陳 毅，鄔 俊，王 貴，李 雙，王唯婷，李學濤，王曉波*

（1.大連醫(yī)科大學 藥學院，遼寧 大連 116044；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第967 醫(yī)院 藥劑科，遼寧 大連 116021）

在全球范圍內(nèi)男性癌癥患者中，肺癌是僅次于前列腺癌的第二大常見癌癥。非小細胞肺癌約占所有肺癌的80%，約75%的患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，患者的5 年生存率很低[1-2]，且部分患者已經(jīng)發(fā)生了癌癥轉(zhuǎn)移。

R8（八精氨酸）是一種細胞穿膜肽，是一種能攜帶大分子物質(zhì)進入細胞的短肽，能夠促進細胞對大分子的攝取[3]。鹽酸柔紅霉素（Daunorubicin，DNR）是一種在白血病治療中比較常見的藥物，但是因患者對DNR 較易產(chǎn)生耐藥性和其強烈的骨髓抑制、心臟毒性等嚴重不良反應，使得該藥物的使用受到一定限制。和厚樸酚（Honokiol，HNK）是中藥厚樸干皮中的一種聯(lián)苯二酚類化合物，已有研究表明HNK 能夠通過下調(diào)間充質(zhì)標志物的表達和上調(diào)上皮標志物的表達來抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。此外，HNK 具有下調(diào)多種基質(zhì)金屬蛋白酶的作用[4]。但上述兩種藥物都有半衰期短、口服生物利用度低等缺點，由于兩種藥物都有較好的抗腫瘤活性，因此可以通過嘗試改變藥物在體內(nèi)的傳遞方式來解決其中的一些問題。藥物遞送的最終目標是通過在特定作用部位釋放有效藥物成分來提高生物利用度并減少其毒副作用。近年來，脂質(zhì)體一直是劑型開發(fā)中較為重視的藥物遞送系統(tǒng)之一[5]，脂質(zhì)體可以將各種活性化合物封裝在其脂質(zhì)雙層或親水性核心中。若以一些特定的配體進行修飾，既可以提高藥物的腫瘤靶向性，也可以增加生物利用度，減小藥物的副作用[6]。本研究制備了R8穿膜肽修飾的DNR/HNK 脂質(zhì)體，并對制備的脂質(zhì)體能否有效的被攝取以及該脂質(zhì)體的體內(nèi)外抗腫瘤活性進行研究，以期為藥物開發(fā)提供新思路。

1 材料與試劑

人非小細胞肺癌細胞（A549）獲得于中科院細胞庫（中國上海）。細胞培養(yǎng)在含有10 %胎牛血清（Gibco；Thermo Fisher Scientific, Inc.） 和 100 U/mL青霉素和100μg/mL 鏈霉素（Gibco；Thermo Fisher Scientific, Inc.） 的DMEM（Gibco；Thermo Fisher Scientific, Inc.）的完全培養(yǎng)基中。長鏈二烷基羰花青化合物（DiR，KGMP0026）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；鹽酸柔紅霉素（DNR，MB1074-2）和厚樸酚（HNK，MB5989-2）購自大連美侖生物科技有限公司；DSPE-PEG2000-R8（遼寧中醫(yī)藥大學藥劑教研室合成并提供）。

YA1071 透析袋（北京索萊寶科技有限公司）；Mastersizer3000 激光粒徑測定儀（英國Malvern 公司）；葡聚糖凝膠SephadexG-50 柱（上海華藍化學科技有限公司）；MMP-2、MMP-9、VEGF 和bFGF 的ELISA 試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；卵磷脂（L8260，北京索萊寶科技有限公司）；膽固醇（C8280，北京索萊寶科技有限公司）；試驗用水為超純水。

2 方法

2.1 脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)考察

2.1.1 脂質(zhì)體的制備 采用薄膜分散法-硫酸銨梯度法[7]制備脂質(zhì)體。在圓底燒瓶中加入處方量的膽固醇4 mg、卵磷脂22 mg、DSPE-PEG2000 2 mg、DSPE-PEG2000-R81 mg、HNK 2 mg 與甲醇混勻，超聲使之溶解，在40 ℃水浴下減壓蒸發(fā)至形成一層薄膜，加入5 mL 250 mM/L（NH4）2SO4溶液并超聲處理使薄膜溶解，然后將其轉(zhuǎn)移至10 mL EP 管中，用超聲波細胞破碎機超聲10 min（500 W），混懸液用0.22 μm 微孔濾膜過濾兩次，隨后轉(zhuǎn)移至透析袋（截留分子量12 000 ～ 14 000 Da）在PBS溶液中透析24 h，每8 h 更換一次PBS。

