朱 騫 趙雄濤 張 濰 周冬梅
宮頸癌(cervical cancer)是臨床上常見的惡性腫瘤,據(jù)全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(the global cancer observatory,GLOBOCAN)2018年報告,宮頸癌是女性的第四大常見惡性腫瘤[1]。衛(wèi)生部的相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,我國每年有超過13 萬宮頸癌新發(fā)病例,占全球新發(fā)病例數(shù)的25%左右,死亡病例約2~3 萬[2]。宮頸癌的診斷數(shù)據(jù)顯示,將近一半的患者已處于疾病晚期,超過了手術(shù)治療的最佳時期[3],因此化療在宮頸癌的治療中占有重要地位。以順鉑(cisplatin,DDP)為代表的鉑類藥物聯(lián)合化療被認(rèn)為是宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)化療方案[3-4]。在之前的研究中我們發(fā)現(xiàn),LncRNA CDKN1A 反義鏈啟動子DNA 損傷激動RNA(promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA,PANDAR)能夠降低宮頸癌細胞株HeLa的順鉑耐藥,并且降低HeLa細胞對順鉑的敏感性[5]。然而PANDAR究竟是通過何種機制抑制HeLa的順鉑耐藥性尚不明確。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮細胞打破細胞間和細胞間基質(zhì)黏附狀態(tài)的重要過程,賦予癌細胞化療耐藥性。本文在前期研究基礎(chǔ)上,通過生物信息學(xué)預(yù)測PANDAR的靶基因并研究PANDAR介導(dǎo)的EMT在HeLa細胞順鉑耐藥中的作用,旨在明確PANDAR對人宮頸癌細胞株HeLa順鉑耐藥性的作用機制,提供理論依據(jù)并完善研究結(jié)果。
人宮頸癌HeLa細胞株購自上海拜力公司,順鉑購自Sigma 公司,HeLa-DDP耐藥細胞株為本實驗前期建立。LV-sh-PANDAR 慢病毒載體購自和元生物技術(shù)(上海)股份有限公司。RIPA裂解液和牛血清白蛋白購自美國Sigma公司,CCK-8 試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司;Annexin VFITC/PI 凋亡試劑盒購自南京建成生物工程研究所。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor 1,TGF-β1)抗體,Smad4抗體,鈣粘附蛋白E(E-cadherin)抗體及鈣粘附蛋白N(N-cadherin)抗體購自Abcam。
HeLa 細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640 培養(yǎng)液中,于5%CO2,37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HeLa-DDP耐藥細胞株由本實驗前期建立,采用藥物濃度梯度遞增法獲得[5]。
收集HeLa或HeLa-DDP細胞,棄掉培養(yǎng)液后每孔加入1 ml RIPA裂解液,冰上裂解10 min。BCA試劑盒檢測裂解液蛋白濃度。每孔加入15 μg蛋白于聚丙烯酰胺凝膠上并進行電泳,電轉(zhuǎn)至PVDF膜上;隨后用5%牛血清白蛋白封閉1 h。4 ℃條件下一抗(E-cadherin,N-cadherin,TGF-β,Smad4)孵育PVDF膜并過夜,隨后二抗孵育。ECL發(fā)光試劑盒檢測目的蛋白的表達,Image-Pro Plus 6.0軟件定量分析目的條帶。
通過lncATLAS網(wǎng)站 (https://lncatlas.crg.eu/)預(yù)測PANDAR評估PANDAR的定位(位于細胞核)。通過RNAInter網(wǎng)站(http://www.rna-society.org/rnainter/)預(yù)測PANDAR潛在的靶基因;根據(jù)已有的實驗結(jié)果和文獻報道篩選靶基因。
0.25%胰蛋白酶消化細胞后計數(shù),以5×104個細胞/孔的密度接種于6孔板,分別用不同濃度(0、1、2、4、8和16 μg/ml)順鉑處理,48 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育4 h,酶標(biāo)儀上測定每孔在450 nm處的吸光值。
