī)械損傷0 h 后大鼠子宮外觀輕度充血水腫，宮腔半透明、輕度塌陷狀態(tài)，彈性欠佳（圖1F）；重度機(jī)械損傷0 h 后大鼠子宮外觀極度充血水腫，宮腔呈透明狀、宮腔壁塌陷，彈性極差，剖視內(nèi)膜層幾乎完全破損、即將穿透子宮壁，管腔積血多（圖1H）。機(jī)械損傷24 h 后大鼠雙側(cè)子宮水腫明顯（圖3A）；機(jī)械損傷72 h 后大鼠雙側(cè)子宮水腫，可見管腔內(nèi)淤血（圖3B）；機(jī)械損傷5 d 后大鼠雙側(cè)子宮水腫淤血狀態(tài)減輕，管壁彈性較前改善（圖3C）；機(jī)械損傷7 d 后大鼠雙側(cè)子宮與周圍組織粘連明顯，無明顯水腫淤血（圖3D）。

圖3 輕度機(jī)械損傷組（左側(cè)子宮）和重度機(jī)械損傷組（右側(cè)子宮）術(shù)后各時(shí)期大體形態(tài)圖

三、輕、重度機(jī)械損傷組子宮內(nèi)膜各時(shí)期的鏡下形態(tài)學(xué)表現(xiàn)、MHC Ⅱ細(xì)胞及BrdU 標(biāo)記細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果

1. 輕、重度機(jī)械損傷組子宮內(nèi)膜各時(shí)期鏡下形態(tài)學(xué)表現(xiàn)

術(shù)后0 h， 輕度機(jī)械損傷組的子宮內(nèi)膜組織破損、較正常內(nèi)膜變薄1/4～1/3，部分間質(zhì)細(xì)胞及腺體缺失，剩余內(nèi)膜結(jié)構(gòu)清晰、層次分明，剩余腺體排列規(guī)則，子宮管腔出現(xiàn)空隙（可能由積血或積液所致），無明顯水腫及纖維組織形成（圖4A）； 重度機(jī)械損傷組的子宮內(nèi)膜組織破損嚴(yán)重、內(nèi)膜層幾乎全部破壞，極少量間質(zhì)細(xì)胞及腺體殘留，子宮管腔出現(xiàn)大空隙（可能由積血或積液所致），無明顯水腫及纖維組織形成（圖4F）。術(shù)后24 h，輕度機(jī)械損傷組的管腔見大量黏液及壞死組織，管腔輕度水腫，內(nèi)膜較前變薄（圖4B）；重度機(jī)械損傷組見大量黏液壞死組織充滿管腔，管腔水腫明顯，部分宮腔未見明顯內(nèi)膜組織，腺體少見（圖4G）。術(shù)后72 h，輕度機(jī)械損傷組的子宮內(nèi)膜逐漸增生修復(fù)，內(nèi)膜間質(zhì)及腺體數(shù)目增加，子宮內(nèi)膜表面上皮被覆完整，管腔內(nèi)空隙變?。▓D4C）；重度機(jī)械損傷組的管腔空隙較前變小，其內(nèi)可見壞死組織，未見明顯腺體（圖4H）。術(shù)后5 d，輕度機(jī)械損傷組的管腔間隙進(jìn)一步變小，腺體數(shù)目較前明顯增多（圖4D）；重度機(jī)械損傷組的管腔間隙進(jìn)一步變小，未見明顯腺體增多（圖4I）。術(shù)后7 d，輕度機(jī)械損傷組的管腔基本閉合，無明顯水腫，出現(xiàn)內(nèi)膜線（圖4E）； 重度機(jī)械損傷組無明顯水腫，管腔進(jìn)一步縮小，未見腺體或腺體數(shù)目極少，內(nèi)膜組織纖維化，內(nèi)膜層大部分組織被纖維組織替代且向?qū)m腔凸起，甚至占據(jù)整個(gè)宮腔，局部管腔閉合并出現(xiàn)粘連（圖4J）。

2. 輕、重度機(jī)械損傷組MHC Ⅱ細(xì)胞及BrdU標(biāo)記細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果

