陳慧彬

(河南工業(yè)大學 糧油食品學院，河南 鄭州 450001)

芝麻是一種經濟效益好、營養(yǎng)價值高的食品。芝麻含油率達45%～57%，蛋白質含量約21%，是優(yōu)質的不飽和脂肪酸和蛋白質來源。此外，芝麻還富含木脂素及維生素E等抗氧化成分，素有“八谷之冠”的美譽[1]。然而，芝麻蛋白又是一種不容忽視的食品過敏原。2014年，美國公共事務科學中心(CSPI)要求美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)將芝麻制品納入食源性過敏原加以管理。

食品過敏原通過胃腸道初次進入機體后，被抗原提呈細胞吞噬消化為小分子肽段，由MHCⅡ(T細胞表位，主要負責提呈外源抗原)提呈到細胞質膜表面，與TH2細胞的TCR結合，形成MHCⅡ-抗原-TCR復合體，被激活的T細胞產生細胞因子，IL4和IL10可刺激B細胞釋放IgE抗體(B細胞表位)，IgE結合至肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面，使機體處于致敏狀態(tài)，當機體再次接觸過敏原，可迅速引發(fā)Ⅰ型超敏反應，進而觸發(fā)過敏癥。

芝麻過敏原主要包括醇溶蛋白超家族的Ses i 1和Ses i 2，Cupin超家族的Ses i 3、Ses i 6和 Ses i 7，以及油質蛋白超家族的Ses i 4和Ses i 5[2]。其中Ses i 6和Ses i 7占芝麻蛋白質總量的60%～70%，因其具有較強的熱穩(wěn)定性和抗消化能力，容易通過胃腸道屏障薄弱部位進入循環(huán)系統(tǒng)，被免疫細胞識別消化觸發(fā)Ⅰ型超敏反應，是芝麻中的主要過敏原。國內關于芝麻過敏原的研究仍為空白，為此，探究Ses i 6的致敏表位、致敏機理、檢測方法、脫敏加工等尤為重要。本研究采用生物信息學軟件對Ses i 6的抗原表位進行模擬預測，以期為后續(xù)的研究工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 Ses i 6信息檢索及理化性質分析

登錄NCBI-Protein數據庫，查詢Ses i 6的氨基酸序列(編號：Q9XHP0.1)，獲取如下FASTA序列：MVAFKFLLALSLSLLVSAAIAQTREPRLTQGQQCRFQRISGAQPSLRIQSEGGTTELWDERQEQFQCAGIVAMRSTIRPNGLSLPNYHPSPRLVYIERGQGLISIMVPGCAETYQVHRSQRTMERTEASEQQDRGSVRDLHQKVHRLRQGDIVAIPSGAAHWCYNDGSEDLVAVSINDVNHLSNQLDQKFRAFYLAGGVPRSGEQEQQARQTFHNIFRAFDAELLSEAFNVPQETIRRMQSEEEERGLIVMARERMTFVRPDEEEGEQEHRGRQLDNGLEETFCTMKFRTNVESRREADIFSRQAGRVHVVDRNKLPILKYMDLSAEKGNLYSNALVSPDWSMTGHTIVYVTRGDAQVQVVDHNGQALMNDRVNQGEMFVVPQYYTSTARAGNNGFEWVAFKTTGSPMRSPLAGYTSVIRAMPLQVITNSYQISPNQAQALKMNRGSQSFLLSPGGRRS。Ses i 6共459個氨基酸殘基，以此為基礎進行接下來的表位分析。

登錄UniProtKB，查詢Ses i 6(編號：Q9XHP0)的基本信息和功能注釋。

將Ses i 6的FASTA格式序列導入EXPASY的ProtParam工具，預測分析Ses i 6蛋白的物理化學性質。

1.2 B細胞表位預測

1.2.1 B細胞線性表位預測

1.2.1.1 基于Ses i 6二級結構的生物信息學預測

將氨基酸序列導入在線預測軟件SOPMA，依據二級結構算法預測分析潛在的B細胞線性表位。

1.2.1.2 基于Ses i 6分子特征的生物信息學預測

使用DNAstar子程序Protean分析Ses i 6的蛋白質特性。其中，Kyte-Doolittle Hydropathy方案可以根據氨基酸序列得出Ses i 6的親水性分布；Karplus-Schultz方案可以通過分析Ses i 6的主鏈柔性預測潛在的抗原表位；Emini方案可以預測Ses i 6的表面可及性；Jameson-Wolf方案可以直接得出Ses i 6的抗原分布，綜合四種方案預測分析Ses i 6潛在的優(yōu)勢表位。