0.25%胰蛋白酶消化HeLa-DDP細胞并計數(shù),以5×105個細胞/孔的密度接種在6孔板,37 ℃培養(yǎng)過夜。用無血清的培養(yǎng)基處理細胞8 h后加入10 ng/ml的TGF-β,37 ℃作用36 h。收集細胞,將細胞重懸于400 μL Binding Buffer,加入5 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻,室溫下避光孵育15 min,加入10 μL PI并混勻,冰浴避光放置5 min,30 min內(nèi)于流式細胞儀上檢測細胞凋亡。細胞隨機分為四組:PANDAR,PANDAR + TGF-β,PANDAR + Cisplatin和PANDAR + Cisplatin + TGF-β。
應(yīng)用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析及Bonferroni事后檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
顯微鏡下觀察HeLa細胞及HeLa-DDP細胞形態(tài)發(fā)現(xiàn),HeLa細胞形態(tài)規(guī)則,呈圓形或卵圓形,細胞間緊密相連。HeLa-DDP細胞形態(tài)不規(guī)則,呈長梭形,細胞間疏散。Western blot結(jié)果表明,與HeLa細胞相比,HeLa-DDP細胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin表達量下調(diào),而間質(zhì)分子標(biāo)志物N-cadherin表達量上調(diào)(圖1)。表明HeLa-DDP細胞發(fā)生了EMT變化。
圖1 HeLa細胞及HeLa-DDP細胞形態(tài)及EMT標(biāo)志分子表達
PANDAR過表達載體處理HeLa-DDP細胞,光學(xué)顯微鏡結(jié)果顯示HeLa-DDPControl及HeLa-DDPNC細胞呈長梭形,而HeLa-DDPPANDAR細胞多呈圓形或卵圓形。Western blot結(jié)果表明與HeLa-DDPNC細胞相比,HeLa-DDPPANDAR細胞中E-cadherin表達量上升,N-cadherin表達量下降(圖2A)。
光學(xué)顯微鏡結(jié)果顯示,HeLa-DDPsh-PANDAR細胞與HeLa-DDPsh-NC細胞形態(tài)上差別不大,均呈長梭形。Western blot結(jié)果表明與HeLa-DDPsh-NC細胞相比,HeLa-DDPsh-PANDAR細胞E-cadherin表達量下降,N-cadherin表達量上升(圖2B)。
A為Western blot檢測PANDAR過表達對E-cadherin及N-cadherin表達水平的影響;B為Western blot檢測PANDAR敲減對E-cadherin及N-cadherin表達水平的影響。
RNAInter預(yù)測網(wǎng)站(http://www.rna-society.org/rnainter/)顯示Smad4為PANDAR潛在的靶基因,且這一預(yù)測結(jié)果得到ChIP-seq分析數(shù)據(jù)的支持[6-7]。Western blot結(jié)果顯示,與HeLaNC細胞中TGF-β(0.96±0.13)和Smad4 (1.07±0.15)蛋白相對表達水平比較,HeLaPANDAR細胞中TGF-β(0.28±0.06)和Smad4(0.38±0.03)蛋白的相對表達水平較低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖3A~B)。
HeLash-PANDAR細胞TGF-β蛋白相對表達水平為2.13±0.15,Smad4蛋白相對表達水平為2.67±0.18,與 HeLash-NC細胞(TGF-β:1.03±0.06;Smad4:1.05±0.03)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3C~D。
A為PANDAR過表達后TGF-β及Smad4蛋白表達水平;B為PANDAR過表達后TGF-β及Smad4蛋白相對定量結(jié)果;C為PANDAR敲減后TGF-β及Smad4蛋白表達水平;D為PANDAR敲減后TGF-β及Smad4蛋白相對定量結(jié)果。
PANDAR過表達的HeLa/DDP細胞,加入10 ng/ml的TGF-β處理,檢測EMT標(biāo)志蛋白水平的變化。光學(xué)顯微鏡顯示,TGF-β處理的HeLa-DDPPANDAR細胞排列不規(guī)則,多呈長梭形,細胞間疏散。Western blot結(jié)果顯示,與HeLa-DDPPANDAR細胞中E-cadherin(1.00±0.08)和N-cadherin(1.00±0.03)蛋白相對表達水平比較,HeLa-DDPPANDAR+TGF-β細胞中E-cadherin蛋白表達水平(0.46±0.06)相對降低,N-cadherin蛋白相對表達水平(2.58±0.13)升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖4)。
圖4 Western blot檢測E-cadherin及N-cadherin表達水平