輕度機(jī)械損傷組中，術(shù)后24 h 開始出現(xiàn)藍(lán)染的MHC Ⅱ細(xì)胞（圖4B）；術(shù)后72 h 內(nèi)膜層出現(xiàn)大量紅染含BrdU 的細(xì)胞，并見大量藍(lán)染的MHC Ⅱ細(xì)胞（圖4C）；術(shù)后5 d 見較多紅染含BrdU 的細(xì)胞，子宮內(nèi)膜見藍(lán)染的MHC Ⅱ細(xì)胞數(shù)目較前稍減少（圖4D）；術(shù)后7 d 仍可見少量紅染含BrdU 的細(xì)胞，子宮內(nèi)膜基本修復(fù)，見少量藍(lán)染的MHC Ⅱ細(xì)胞（圖4E）。重度機(jī)械損傷中，術(shù)后24 h 開始出現(xiàn)藍(lán)染的MHC Ⅱ細(xì)胞（圖4G）；術(shù)后72 h 內(nèi)膜層未見明顯紅染含BrdU 的細(xì)胞，見少量藍(lán)染的MHC Ⅱ細(xì)胞（圖4H）；術(shù)后5 d 未見明顯紅染含BrdU 的細(xì)胞，見藍(lán)染的MHC Ⅱ細(xì)胞、數(shù)目較前減少（圖4I）；術(shù)后7 d未見明顯紅染含BrdU的細(xì)胞，見藍(lán)染的MHC Ⅱ細(xì)胞、數(shù)目較前進(jìn)一步減少（圖4J）。

圖4 SD 大鼠輕、重度機(jī)械損傷術(shù)后子宮內(nèi)膜各時(shí)期形態(tài)表現(xiàn)（免疫組化染色，×100）

四、術(shù)后7 d 輕、重度機(jī)械損傷組和對照組的子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目比較

術(shù)后7 d，輕度機(jī)械損傷組、重度機(jī)械損傷組和對照組的子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目分別為（9.37±1.31）個(gè)、（12.96±1.22）個(gè)和（2.93±0.83）個(gè)，3組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =538.69，P < 0.001），且隨著子宮內(nèi)膜受損程度增加，腺體數(shù)目隨之減少（組間兩兩比較P 均<0.001）。

討 論

IUA 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，Polishuk 等（1975年）提出的纖維細(xì)胞增生活躍學(xué)說為當(dāng)前主流學(xué)說。IUA 的發(fā)病機(jī)制可能與纖維細(xì)胞的異常增生活躍主要相關(guān)。研究提示，IUA 分離術(shù)后子宮內(nèi)膜中微血管密度的增加、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的上調(diào)、新生微血管的形成可能對子宮內(nèi)膜修復(fù)有利。用于建立IUA 模型的實(shí)驗(yàn)物種包括小鼠、大鼠、新西蘭兔以及犬等。其中大鼠具有成本低、適應(yīng)性強(qiáng)、生殖周期短、遺傳背景清晰及個(gè)體差異性小等特點(diǎn)，其獨(dú)特的雙子宮解剖結(jié)構(gòu)可為IUA模型的建立提供天然的自身對照條件。IUA 動(dòng)物模型的建立方式包括機(jī)械損傷法、物理損傷法、化學(xué)損傷法、感染損傷法、熱損傷法以及多重?fù)p傷聯(lián)合法等。

本研究采用子宮內(nèi)膜機(jī)械損傷法，最接近臨床妊娠后行人工流產(chǎn)清宮術(shù)操作下的子宮內(nèi)膜損傷方式。與通過Masson 染色、HE 染色等方式進(jìn)行IUA 模型建立不同，本研究對大鼠子宮內(nèi)膜組織染色方法進(jìn)行了改進(jìn)，通過雙重免疫組化染色將大鼠子宮內(nèi)膜中包含MHC Ⅱ的細(xì)胞染成藍(lán)色，將含有BrdU 的大鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞染成紅色，進(jìn)而觀察術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的炎性反應(yīng)以及細(xì)胞增殖情況，深入反映術(shù)后早期IUA 發(fā)生發(fā)展的過程。