1.2.1.3 基于Ses i 6與已知過敏原的比對預測

登錄BepiPred 1.0 Server，輸入氨基酸序列，結合氨基酸的性質(親水性、柔韌性、可及性、極性、暴露表面、轉角)和隱馬爾可夫模型預測潛在的B細胞線性表位[3]。研究表明，同那些僅依賴于氨基酸性質的預測方法相比，隱馬爾可夫模型可提高BepiPred預測結果的準確性。

1.2.2 B細胞構象表位預測

1.2.2.1 Ses i 6三維模型的構建

在SWISS-MODLE中通過序列比對尋找模板，需要注意的是，尋找的模板蛋白與Ses i 6的序列相似性應高于30%[4]，以模板結構為基礎進行三維建模，下載三維模型的PDB文件以評估其穩(wěn)定性。

1.2.2.2 Ses i 6三維模型穩(wěn)定性評價

在Deep View 4.1中導入SWISS-MODLE構建的三維模型PDB文件，獲取拉氏圖(Ramachandran Plot)，評定三維模型的穩(wěn)定性。

1.2.2.3 基于Ses i 6三維模型的生物信息學預測

DiscoTope 2.0 Server通過計算抗原抗體接觸數和氨基酸傾向得出致敏原潛在的構象表位，采用新型的空間可及性算法預估表面暴露的可能性，增加了預測的準確性。導入SWISS-MODLE的PDB文件，分析同源模型中的構象表位。在Pymol軟件中標注獲取的構象表位，分析其空間位置關系。

1.3 敏感人群分析及T細胞表位預測

人類白細胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)是表達于人體免疫細胞質膜表面的主要相容組織復合體(Major histocompatibility complex，MHC)[5]，具有廣泛的群體多態(tài)性，與食品過敏的個體差異性密切相關，根據差異大小，可分為安全群體和敏感群體。因此，根據HLA基因型與Ses i 6的相關關系分析敏感人群分布格外重要。外源抗原(CD4+T細胞呈遞)的T細胞表位由12～17個氨基酸殘基組成，主要是線性表位，與肽段的空間位置沒有關系，可分布于分子內部，研究具體的T細胞表位可為敏感人群提供安全保障。

1.3.1 敏感人群分析

使用在線分析軟件NetMHCII 2.3 Server[6]分析Ses i 6與HLA-DR(共25種)、HLA-DQ(共20種)、HLA-DP(共9種)的結合能力，篩選出高親和性肽段(SB)和低親和性肽段(WB)，并判斷敏感人群。

1.3.2 敏感人群的T細胞表位預測

根據1.3.1中敏感人群的高親和肽段分析其T細胞表位。

2 結果與分析

2.1 理化性質分析

NCBI數據庫顯示，Ses i 6的1aa-21aa為信號肽，22aa-277aa為酸性亞基，278aa-459aa為堿性亞基，第24位和第67位的Cys形成二硫鍵，此外，第110位和第284位的Cys形成的二硫鍵連接酸性亞基和堿性亞基。20aa-454aa屬于Cupin蛋白超家族，該蛋白家族擁有β-伴大豆球蛋白、7S豌豆球蛋白及花生主要過敏原Ara h 1等眾多致敏原。

UniProtKB數據庫顯示，Ses i 6是一種同源六聚體貯存蛋白，2007年被世界衛(wèi)生組織(WHO)和國際過敏協會聯合會(IUIS)正式定名為過敏原Ses i 6.0101。

