陳燕晶 楊麗蘭 譚布珍 胡 輝

卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮體癌，但死亡率卻居?jì)D科腫瘤首位，嚴(yán)重威脅女性生命和健康[1]。卵巢癌診斷時(shí)大部分有腹盆腔轉(zhuǎn)移，確診時(shí)多屬中晚期，卵巢癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移是造成卵巢癌治療困難的主要原因[2]。腫瘤細(xì)胞耐藥的發(fā)生和化療藥物產(chǎn)生的不良反應(yīng)嚴(yán)重影響著其治療效果，甚至導(dǎo)致化療失敗、腫瘤復(fù)發(fā)[3]。盡管最近在手術(shù)和化療方面取得了進(jìn)展，但總的來說卵巢癌患者5年生存率僅為40%[4]。為了提高卵巢癌的診斷和治療水平，有必要進(jìn)一步了解卵巢癌發(fā)病的分子機(jī)制。大量研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥機(jī)制復(fù)雜[5-10]。

從天然產(chǎn)物中尋找抗腫瘤活性成分是發(fā)展抗腫瘤藥物的重要策略之一，雷公藤是我國(guó)一種資源比較豐富的傳統(tǒng)中草藥，其結(jié)構(gòu)多樣，有效成分具有明顯的抗炎、免疫抑制和抗腫瘤等作用。雷公藤內(nèi)酯醇(TP)作為最著名的天然產(chǎn)物之一，長(zhǎng)期以來在中國(guó)被用作類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的消炎藥，也被認(rèn)為是治療各種癌癥的潛在藥物[11-17]，盡管有研究表明其對(duì)動(dòng)物肝臟、腎臟、睪丸、卵巢和心臟有潛在毒性[18]。有研究表明，TP對(duì)各種癌癥模型具有廣泛的抗癌作用[19-24]。近年來隨著對(duì)耐藥性腫瘤研究的深入，大量研究證實(shí)，TP比傳統(tǒng)抗腫瘤藥物如紫杉醇、順鉑、多柔比星等具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性[25]，且某些對(duì)傳統(tǒng)藥物耐藥的腫瘤細(xì)胞，對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇卻十分敏感。我們課題組長(zhǎng)期以來一直研究雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)耐順鉑人上皮性卵巢癌的抑制作用，取得了一定的研究成果。本研究采用SKOV3細(xì)胞小鼠成瘤模型研究了TP的抗癌作用，并通過分析腫瘤微環(huán)境相關(guān)細(xì)胞因子及蛋白表達(dá)的改變研究TP的抗癌作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物

SKOV3細(xì)胞(購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫)；BALB/c-nu小鼠6只(生產(chǎn)廠家：湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0002)

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

DMEM完全高糖培養(yǎng)液(凱基生物 KGM12800S-500)；雷公藤內(nèi)酯醇(ST8290Solarbio)；TUNEL檢測(cè)試劑盒(C1088，碧云天)；RIPA細(xì)胞裂解液(C1053，北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；PVDF膜(IPVH00010，Millipore)；超敏發(fā)光液(RJ239676，賽默飛)；Mouse Monoclonal Anti-GAPDH(TA-08，中杉金橋，1/2000)；辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG(H+L)(ZB-2305，中杉金橋,1/2000)；Rabbit Polyclonal Anti-BDNF ((DF6387，Affinity，1/1000)；Rabbit Polyclonal Anti-TrkB (AF6461，Affinity，1/1000)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(ZB-2301，中杉金橋，1/2000)；酶標(biāo)儀(RT-6100，Rayto)；蛋白垂直電泳儀(DYY-6C，北京市六一儀器廠)；超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Chemi DocTM XRS+，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)；顯微鏡(CX41 OLYMPUS)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

收集細(xì)胞后，棄去培養(yǎng)上清，1×PBS洗兩遍，0.25%胰酶(含0.02% EDTA)在37 ℃培養(yǎng)箱中消化2 min，加入培養(yǎng)基終止消化并懸起細(xì)胞；收集細(xì)胞至10 ml離心管中，1000 rpm離心3 min，棄盡上清，加入培養(yǎng)基吸管吹勻；將上述細(xì)胞懸液稀釋至適宜細(xì)胞密度后加入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中，置于37℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 裸鼠成瘤

