王歡 薛健

(吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132101)

前言

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)主要由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等多種真菌代謝產(chǎn)生，能夠污染谷物、堅(jiān)果、干果及中藥材等，在自然條件下性質(zhì)非常穩(wěn)定[1,2]。AFT屬于二呋喃香豆素衍生物，其基本結(jié)構(gòu)中均含有二呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)?香豆素)，在紫外光照射下可產(chǎn)生熒光。其中，黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最強(qiáng)。AFB1具有極高的致突變性、毒性和致癌性[3]，其致癌性是氰化鉀的10倍，毒性是砒霜的68倍，是誘發(fā)原發(fā)性肝癌的最主要的原因，同時(shí)也會(huì)對(duì)胰臟、脾臟等器官有輕微的影響，造成機(jī)體免疫力下降，生長(zhǎng)遲緩[4]。

在產(chǎn)AFT真菌中，寄生曲霉是常見(jiàn)的產(chǎn)毒曲霉之一，對(duì)人類的生產(chǎn)、生活造成了極大的危害。能夠產(chǎn)生AFT的黃曲霉菌株有30%～60%，而幾乎所有的寄生曲霉菌株均產(chǎn)生AFT，而且寄生曲霉嗜干燥，在適宜生長(zhǎng)條件下可快速繁殖。寄生曲霉除能夠產(chǎn)生AFT外，還能產(chǎn)生腎臟毒素—曲酸(Kojic acid)[5]，不僅會(huì)感染動(dòng)物，使動(dòng)物致病致死，還會(huì)導(dǎo)致人體發(fā)生急性肝中毒、慢性肝中毒、慢性腎臟損傷，甚至致癌、致畸、致突變。

目前寄生曲霉污染的檢測(cè)主要集中在對(duì)黃曲霉毒素含量的檢測(cè)上，且常用的方法有薄層色譜法、高效液相色譜法和ELISA法[6]。而這些方法不能從源頭上對(duì)寄生曲霉的污染進(jìn)行防治，且存在儀器復(fù)雜、樣品處理繁瑣及價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。為此，本研究針對(duì)寄生曲霉合成黃曲霉毒素的關(guān)鍵基因柄曲霉素轉(zhuǎn)甲氧基酶基因Omt-1、調(diào)節(jié)基因aflR[7]，建立一種改良的溶菌酶-CTAB法進(jìn)行黃曲霉的快速、靈敏、高效的分子檢測(cè)方法。該方法簡(jiǎn)單便捷，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，可作為防控AFT污染的有效方式。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試菌株

黑曲霉、米曲霉、產(chǎn)黃青霉和釀酒酵母是本實(shí)驗(yàn)室保藏，寄生曲霉(AS 3.4407)購(gòu)自北京微生物研究所。

1.1.2 試劑與儀器

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉0.3%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、氯化鉀0.05%、硫酸亞鐵0.001%、蔗糖3%、瓊脂粉2%，pH自然，121℃、滅菌25min。

溶菌酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs，生工生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DHP-9052恒溫培養(yǎng)箱(南京卓鼎干燥設(shè)備廠)；R404A離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf)；TP600 PCR(大連Takara公司)；JY600PJ電泳儀(北京君意東方電泳有限公司)；LAS500凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)GE公司)；Biospec-nano核酸濃度測(cè)定儀(日本SHIMADZU公司)。

1.2 方法

1.2.1 寄生曲霉基因組DNA的提取

使用溶菌酶-CTAB法提取寄生曲霉基因組DNA。刮取活化后的菌絲于1mL無(wú)菌生理鹽水中，10000rpm、離心5min，漂洗2次。棄上清，稱取100mg沉淀，加入100μL 1M Tris-HCL，20μL 1M EDTA，5mg·mL-1溶菌酶，混勻。30℃溫育30min。再加入1mL CTAB裂解液60℃溫育30min，每隔10min振蕩1次。12000rpm離心10min，向上清中加入等體積24∶1的氯仿和異戊醇混合液，旋渦振蕩后靜置5min,12000rpm、4℃離心5min，重復(fù)2次。取上清，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，輕輕混勻，于4℃靜置5min，12000rpm、離心5min，棄上清。用0.5mL 70%乙醇洗滌沉淀后，12000rpm、離心10min，棄上清，自然風(fēng)干2～3min。使用30μL TE溶解沉淀，于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

選擇寄生曲霉參與黃曲霉毒素合成的關(guān)鍵基因作為PCR檢測(cè)的靶基因，包括柄曲霉素轉(zhuǎn)甲氧基酶基因Omt-1、產(chǎn)黃曲霉毒素調(diào)節(jié)基因aflR[8-10]，使用Premier Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，2對(duì)引物序列分別為Omt-F:GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC，Omt-R：GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG；aflR-F：AGAAT AGCTTCGCAGGGTGGT，aflR-R：AGTCTGGGAGGAA CGGATCG。由吉林庫(kù)美生物有限公司合成引物。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系與檢測(cè)條件

本研究所需的PCR反應(yīng)體系包括DNA模板3μL，Taq酶1μL，上、下游引物各0.5μL，dNTPs 1μL，10×PCR buffer 2.5μL,ddH2O 16.5μL，反應(yīng)總體積為25μL。反應(yīng)前將PCR管置于冰上，依次加入各組分后輕輕混勻，短暫離心后進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min后，95℃30s、55℃30s、72℃30s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 靈敏度檢測(cè)

將提取的寄生曲霉基因組DNA依次按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5進(jìn)行梯度稀釋后作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。再通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 特異性檢測(cè)

為考察寄生曲霉Omt-1與aflR作為檢測(cè)靶基因的特異性，按照1.2.1的方法提取各對(duì)照菌的基因組DNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組的PCR擴(kuò)增結(jié)果