在圓底燒瓶中加入處方量的DNR 1 mg 與上述透析完成的脂質(zhì)體于40 ℃水浴中振搖20 min，即得R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體。處方中不加入DNR/HNK，其余操作步驟同上，即得R8-空白脂質(zhì)體。處方中不加入DSPE-PEG2000-R8，其余操作步驟同上，即得DNR/HNK 脂質(zhì)體。處方中不加入DSPE-PEG2000-R8和HNK，其余操作步驟同上，即得DNR 脂質(zhì)體。處方中不加入DSPE-PEG2000-R8和DNR，超聲破碎機超聲完畢即得HNK 脂質(zhì)體。

2.1.2 脂質(zhì)體包封率的測定 取500 μL R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體至凝膠柱上方，加入PBS 進行洗脫，當液體出現(xiàn)紅色時開始用5 mL 容量瓶收集，直至紅色完全流出即收集完畢。向容量瓶中加入PBS 緩沖液定容至5 mL，混勻。精密吸取500 μL 于EP 管中，再加入等體積甲醇溶液破乳。按照各自色譜條件分別測定溶液中DNR 和HNK 濃度，并分別計算脂質(zhì)體中兩種藥物的含量。

另取500 μL R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體至5 mL 容量瓶中，用PBS 定容。精密吸取500 μL 于EP 管中，再加入等體積甲醇溶液破乳。按照HPLC 條件分別測定溶液中DNR 和HNK 濃度，并分別計算兩種藥物總含量。根據(jù)如下公式分別計算脂質(zhì)體中DNR 和HNK 的包封率：包封率（%） =W1/W0× 100%。其中，W1為脂質(zhì)體中藥物含量，W0為總藥物含量。

2.1.3 脂質(zhì)體的理化性質(zhì)表征 吸取制備的脂質(zhì)體溶液適量，以PBS 溶液稀釋50 倍。取稀釋后的脂質(zhì)體溶液適量，滴加至專用銅網(wǎng)上，以用體積分數(shù)為2%磷鎢酸溶液染色，室溫晾干，然后置于透射電子顯微鏡上（加速電壓：120 kV）觀察其形態(tài)[8]。

采用激光散射粒徑測定儀測定脂質(zhì)體的粒徑等指標，取脂質(zhì)體溶液200 μL，使用激光散射粒徑測定儀測定脂質(zhì)體的粒徑及Zeta 電位（每次設定循環(huán)10 次）[9]。

2.2 細胞活力測定

A549 細胞在96 孔板（2 × 104個/孔）中37℃孵育箱過夜，并用R8-空白脂質(zhì)體、DNR 脂質(zhì)體、HNK脂質(zhì)體、DNR/HNK 脂質(zhì)體、R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體分別處理細胞48 h（使得各組柔紅霉素終濃度為1.093 75、2.187 5、4.375、8.75、17.5、35 和70 μM/mL）。每孔共加入20 μL CCK8，將96 孔板于37°C 再培養(yǎng)3 h 后在酶標儀測定450 nm 波長處的吸光度，每組設置4 個復孔。計算細胞存活率：細胞存活率（%） =OD給藥組/OD空白對照組× 100%。結果使用 Graphpad-Prism-5 軟件計算各組脂質(zhì)體的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

2.3 傷口愈合測定

A549 細胞在6 孔板（6 × 105個/孔）中37℃孵育箱過夜，待其生長融合至80% ～ 90%，用200 μL移液器吸頭在孔中小心地劃出一個傷口，棄去完全培養(yǎng)基，然后用 PBS 清洗兩次以除去漂浮細胞。分別加入DNR 脂質(zhì)體、HNK 脂質(zhì)體、DNR/HNK 脂質(zhì)體、R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體，使得體系中DNR 終濃度為7 μM/mL，HNK 終濃度為17.5 μM/mL，空白對照組加入相同體積的培養(yǎng)基，各組在含有體積分數(shù)為1%血清培養(yǎng)液中繼續(xù)孵育24 h，使用倒置顯微鏡分別獲取0、12 和24 h 遷移圖像并分析。

2.4 Transwell 遷移實驗

A549 細 胞 在6 孔 板（6 × 105個/孔）中37 ℃孵育箱過夜，棄去完全培養(yǎng)基，然后用 PBS 清洗兩次，隨后胰酶消化，離心后用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，計數(shù)調(diào)整細胞使得Transwell 小室內(nèi)細胞為4 ×104個。分別加入DNR 脂質(zhì)體、HNK 脂質(zhì)體、DNR/HNK 脂質(zhì)體、R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體，使得DNR 終濃度為7 μM/mL，HNK 終濃度為17.5 μM/mL，空白對照組加入相同體積的培養(yǎng)基，將細胞懸液與各組別脂質(zhì)體混合加入上室，使得上室體積為200 μL，下室添加700 μL 含有體積分數(shù)為15% FBS 的培養(yǎng)基作為誘引劑。孵育箱中孵育48 h，用棉簽刮去上室沒有遷移的細胞，小室膜外側(cè)細胞用4%多聚甲醛固定15 min，用質(zhì)量分數(shù)為0.4%結晶紫室溫染色20 min，使用倒置顯微鏡獲取圖像。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附法測定MMP-2、MMP-9、VEGF、bFGF 的表達

