林正杰 江詩海 梁堂釗 任建華 何容涵 胡瑛 王昆 朱蕾

增生性瘢痕是以成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)堆積為主要特征的一類病理性愈合方式，在臨床上表現(xiàn)為創(chuàng)面邊緣高出皮膚表面、早期充血明顯、可伴有疼痛或瘙癢，可能會(huì)引起關(guān)節(jié)等活動(dòng)障礙，對患者的生活和心理造成一系列不良影響。目前，臨床上主要采用激光、皮下注射糖皮質(zhì)激素等非手術(shù)治療方法，但這些治療手段都無法有效地治療增生性瘢痕。同時(shí)，增生性瘢痕采用單純手術(shù)切除復(fù)發(fā)率較高，不推薦單獨(dú)應(yīng)用。因此，探索一種新的增生性瘢痕的治療方案成為當(dāng)前迫切需求。

脂肪干細(xì)胞（ADSC）被用于治療纖維化，其來源較為豐富，獲取途徑多樣，被廣泛用于研究。ADSC 源 性 外 泌 體（ADSC-Exos）由ADSC分泌，目前研究表明，ADSC-Exos 在創(chuàng)面愈合、瘢痕預(yù)防等方面發(fā)揮著重要作用。同 時(shí)，ADSCExos 能夠有效逆轉(zhuǎn)心臟、肝臟、腎臟等的纖維化，為纖維化的治療提供新的方向。近年來，有關(guān)ADSC-Exos 在增生性瘢痕中作用的研究與日俱增，本課題組通過制備ADSC-Exos 處理瘢痕成纖維細(xì)胞，探索ADSC-Exos 對瘢痕成纖維細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，為后期ADSC-Exos 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，以期為將ADSC-Exos 用于治療增生性瘢痕提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

材料與方法

一、細(xì)胞來源及主要試劑

ADSC、瘢痕成纖維細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶購自康寧公司，DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液購自美國Gibco 公司。CCK-8 試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。Ⅰ型膠原（COL1）、COL3 抗體、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體購自美國Abcam 公司。TRIzol RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量（qRT）-PCR 試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基（含100 U/mL 青霉素，100 μg/mL 鏈霉素）培養(yǎng)人瘢痕成纖維細(xì)胞；置于37 ℃含5% CO的環(huán)境中培養(yǎng)，2～3 d 傳代1 次，當(dāng)細(xì)胞生長至體積達(dá)80%～90%時(shí)，利用含0.25%胰酶進(jìn)行常規(guī)傳代。本研究采用第3 代ADSC 所提取的ADSC-Exos 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

三、ADSC-Exos 對瘢痕成纖維細(xì)胞活性與增殖影響的評估

1. ADSC-Exos 的制備

將5×10的ADSC（第3 代）接種于培養(yǎng)瓶中，待24 h 細(xì)胞貼壁后，采用含無外泌體血清的低糖DMEM 培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)48 h，并收集其培養(yǎng)上清，300×g、4℃離心10 min，2000×g、4℃離心20 min，10 000×g、4 ℃離心30 min 后，將上清通過針筒式濾膜過濾器（0.22 μm）過濾，再行100 000×g、4 ℃離心70 min 2 次后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，并通過透射電鏡、粒徑、蛋白免疫印跡法檢測ADSC-Exos。

2. CCK-8 實(shí)驗(yàn)

將3×10個(gè)/孔的瘢痕成纖維細(xì)胞接種于96孔板中，設(shè)置對照組、ADSC-Exos 組，每組設(shè)置5 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)孔，加入等量的PBS、ADSC-Exos 培養(yǎng)，分別于0、12、24、48 h 后通過CCK-8 試劑盒對瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖進(jìn)行測定，對各組增殖率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3.蛋白免疫印跡法

將瘢痕成纖維細(xì)胞接種于6 孔板，然后用ADSC-Exos 處理48 h。對照組細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間與ADSC-Exos 組相同但不作任何處理。48 h 后用PBS 清洗細(xì)胞3 次，然后加入裂解液收集蛋白質(zhì)，10 000×g 離 心15 min。采 用SDS-PAGE 凝 膠 電泳，用12.5%的分離膠分離蛋白質(zhì)，在SDS-PAGE凝膠上電泳，然后將其轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將膜用5% 脫脂牛奶密封1 h，然后與COL1、COL3、α-SMA 等抗體于4 ℃孵育過夜，樣品用TBST 緩沖液洗滌3 次，用二抗孵育1 h，再用TBST 緩沖液洗去二抗，使用化學(xué)發(fā)光成像儀成像。每個(gè)條帶的灰度值經(jīng)Image J 軟件分析。