通過ProtParam分析，Ses i 6的分子式為C2246H3560N682O692S20，分子量為51830.33Da，等電點為7.73，脂肪蛋白系數(AI)為74.36，平均親水指數(GRAVY)為-0.537，AI和GRAVY共同指示Ses i 6具有很強的親水性。Ses i 6的氨基酸組成如圖1所示。

2.2 B細胞表位預測

2.2.1 線性表位

2.2.1.1 基于Ses i 6二級結構的生物信息學預測

根據二級結構預測理論，紅色區(qū)域和紫色區(qū)域因暴露于蛋白質分子的外表面，從抗原抗體的可及性觀測，容易被識別，是致敏原分子中的優(yōu)勢表位。Ses i 6酸性亞基含有更多的無規(guī)則卷曲片段，而堿性亞基的各種二級結構分散，難以形成穩(wěn)定的抗原表位。SOPMA分析的Ses i 6的二級結構分布如圖2所示。

圖2 Ses i 6的二級結構分布

以多于5個氨基酸殘基(B細胞線性表位通常含有5-15個氨基酸殘基)為標準，SOPMA共預測出圖3所示的21個潛在優(yōu)勢抗原表位，其中，12個分布于酸性亞基。另外9個分布于堿性亞基，根據表位分布情況可知，Ses i 6的酸性亞基抗原性略高于堿性亞基。

圖3 基于Ses i 6二級結構的預測結果

2.2.1.2 基于Ses i 6分子特征的生物信息學預測

圖4展示了DNAstar預測的Ses i 6分子特征。整體上酸性亞基親水性強于堿性亞基，往往致敏原的親水性基團暴露在蛋白質表層，易與免疫細胞質膜受體結合，觸發(fā)過敏癥，因此，從親水性角度觀測，酸性亞基抗原性較強。65.6%的肽段抗原指數高于0，部分片段達1.7，顯示出較強的抗原性。Ses i 6的表面可及性與親水性預測結果基本保持一致，酸性亞基環(huán)繞在分子外表面的可能性更大，是Ses i 6潛在抗原表位的優(yōu)勢集中區(qū)。

圖4 DNAstar預測結果分布

DNAstar預測出10個潛在的優(yōu)勢抗原表位(見表1)，其中，7個表位分布于酸性亞基，3個表位分布于堿性亞基，前者抗原性強于后者，與SOPMA預測結果一致。

表1 DNAstar預測結果

2.2.1.3 基于Ses i 6與已知過敏原的比對預測

Bepipred預測出13個抗原表位(見表2)，其中，8個表位分布于酸性亞基，5個表位分布于堿性亞基，與SOPMA和DNAstar預測結果一致。

表2 Bepipred預測結果

使用單一的數據庫或生物信息學軟件進行預測，結果往往有較大的偏差，結合SOPMA、DNAstar及Bepipred三款軟件的不同算法，得出B細胞線性表位的綜合預測結果(見表3)。綜合來看，所有潛在的優(yōu)勢抗原表位都分布于酸性亞基。

表3 B細胞線性表位的綜合預測結果

2.2.2 構象表位

2.2.2.1 Ses i 6三維模型的構建

在PDB數據庫中搜尋模板，得到序列相似度為39.21%的籽粒莧(AmaranthushypochondriacusL.)11S貯存蛋白(3qac)，構建Ses i 6三維模型(見圖5)。堿性亞基和酸性亞基各自形成一個β-桶結構域，該結構是Cupin蛋白超家族的典型特征，主要由β-折疊構成。圖中顯示的β-轉角結構和酸性亞基向外延伸的無規(guī)則卷曲片段已在2.2.1.1中被預測為潛在的線性抗原表位。

圖5 Ses i 6三維模型

2.2.2.2 Ses i 6三維模型穩(wěn)定性評價

Deep View 4.1通過分析相鄰氨基酸的二面角(φ，ψ)大小評估Ses i 6三維結構的穩(wěn)定性。圖6中的深綠色區(qū)域為允許區(qū)，淺綠色區(qū)域為不完全允許區(qū)，其他區(qū)域為不允許區(qū)。拉氏圖顯示93.41%以上的二面角符合穩(wěn)定性要求。因此，SWISS-MODLE預測結果可用于Ses i 6構象表位的預測，并對Ses i 6的立體結構解析有指導意義。