A549 細胞在6 孔板（6 × 105個/孔）中37 ℃孵育箱過夜，分別加入DNR 脂質(zhì)體、HNK 脂質(zhì)體、DNR/HNK 脂質(zhì)體、R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體，使得DNR終濃度為7 μM/mL，HNK 終濃度為17.5 μM/mL，分別處理細胞24 h。用預冷的PBS 清洗細胞，含有1%PMSF 的RIPA 細胞裂解液裂解細胞并收集細胞總蛋白。使用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定各樣品蛋白濃 度。使 用MMP-2、MMP-9、VEGF、bFGF 四 種ELISA檢測試劑盒來定量分析四種蛋白質(zhì)的表達情況。

2.6 體外攝取

使用流式細胞儀考察脂質(zhì)體在體外的攝取情況，將A549 細胞在6 孔板（5 × 105個/孔）中37℃孵育箱過夜，分別使用游離DNR（終濃度為7 μM/mL），DNR 脂質(zhì)體（終濃度為7 μM/mL），R8-DNR/HNK脂質(zhì)體（終濃度為7μM/mL）處理細胞1、2、3 h。棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗除去懸浮的細胞，用胰酶消化各孔細胞，離心棄去培養(yǎng)基，用PBS 重懸細胞，進入流式細胞儀進行檢測。

2.7 體內(nèi)攝取

2.7.1 荷瘤小鼠模型建立 取對數(shù)生長期的A549細胞胰酶消化，進行細胞計數(shù)，取5 × 106個細胞混懸于200 μL 生理鹽水中，小鼠腋下注射，繼續(xù)飼養(yǎng)10 d，每天觀察并用游標卡尺測量瘤體大小，待腫瘤體積達到90 mm3時，進行后續(xù)實驗。

2.7.2 DiR 脂質(zhì)體的制備 采用活體成像實驗考察脂質(zhì)體的體內(nèi)靶向性。將DNR 藥物替換為DiR，分別制備DiR 脂質(zhì)體和R8-DiR/HNK 靶向脂質(zhì)體，卵磷脂和DiR 的比例為200 ∶1（w/w），按“2.1.1”項下方法制備。

2.7.3 體內(nèi)攝取 當荷瘤小鼠成功造模后，對各組荷瘤小鼠分別尾靜脈注射游離DiR、DiR 脂質(zhì)體和R8-DiR/HNK 脂質(zhì)體，空白對照給予生理鹽水，每組3 只。各給藥組的DiR 劑量均為2 μg/只。使用光學成像系統(tǒng)分別于給藥后1、3、6、12 和24 h對小鼠進行熒光成像并觀察記錄。

2.8 統(tǒng)計學方法

用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體制備的最優(yōu)處方及理化性質(zhì)表征

運用星點設計-響應面法以及本實驗室制備經(jīng)驗[10]，確定脂質(zhì)體的最優(yōu)處方為：卵磷脂22 mg、膽固醇4 mg、DNR 1 mg、HNK 2 mg、處方量為5 mL。根據(jù)最優(yōu)處方制備的脂質(zhì)體計算得DNR 平均包封率為（93.53 ± 0.17） %，HNK平均包封率為 （87.27 ± 0.58） %，兩藥平均包封率為（91.73 ± 0.11）%。符合2020 年版《中國藥典》（四部）對微粒制劑包封率不低于80%的要求。脂質(zhì)體的粒徑為（87.17 ± 1.19）nm（n= 3），Zeta 電位為（-2.0 ± 0.9）mV（n= 3）, 形態(tài)呈圓形，粒徑均一，分散均勻，結果見圖1。

3.2 細胞活力測定

R8-空白脂質(zhì)體沒有細胞毒性，HNK 作為脂質(zhì)體調(diào)節(jié)劑，低濃度情況下對細胞幾乎無毒，DNR 脂質(zhì)體的細胞毒性隨著劑量的加大而增大，R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體對A549 細胞的毒性最強，以脂質(zhì)體中DNR 濃 度 計 算，IC50為（9.79 ± 0.87）μM/mL；而DNR/HNK脂質(zhì)體的IC50為（11.57 ± 0.88） μM/mL。以上結果表明，R8修飾的脂質(zhì)體對A549 細胞有明顯的抑制作用（P＜0.05），見圖2。