每只Balb/c-nu小鼠均進(jìn)行右側(cè)腋下皮下注射接種SKOV3細(xì)胞5×106個(gè)，每2天測(cè)量一次裸鼠體重并使用游標(biāo)卡尺測(cè)量裸鼠的腫瘤大小，當(dāng)腫瘤長(zhǎng)到5 mm左右時(shí)開始腹腔注射給藥。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

SKOV3組：每只裸鼠按0.15 ml/10 g劑量腹腔注射生理鹽水。1次/天，連續(xù)給藥14天；SKOV3+雷公藤內(nèi)酯醇(8 ng/ml)組：每只裸鼠按0.15 ml/10 g劑量腹腔注射10 μg/ml的雷公藤內(nèi)酯醇注射液，1次/天，連續(xù)給藥14天。外周血取樣：摘眼球法取血，靜置后離心取上清用于ELISA檢測(cè)；處死：裸鼠頸椎脫臼處死；切開瘤體處皮膚，暴露皮下組織并仔細(xì)觀察瘤體；用手術(shù)剪與手術(shù)鑷分離瘤體與周邊組織，將腫瘤完整剝離；將取下的瘤體用電子天平稱重并記錄，用游標(biāo)卡尺測(cè)瘤體大小，記錄并拍照實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；將取下的瘤體一部分置于10%甲醛溶液內(nèi)固定并存放于4 ℃冰箱內(nèi)。用于HE、免疫組化、TUNEL檢測(cè)。剩余的部分用于WB檢測(cè)。ELISA檢測(cè)、WESTERN-blot檢測(cè)、TUNEL染色檢測(cè)凋亡、HE染色及免疫組化均按試劑盒步驟操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)t檢驗(yàn)判定顯著性差異，以P<0.05作為顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 成瘤大小

表1可見，SKOV3+TP組成瘤體積大小明顯小于SKOV3組成瘤體積大小(P<0.05)。

表1 2組成瘤體積大小比較

2.2 血清IL-2、HIF-1α、TNF-α和CSF-1比較

加入TP干預(yù)后，SKOV3+TP組中血清IL-2及TNF-α都明顯高于SKOV3組，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而SKOV3+TP組中血清HIF-1α及CSF-1都明顯低于SKOV3，兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

圖1 2組中各細(xì)胞因子的比較

2.3 腫瘤凋亡檢測(cè)

如表2所示，SKOV3+TP組細(xì)胞凋亡數(shù)明顯多于SKOV3組(P<0.05)。

表2 2組細(xì)胞凋亡數(shù)比較

2.4 2組HE染色及免疫組化

HE染色可見細(xì)胞異型性，核漿比增高，存在巨核和多核改變。表3可見：SKOV3組MMP-2中腫瘤細(xì)胞絕大部分胞漿呈棕黃色，陽性率達(dá)100%；SKOV3+TP組MMP-2中腫瘤細(xì)胞部分胞漿呈淡黃色，陽性率為16.7%。表4可見：SKOV3組VEGF-1中腫瘤細(xì)胞絕大部分胞漿呈棕黃色，陽性率達(dá)100%，SKOV3+TP組VEGF-1中腫瘤細(xì)胞部分胞漿呈淡黃色，陽性率為0%。

表3 2組MMP-2蛋白表達(dá)陽性率比較

表4 2組VEGF-1蛋白表達(dá)陽性率比較

2.5 2組MMP-2 和VEGF-1蛋白表達(dá)的差異

如圖2所示：TP作用后，腫瘤組織中MMP-2及VEGF-1蛋白表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

圖2 2組MPP-2 和VEGF-1蛋白表達(dá)情況

3 討論

卵巢癌是致死率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其病理類型眾多，以上皮性最為常見。順鉑在發(fā)揮抗腫瘤效用的同時(shí)，激活了細(xì)胞內(nèi)抗凋亡通路，從而削弱了癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，成為順鉑充分發(fā)揮其抗腫瘤效用的絆腳石[26]。雷公藤內(nèi)酯醇作為一種著名的植物化學(xué)物質(zhì)，通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)多種腫瘤的凋亡來實(shí)現(xiàn)其多效性抗癌活性[27]。TP在體內(nèi)外均具有抑制癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用。TP還被證實(shí)在誘導(dǎo)耐藥多發(fā)性骨髓瘤和宮頸癌細(xì)胞凋亡方面有效[28]。我們前期工作發(fā)現(xiàn)TP對(duì)耐順鉑上皮性卵巢癌的抑制作用機(jī)制[29-33]，主要研究了TP作用于凋亡信號(hào)通路抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究圍繞腫瘤微環(huán)境，通過體內(nèi)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TP可以抑制SKOV3細(xì)胞腫瘤大小，通過改變腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤發(fā)生凋亡。