如圖5A顯示,隨著Cisplatin濃度升高,HeLa-DDPPANDAR細胞OD450值逐漸降低。與TGF-β未處理相比,TGF-β處理的HeLa-DDPPANDAR細胞OD450值上調(diào)(圖5A)。TGF-β處理顯著降低Cisplatin誘導(dǎo)的HeLa-DDPPANDAR細胞凋亡(P<0.05),見圖5B~C。
注:A為CCK-8實驗檢測細胞活力;B為細胞凋亡定量結(jié)果;C為流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。
本文研究發(fā)現(xiàn),PANDAR抑制HeLa-DDP細胞的EMT進程。PANDAR過表達后TGF-β和Smad4蛋白表達水平顯著降低。TGF-β逆轉(zhuǎn)了PANDAR介導(dǎo)的HeLa-DDP細胞EMT進程和Cisplatin耐藥。
在不同腫瘤中,PANDAR起著抑癌或促癌的作用[8]。據(jù)報道,PANDAR可與精氨酸/絲氨酸豐富剪接因子2(SRSF2)結(jié)合,調(diào)控p53蛋白絲氨酸15磷酸化,從而降低順鉑敏感性[9]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn),PANDAR過表達可以降低HeLa-DDP細胞對Cisplatin耐受性[5]。EMT過程可通過將靜止的上皮細胞轉(zhuǎn)化為可移動的間充質(zhì)細胞并改變細胞-細胞粘附以及細胞外基質(zhì),從而顯著促進癌細胞侵襲和化學(xué)耐藥性[10-11]。在乳腺癌,黑色素瘤及結(jié)直腸癌細胞中,PANDAR敲除導(dǎo)致間充質(zhì)標(biāo)志分子(如N-鈣粘蛋白,波形蛋白,β-連環(huán)蛋白)表達降低,E-鈣粘蛋白表達升高,抑制EMT過程[12,13]。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)HeLa-DDP細胞呈現(xiàn)出明顯的間質(zhì)特性,PANDAR過表達抑制了耐藥細胞的EMT進程,而PANDAR敲除促進耐藥細胞的EMT進程。PANDAR在不同腫瘤中對EMT的作用可能與腫瘤的異質(zhì)性和PANDAR復(fù)雜的調(diào)節(jié)機制有關(guān)。
通過lncATLAS網(wǎng)站(https://lncatlas.crg.eu/)得知,lncRNA PANDAR主要定位于細胞核中。Zhang[14]等在肺癌細胞中也發(fā)現(xiàn)PANDAR主要定位于細胞核中,并通過上調(diào)芐氯素1(BECN1)激活自噬和凋亡途徑,進而抑制肺癌發(fā)展進程。PANDAR的細胞核定位決定了其可通過直接與靶基因結(jié)合來激活或抑制靶基因的表達。通過ChIP-seq分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),PANDAR能與Smad4結(jié)合[6-7]。Smad4在TGF-β作用下,可轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)并于轉(zhuǎn)錄因子一起介導(dǎo)靶基因的抑制或激活。研究表明,腫瘤微環(huán)境中接近腫瘤血管的癌癥干細胞接受并響應(yīng)TGF-β信號,使癌癥干細胞細胞分裂變緩,從而避開一些靶向快速分裂細胞的抗癌療法(如順鉑治療)[15]。此外,TGF-β/Smad4信號通路通過誘導(dǎo)Snail1/2,ZEB1/2等轉(zhuǎn)錄因子的表達,促進誘導(dǎo)細胞發(fā)生EMT變化,使細胞對化療藥物表現(xiàn)出更強的耐受性[16-17]。本文研究發(fā)現(xiàn),PANDAR的過表達顯著下調(diào)了TGF-β和Smad4蛋白的表達水平;TGF-β處理PANDAR過表達的HeLa-DDP細胞,研究PANDAR過表達對HeLa-DDP細胞EMT進程和耐藥性影響的機制,結(jié)果證明TGF-β可逆轉(zhuǎn)PANDAR 過表達對HeLa-DDP細胞EMT的抑制作用。此外,TGF-β過表達逆轉(zhuǎn)了PANDAR過表達誘導(dǎo)的HeLa-DDP細胞凋亡。考慮到TGF-β介導(dǎo)凋亡和EMT是一個相互排斥和相互關(guān)聯(lián)、受到某些因素調(diào)控并因此處于動態(tài)平衡的過程[18],提示PANDAR可能通過TGF-β/Smad4調(diào)控宮頸癌EMT和凋亡的動態(tài)平衡過程。
綜上所述,聯(lián)合前期的研究成果,我們發(fā)現(xiàn)了PANDAR調(diào)節(jié)HeLa-DDP細胞耐藥性較完整的分子機制,即PANDAR通過抑制TGF-β/Smad4通路影響HeLa細胞的EMT進程,進而影響其耐藥性。這一研究發(fā)現(xiàn)為減輕宮頸癌的耐藥性和探索更有效的治療方法提供了理論依據(jù)。