3.3 傷口愈合試驗和Transwell 試驗

為了驗證本研究制備的脂質(zhì)體是否能在體外抑制A549 細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，采用了傷口愈合試驗和Transwell 試驗。靶向材料修飾的脂質(zhì)體能顯著抑制A549 細胞的遷移，并且這種作用明顯大于無靶向材料修飾脂質(zhì)體（P< 0.05）。Transwell 試驗也表明R8修飾的脂質(zhì)體能更好的抑制細胞的遷移（P< 0.05），這與傷口愈合試驗結果一致，見圖3。

3.4 酶聯(lián)免疫吸附法測定MMP-2、MMP-9、VEGF、bFGF 的表達

MMP-2、MMP-9、VEGF和bFGF蛋白通過ELISA試劑盒檢測。DNR/HNK 脂質(zhì)體和R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體處理組的MMP-2、MMP-9、VEGF 和bFGF 蛋白表達均明顯降低（P< 0.05），其中R8-DNR/HNK脂質(zhì)體的降低幅度最大，見圖4。

3.5 體外攝取

各組細胞對藥物的吸收量為：游離的DNR ＞R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體＞DNR 脂質(zhì)體＞R8-空白脂質(zhì)體對照組。結果表明：R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體在A549細胞中吸收最好。由于DNR 的糖苷配基是熒光發(fā)光基團，因此選擇制備上述三種脂質(zhì)體。結果表明以R8為靶向材料可以增加細胞對藥物的攝取，見圖5。

3.6 體內(nèi)藥物攝取

給予荷瘤裸鼠各組別脂質(zhì)體后進行活體圖像，來評估藥物在荷瘤小鼠的體內(nèi)分布，同時比較不同組間的熒光強度差別。對于DiR 游離藥在1 h 時即能檢測到強熒光，但隨著時間推移熒光強度降低較大，而靶向材料修飾的脂質(zhì)體組在24 h 時仍能檢測到熒光信號，同時靶向材料修飾的脂質(zhì)體組在給藥初期能更好的在體內(nèi)分布。上述結果表明R8修飾的脂質(zhì)體在荷瘤小鼠體內(nèi)循環(huán)時間最長，并在腫瘤部位明顯積累，這可能是DSPE-PEG2000 的加入和R8的修飾增加了脂質(zhì)體的水溶性和靶向性，從而增加了脂質(zhì)體的主動靶向性，見圖6。

4 討論

本研究構建了R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體，并對脂質(zhì)體的包封率、粒徑、Zeta 電位等理化性質(zhì)進行表征。結果表明，脂質(zhì)體的各項理化指標都在合理范圍內(nèi)，脂質(zhì)體形態(tài)呈均勻的圓形，粒徑均在100 nm 左右，這個粒徑大小有助于脂質(zhì)體通過EPR 效應在腫瘤部位聚集。同時對脂質(zhì)體的抗腫瘤作用進行了評價，分別考察了所制備的5 種脂質(zhì)體對A549 的細胞毒性，R8-空白脂質(zhì)體沒有細胞毒性，這也說明載藥脂質(zhì)體產(chǎn)生的細胞毒性由藥物自身引起的。通過考察脂質(zhì)體作用后轉(zhuǎn)移相關蛋白MMP-2、MMP-9、VEGF 和bFGF 表達的變化，探索了制備的脂質(zhì)體抑制遷移的潛在機制。MMP-2、MMP-9 具有破壞基底膜，促進癌細胞遷移的作用，因此，抑制這兩種蛋白的表達對于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移具有重要意義。最后考察了脂質(zhì)體在體內(nèi)的長循環(huán)效應，制備的脂質(zhì)體能延長藥物在體內(nèi)的蓄留時間，在腫瘤部位的藥物濃度也得到了明顯提升。

R8-DNR/HNK 脂質(zhì)體具有良好的抗腫瘤效果主要可能依賴以下三個方面：1. 構建的脂質(zhì)體具有理想的理化性質(zhì)；2. R8作為靶向材料對脂質(zhì)體表面進行修飾，大大增加了藥物在腫瘤部位的蓄積和腫瘤細胞對藥物的攝?。?. HNK 作為調(diào)節(jié)劑，增強化療藥物的作用，主要通過調(diào)節(jié)相關蛋白（MMP-2、MMP-9、VEGF 和bFGF）來增強對非小細胞肺癌細胞的抑制作用。

5 結論

根據(jù)最優(yōu)處方制備的脂質(zhì)體能夠通過多方面因素在體外明顯抑制A549 細胞的生長以及侵襲，同時能明顯提高腫瘤細胞對藥物的攝取能力，增加藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間。本研究初步確定了制備的脂質(zhì)體的抗腫瘤活性，為后續(xù)藥物劑型開發(fā)提供了理論依據(jù)。

收稿日期：2021-12-09