圖6 Ses i 6三維結構的Ramachandran Plot

2.2.2.3 基于Ses i 6三維模型的生物信息學預測

以穩(wěn)定的三維模型為基礎，DiscoTope 2.0分析出10個潛在抗原表位(見表4)，其中，8個位于酸性亞基的構象表位，2個位于堿性亞基的構象表位，與線性表位分布一致。

表4 DiscoTope 2.0預測結果

Ses i 6的B細胞構象表位分布如圖7所示。使用Pymol標注出10個抗原表位的空間位置，優(yōu)勢表位全部位于Ses i 6表面，容易被免疫細胞識別，其中，表位1、2、5、6、7和8位于酸性亞基的無規(guī)則卷曲部位，表位9和10位于堿性亞基的無規(guī)則卷曲部位。因為酸性亞基向外延伸較多，表面可及性強，所以與IgE的接觸數較多，相反，堿性亞基在形成六聚體時被臨近亞基遮擋，只有暴露在表面的位點可被IgE識別。

圖7 Ses i 6的B細胞構象表位分布

2.3 T細胞表位預測

2.3.1 敏感人群分析

通過分析445個十五肽段與HLA的親和性高低得到圖8—圖10所示結果。25種HLA-DR中有23種(92%)強親和肽段，20種HLA-DQ中有18種(90%)強親和肽段，9種HLA-DP中有4種(44.4%)強親和肽段，其中，HLA-DQ的敏感性整體高于HLA-DR，HLA-DP的親和性最弱。由此可見，HLA-DQ攜帶者對Ses i 6有很強的敏感性。其中，HLA-DQA10601-DQB10402的結合能力最強，可強親和32個十五肽段，攜帶該基因型的人群極有可能在誤食加工不完全的Ses i 6產品后觸發(fā)過敏癥。

圖8 Ses i 6與HLA-DR基因型的相關性分析

圖9 Ses i 6與HLA-DQ基因型的相關性分析

2.3.2 敏感人群的T細胞表位預測

分析2.3.1中敏感人群的T細胞表位發(fā)現，Ses i 6與HLA-DQA10601-DQB10402、HLA-DQA10201-DQB10402、HLA-DQA10303-DQB10402、HLA-DRB1*1601親和性最強的T細胞表位分別為FVVPQYYTSTARAGN、AGYTSVIRAMPLQVI、FVVPQYYTSTARAGN、AFKFLLALSLSLLVS，其中HLA-DQA10601-DQB10402和HLA-DQA10303-DQB10402的強親和表位一致，同時含有這兩個HLA亞型的人群，對FVVPQYYTSTARAGN過敏的可能性極大。

3 總結與展望

2007年，Beyer等[2]首次證實了Ses i 6可與54%過敏患者的IgE牢固結合反應，但之后關于Ses i 6的致敏性研究一直處于停滯期。本研究成功預測出的Ses i 6 B抗原表位，將為其致敏性研究做出貢獻。研究發(fā)現，B細胞表位中有90%為構象表位，加工變性的方式可以使一維不連續(xù)的構象表位解聚脫敏，但難以通過打斷蛋白質一級結構破壞線性表位，因此，Ses i 6致敏性研究的關注點應在其線性表位上。Wallowitz等[7]研究發(fā)現，Ses i 6可激活人體嗜堿性粒細胞。在測試的19名患者中，有58%受試者的IgE抗體可與Ses i 6結合反應，并且與核桃過敏原存在交叉反應，即多數對核桃等食物過敏的人群極有可能對芝麻制品也過敏。T細胞表位的成功預測，可以避免臨床的皮膚點刺過敏試驗，通過HLA的基因型判斷即可確診。敏感人群應該避免攝入Ses i 6制品和與Ses i 6存在交叉反應的過敏原(如核桃)，或者食用符合加工標準的Ses i 6制品。