MHC Ⅱ?qū)τ行д{(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的強(qiáng)效應(yīng)答有重要意義。本研究通過對MHC Ⅱ細(xì)胞染色，發(fā)現(xiàn)子宮受損后內(nèi)膜及肌層組織中MHC Ⅱ反應(yīng)增強(qiáng)，在機(jī)械損傷后0 h 至術(shù)后3 d 炎癥反應(yīng)較大，之后逐步減輕。BrdU 是一種胸腺嘧啶核苷酸類似物，通過與胸腺嘧啶核苷酸競爭，從而替代胸腺嘧啶核苷酸摻入到S 期新合成的DNA 片段中，研究者可通過計(jì)數(shù)不同機(jī)械損傷程度下標(biāo)記有BrdU 的細(xì)胞，了解子宮內(nèi)膜增生修復(fù)情況。本研究顯示，輕度機(jī)械損傷組術(shù)后72 h，大鼠子宮內(nèi)膜處出現(xiàn)紅染含BrdU 的細(xì)胞，提示大鼠內(nèi)膜細(xì)胞開始增生修復(fù)；而重度機(jī)械損傷組大鼠子宮內(nèi)膜未見紅染含BrdU 細(xì)胞，提示子宮內(nèi)膜細(xì)胞無增生修復(fù)，考慮重度機(jī)械性損傷破壞了大鼠子宮內(nèi)膜基底層及腺體，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜再生障礙，從而影響子宮內(nèi)膜的修復(fù)。

另外，本研究通過使用自制2 mm 刮匙對大鼠子宮內(nèi)膜進(jìn)行輕、重度機(jī)械性搔刮后所造成的內(nèi)膜損傷程度甚至IUA 的整個(gè)大體及組織病理學(xué)過程的對比研究，發(fā)現(xiàn)大鼠子宮內(nèi)膜在輕度機(jī)械損傷后0 h 出現(xiàn)1/4～1/3 淺表層組織破壞，部分腺體缺損，術(shù)后24 h 出現(xiàn)明顯組織水腫，術(shù)后72 h 出現(xiàn)組織增生修復(fù)及大量炎性細(xì)胞，術(shù)后5 d 組織繼續(xù)修復(fù)增生，術(shù)后7 d 基本達(dá)到完全修復(fù)再生；而大鼠子宮內(nèi)膜在重度機(jī)械損傷后，術(shù)后0 h 子宮內(nèi)膜損傷破壞程度達(dá)到內(nèi)膜全層、累及整個(gè)基底層和腺體，甚至造成肌層等的損傷，術(shù)后24 h 宮腔內(nèi)殘留的部分內(nèi)膜組織水腫明顯，腺體殘留少甚至部分宮腔不見腺體，術(shù)后72 h 及術(shù)后5 d，子宮腔內(nèi)間隙逐漸縮小，但內(nèi)膜組織鏡下觀察仍無明顯修復(fù)增生表現(xiàn)，術(shù)后7 d 內(nèi)膜組織無法達(dá)到基本修復(fù)，子宮腔內(nèi)間隙進(jìn)一步縮小，腺體數(shù)目少、排列分布不規(guī)則，出現(xiàn)組織纖維化，內(nèi)膜層大部分被纖維組織替代且向?qū)m腔凸起，甚至占據(jù)整個(gè)宮腔，局部管腔閉合、出現(xiàn)粘連。

綜上所述，本研究通過觀察動(dòng)情期大鼠子宮內(nèi)膜在不同程度機(jī)械損傷后不同時(shí)期的再生修復(fù)過程，發(fā)現(xiàn)重度機(jī)械損傷后大鼠子宮腔出現(xiàn)粘連改變，提示切開縫合子宮內(nèi)膜機(jī)械損傷法可以成功建立大鼠IUA 模型。這為后續(xù)進(jìn)行IUA 相關(guān)機(jī)制的研究提供了良好的動(dòng)物模型，也提示在保護(hù)子宮內(nèi)膜方面盡量避免重度機(jī)械損傷的重要性。