經(jīng)溶菌酶-CTAB法提取的基因組作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增與1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，如圖1，Omt-1的擴(kuò)增產(chǎn)物(泳道1)和aflR(泳道2)的擴(kuò)增產(chǎn)物均清晰可見(jiàn)，且亮度較高，大小分別位于750bp和500bp附近，與預(yù)期的Omt-1與aflR片段長(zhǎng)度795bp和516bp一致，表明上述基因組提取方法可以有效用于寄生曲霉的檢測(cè)。

圖1 PCR擴(kuò)增目的片段電泳圖M.Marker DL2000bp;1.柄曲霉素轉(zhuǎn)甲氧基酶基因Omt-1；2.aflR基因啟動(dòng)子

2.2 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)檢測(cè)，寄生曲霉DNA模板的核酸濃度為138.71ng·μL-1，分別對(duì)2種引物進(jìn)行PCR靈敏度檢測(cè)，由圖2可得,當(dāng)DNA濃度最低至1ng·μL-1，可見(jiàn)清晰的Omt-1擴(kuò)增基因條帶，由圖3可得,當(dāng)DNA濃度最低至100pg·μL-1，可見(jiàn)清晰的aflR擴(kuò)增基因條帶。寄生曲霉1個(gè)孢子中的DNA質(zhì)量為103pg[11],所以若以O(shè)mt-1作為靶基因，靈敏度下限為10個(gè)孢子；若以aflR作為靶基因，靈敏度下限為1個(gè)孢子，表明aflR的檢測(cè)靈敏度優(yōu)于Omt-1。

圖2 寄生曲霉Omt-1靈敏度電泳結(jié)果M.Marker DL2000bp;1.稀釋10-1倍的基因組DNA；2.稀釋10-2倍的模板基因組DNA；3.稀釋10-3倍的基因組DNA；4.稀釋10-4倍的基因組DNA；5.稀釋10-5倍的基因組DNA

圖3 寄生曲霉aflR靈敏度電泳結(jié)果M.Marker DL2000bp;1.稀釋10-1倍的基因組DNA；2.稀釋10-2倍的基因組DNA；3.稀釋10-3倍的基因組DNA；4.稀釋10-4倍的基因組DNA；5.稀釋10-5倍的基因組DNA

2.3 特異性檢測(cè)結(jié)果

分別使用2對(duì)引物對(duì)米曲霉、寄生曲霉、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉和釀酒酵母進(jìn)行了PCR檢測(cè)，根據(jù)圖4，米曲霉和寄生曲霉均能擴(kuò)增出Omt-1目的產(chǎn)物；而圖5只有寄生曲霉能擴(kuò)增aflR目的產(chǎn)物。上述結(jié)果表明以aflR作為靶基因的特異性更強(qiáng)。

圖4 Omt-1特異性電泳結(jié)果M.Marker DL2000bp;1.米曲霉；2.寄生曲霉；3.黑曲霉；4.產(chǎn)黃青霉；5.釀酒酵母

圖5 aflR特異性電泳結(jié)果M.Marker DL2000bp;1.米曲霉；2.寄生曲霉；3.黑曲霉；4.產(chǎn)黃青霉；5.釀酒酵母

3 討論

目前寄生曲霉污染的檢測(cè)與防控主要集中在對(duì)黃曲霉毒素的檢測(cè)[6]，主要方法包括色譜法和免疫法，其中薄層色譜法(TLC)法靈敏度低，穩(wěn)定性差，現(xiàn)已很少使用；高效液相色譜法(HPLC)法成本較高，操作復(fù)雜，對(duì)操作人員的專業(yè)性要求較高，不適用于普通實(shí)驗(yàn)室，不能用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；酶聯(lián)免疫法(ELISA)由于靈敏度低常導(dǎo)致假陽(yáng)性的出現(xiàn),并且這些方法只能在AFT污染后進(jìn)行檢測(cè)。

利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)產(chǎn)毒真菌具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確、便捷等優(yōu)點(diǎn),可對(duì)真菌污染進(jìn)行提早防控。李慧[8]等以黃曲霉基因組DNA為模板構(gòu)建的多重PCR檢測(cè)方法中，其aflR靶基因的靈敏度下限為100pg。晏麗等[11]通過(guò)熒光定量PCR特異性針黃曲霉的nor-1基因進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度最低至10個(gè)孢子，從提取菌株DNA到熒光定量PCR全過(guò)程在6h內(nèi)。蔣丹[12]等建立了液氮研磨-CTAB法制備產(chǎn)毒曲霉菌DNA及其aflR基因PCR檢測(cè)的方法。本研究中靈敏度指標(biāo)與李慧等的研究結(jié)果一致，aflR基因的檢測(cè)靈敏度最低可1個(gè)孢子，優(yōu)于晏麗等研究結(jié)果。與蔣丹等研究相比，本研究中的溶菌酶-CTAB基因組提取方法更加簡(jiǎn)單、便捷，但由于真菌DNA的提取時(shí)間較長(zhǎng)，今后可以針對(duì)該方法進(jìn)行優(yōu)化，以期進(jìn)一步縮短檢測(cè)時(shí)間。

4 結(jié)論

本文采用溶菌酶-CTAB法制備寄生曲霉基因組DNA，針對(duì)寄生曲霉的黃曲霉毒素合成關(guān)鍵基因aflR與Omt-1進(jìn)行PCR檢測(cè)，該方法對(duì)aflR具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的特異性、簡(jiǎn)單快捷并且成本較低，能夠在早期對(duì)寄生曲霉的污染進(jìn)行有效防控。