CSF-1是具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，有多種細(xì)胞可以產(chǎn)生CSF-1，它能刺激單核吞噬細(xì)胞家族的增殖、分化與存活，CSF-1的主要功能之一就是刺激巨噬細(xì)胞的分化和生長(zhǎng)[34]。有研究表明，CSF-1在許多惡性腫瘤中異常高表達(dá)[35]。CSF-1在卵巢癌中是高表達(dá)的[36]。由于腫瘤細(xì)胞周圍存在局部缺氧環(huán)境，因此腫瘤細(xì)胞需要通過基因表達(dá)的改變，如上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)激活細(xì)胞增殖，促進(jìn)血管新生和下調(diào)細(xì)胞凋亡水平適應(yīng)整個(gè)腫瘤微環(huán)境的變化，使其在缺氧條件下繼續(xù)存活甚至進(jìn)行增殖。隨著研究的不斷深入，監(jiān)測(cè)腫瘤組織中HIF-1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)輔助卵巢癌的早期診斷和預(yù)測(cè)其侵襲性，已受到越來越多的關(guān)注[37]。細(xì)胞因子是由免疫系統(tǒng)細(xì)胞以及其他多種類型的細(xì)胞分泌的一類小分子蛋白質(zhì)，包括淋巴因子、干擾素(IFN)、IL、TNF和集落刺激因子等。有研究已證實(shí)IL誘導(dǎo)NO合成是其抗腫瘤作用的機(jī)制之一，不僅IL能作用于腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用，其他類別的IL也能參與到腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展機(jī)制中[38]。TNF主要是由活化的單核或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)中性 粒細(xì)胞聚集吞噬，可引起卵巢表面上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，降低卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)，可使約40%的腫瘤MHC-I、腫瘤抗原提呈蛋白表達(dá)增強(qiáng)[39]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過加入TP后會(huì)引起SKOV3腫瘤血清中的IL-2及TNF-α上升，血清HIF-1α和CSF-1下降，從而影響了腫瘤的生長(zhǎng)。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是參與降解全身各種組織細(xì)胞外基質(zhì)(extra-cellularmatrix，ECM)的蛋白酶家族。MMP-2在腫瘤的血管化、腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移灶的形成過程起重要作用。MMP-2具有降解血管基底膜中的膠原的能力，與腫瘤新生血管形成和生理?xiàng)l件下及病理?xiàng)l件下腫瘤轉(zhuǎn)移等有關(guān)。MMP-2的表達(dá)和活性水平的改變與多種癌癥的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究表明，雷公藤內(nèi)酯醇會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞MMP-2的表達(dá)[40-46]，其中眾多的生長(zhǎng)因子參與了腫瘤生理病理血管的生成過程，尤其是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的調(diào)控作用最為重要[47]。有研究表明，VEGF在卵巢癌組織中是高表達(dá)，且高表達(dá) VEGF的卵巢癌更易發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移。VEGF是促進(jìn)增殖、遷移和毛細(xì)血管生長(zhǎng)的關(guān)鍵血管生成因子[48-49]。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過加入TP后會(huì)引起SKOV3腫瘤組織中的MMP-2和VEGF表達(dá)下降，這結(jié)果說明TP可能是通過抑制MMP-2和VEGF表達(dá)，從而影響了腫瘤的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)凋亡發(fā)生。

綜上所述，雷公藤內(nèi)酯醇具有顯著抑制人上皮性卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡的作用。TP作用SKOV3細(xì)胞株后，血清CSF-1、HIF-1α和組織中MMP-2和VEGF表達(dá)會(huì)下降，通過上調(diào)血清IL-2及TNF-α表達(dá)，改變腫瘤微環(huán)境，從而影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，最終誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生凋亡。