4. qRT-PCR

分析ADSC-Exos 對瘢痕成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)指標(biāo)的影響，將對照組與ADSC-Exos 組處理的瘢痕成纖維細(xì)胞依據(jù)試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，利用qRT-PCR 檢測纖維化相關(guān)指標(biāo)COL1、COL3、α-SMA 的 表 達(dá)，并 通 過2法進(jìn)行分析，評價(jià)經(jīng)ADSC-Exos 處理后纖維化指標(biāo)的變化。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次。實(shí)驗(yàn)中所涉及的基因?qū)?yīng)的引物序列如下，內(nèi)參GAPDH， forward：5′-GGAGCGCTACCCCTCCAAAAT-3′and reverse：5′-GGCTGCGTTCATACTTCTCATGG-3′；COL1，forward：5′-GTGCGATGACACGATCTGTGA-3′and reverse：5′-CGGTGGTAACTTGGTCGGT-3′；COL3，forward：5′-GCCAAATATGTCGTAGTGACTCA-3′and reverse：5′-GGGCGAGTACCTCCAGTTG-3′；ɑ-SMA， forward：5′-GGCATTCGCAAGACCACCT AC-3′ and reverse： 5′-CGACATGACGTTCATGG CATAC-3′。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 25.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用 GraphPad Prism 8.0.2 進(jìn)行作圖。3 組數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測量資料的方差分析。P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ADSC、瘢痕成纖維細(xì)胞和ADSC-Exos的鑒定

CD90、CD13、CD105、CD44 表 達(dá) 陽 性，CD34、CD45 表達(dá)陰性，表明該細(xì)胞為ADSC（圖1A）。瘢痕成纖維細(xì)胞Vimentin 表達(dá)陽性，對照為陰性（圖1B）。透射電鏡結(jié)果表明，ADSCExos 為典型的杯狀囊泡（圖1C）。粒徑分析表明，ADSC-Exos 的平均直徑為30～150 nm，濃度約為1.36×10個(gè)/mL（圖1D）。蛋白免疫印跡顯示，ADSC-Exos 中CD81、CD63 表 達(dá) 陽 性，Calneix 表達(dá)陰性（圖1E）。這些數(shù)據(jù)表明本研究成功分離了ADSC-Exos。

圖1 ADSC、瘢痕成纖維細(xì)胞和ADSC-Exos 的鑒定

二、ADSC-Exos 對瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和纖維化的影響

將ADSC-Exos 與瘢痕成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示ADSC-Exos 組的瘢痕成纖維細(xì)胞增長緩慢（圖2A）。增殖實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)ADSC-Exos 處理的瘢痕成纖維細(xì)胞增殖率逐漸降低（n = 5，P = 0.017），表明ADSC-Exos 可以抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖（圖2B）。此外，ADSC-Exos 還能下調(diào)COL1、COL3 和α-SMA 的 表 達(dá)（圖2C、D）。人COL1、COL3 和α-SMA 的mRNA 表 達(dá) 經(jīng)ADSC-Exos 作用后下調(diào)（n = 5，t = 0.670，P = 0.029），表明ADSC-Exos 可以逆轉(zhuǎn)瘢痕成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的分化，從而減輕瘢痕的纖維化（圖2E）。以上結(jié)果證實(shí)，ADSC-Exos 可以抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的生物學(xué)功能。

圖2 ADSC-Exos 對瘢痕成纖維細(xì)胞增殖和纖維化的影響

討 論

ADSC 是典型的低分化多能干細(xì)胞之一，具有較低的免疫原性，來源豐富。ADSC-Exos 由ADSC分泌，其在創(chuàng)面愈合、預(yù)防瘢痕等方面具有重要作用。外泌體從細(xì)胞中釋放，參與多個(gè)生物學(xué)和病理學(xué)過程。由于具有攜帶mRNA、蛋白質(zhì)、微RNA、長鏈非編碼RNA 的能力，外泌體作為細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的作用已在許多研究領(lǐng)域中得到確認(rèn)，其所攜帶的RNA 和蛋白質(zhì)已被證實(shí)在創(chuàng)面愈合中起重要的作用。外泌體在增殖、遷移過程中的作用也有相關(guān)的研究。ADSC-Exos 在皮膚創(chuàng)傷愈合中的應(yīng)用已取得顯著進(jìn)展。ADSC-Exos 治療增生性瘢痕的應(yīng)用前景廣闊。

ADSC-Exos 抗纖維化的作用還在肝臟、腎臟及心肌纖維化等方面得到驗(yàn)證。所以本研究提取ADSC 的培養(yǎng)上清，制備ADSC-Exos，初步探討ADSC-Exos 對瘢痕成纖維細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，在ADSC-Exos 的作用下，瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖和纖維化指標(biāo)受到影響，這為ADSC-Exos 在增生性瘢痕的治療提供了可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。同時(shí)，在增生性瘢痕的進(jìn)展過程中自噬扮演著重要的角色。本研究顯示，在增生性瘢痕中，ADSC-Exos能有效下調(diào)COL1、COL3、α-SMA 等的表達(dá)，從而抑制瘢痕成纖維細(xì)胞的纖維化。

綜上所述，ADSC 通過旁分泌作用分泌ADSCExos，作用于瘢痕成纖維細(xì)胞，下調(diào)COL1、COL3和α-SMA 等的表達(dá)，這為ADSC-Exos 治療增生性瘢痕提供了新思路。然而ADSC-Exos 在增生性瘢痕中的作用，仍需進(jìn)一步深入探討，以期為ADSC-Exos 對增生性瘢痕的治療應(yīng)用提供更科學(xué)的依據(jù)。