潘昌濱 劉青鋒 安登龍 郭敏杰

(茅臺(tái)學(xué)院，貴州 仁懷 564500)

我國(guó)是煙草第1大種植國(guó)和消費(fèi)國(guó)，近5a煙草的年產(chǎn)量達(dá)230萬(wàn)t[1]，煙草種植及其產(chǎn)品加工在國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[2]。據(jù)欒倩倩[3]研究，煙草加工產(chǎn)生的廢棄物約占煙草產(chǎn)量18%～25%，每年產(chǎn)生的煙草廢棄物在41.4萬(wàn)t以上，并且大部分廢棄物未得到有效利用[4]。

煙草(Nicotiana tabacum L.)是茄科煙草屬植物[5]，一年生或有限多年生草本，全體被腺毛，根粗壯，莖稈高0.7～2m且直立，基部稍木質(zhì)化，煙草制品除了吸食外，還有很多潛在價(jià)值。目前煙草已經(jīng)鑒定出的化合物高達(dá)3000多種，其中葉綠素、蛋白質(zhì)、淀粉、煙堿、茄尼醇及香料等成分含量較高，具有很高的應(yīng)用價(jià)值[6]。

煙稈及其廢棄物中含有煙堿、茄尼醇、果膠、蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸和糖類(lèi)等重要化合物，其中煙堿、茄尼醇等物質(zhì)是其所特有的組分并且含量很高[7]，一定劑量的煙堿可預(yù)防老年癡呆癥、帕金森氏綜合癥和藥物性胃潰瘍的生成[8]，茄尼醇是合成治療心血管疾病、抗癌、抗?jié)兊刃滦退幬锏闹虚g體，如輔酶Q10和維生素K2等[9]藥物合成的中間體，本身具有抗菌、消炎、止血的作用[10]。目前煙草種植管理技術(shù)以及生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)方式較為粗放，在采摘煙葉后，大部分的煙稈被丟棄或焚燒，不僅造成煙草秸稈資源浪費(fèi)[11]，而且會(huì)影響生態(tài)環(huán)境[12]。因此，探究煙草廢棄物制作生物農(nóng)藥，為煙草廢棄物資源化利用做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

煙草春季種植，秋天采摘，煙草廢棄物產(chǎn)生于采摘過(guò)程中的殘次煙葉、采摘結(jié)束后的廢棄秸稈以及烘烤產(chǎn)生的煙葉邊角料，試驗(yàn)用的煙草廢棄物是烘烤殘次煙葉和煙草秸稈,2021年9月取于貴州省貞豐縣。利用EM菌種、紅糖、水和煙草廢棄物(煙稈、煙葉)混勻厭氧發(fā)酵3個(gè)月制成生物農(nóng)藥[13]，其中水、紅糖與煙稈、煙葉(干重計(jì))的比例為5∶1.2∶1。

紅薯葉于7月初采集于貴州省仁懷市某紅薯地，剪碎的紅薯葉經(jīng)揉搓后按重量1∶1與水混勻，用兩層紗布過(guò)濾的濾液放在燒杯中備用。生物碳粉是醬香型酒糟經(jīng)過(guò)高溫?zé)峤庵瞥珊?，利用固體粉碎機(jī)(常州億通分析儀器制造有限公司，型號(hào)XA-1)粉碎并經(jīng)過(guò)100目篩制成。農(nóng)藥指的是高效氯氟氰菊酯類(lèi)，其有效成分及含量是高效氯氟氰菊酯類(lèi)5%、水乳劑、中等毒。

紅糖購(gòu)買(mǎi)于廣西馬山南華糖業(yè)有限公司，EM菌種購(gòu)買(mǎi)于河南南華千牧生物科技有限公司，黏蟲(chóng)(Mythimna separata Walker)、豌豆蚜蟲(chóng)(Acyrthosiphon pisum)均采集于貴州省仁懷市高粱地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙堿含量檢測(cè)方法

在《煙草及煙草制品總植物堿的測(cè)定 光度法》(GB/T 23225-2008)標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，參考錢(qián)建瑞等[14]、儲(chǔ)志兵等[15]研究，利用標(biāo)準(zhǔn)品(煙堿濃度1.08mg·mL-1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，煙葉經(jīng)前處理得到待測(cè)樣品，利用安捷倫1260高效液相色譜儀檢測(cè)煙堿含量。

1.2.2 黏蟲(chóng)試驗(yàn)(時(shí)間2h)

第1階段分為6個(gè)組(煙葉液、煙稈液、紅薯葉、農(nóng)藥、碳粉、空白組)，每組選用45只相近的黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)，每隔15min左右噴灑1次藥劑，觀察并記錄黏蟲(chóng)的行為及死亡情況；第2節(jié)階段分為5個(gè)組(100%煙葉液、50%煙葉液、25%煙葉液、10%煙葉液、農(nóng)藥)，每組投放30只相近的黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)，每隔約15min噴灑1次藥劑，觀察并記錄黏蟲(chóng)的行為及死亡情況。

1.2.3 蚜蟲(chóng)試驗(yàn)(時(shí)間4h)

數(shù)30只大小相近的豌豆蚜蟲(chóng)分別放在4個(gè)培養(yǎng)皿(1個(gè)對(duì)照組、3個(gè)煙葉組)中，用100mL的0%、25%、50%和100%發(fā)酵液比例倒入噴壺中，向培養(yǎng)皿的蚜蟲(chóng)噴灑2次后蓋上蓋子觀察半數(shù)死亡時(shí)間和全部死亡時(shí)間，試驗(yàn)時(shí)間是4h。

1.3 數(shù)據(jù)分析

參考絕對(duì)致死劑量(Absolute lethal dose，LD100)、半數(shù)致死劑量(Median lethal dose，LD50)的定義[16]，試蟲(chóng)致死數(shù)指在一定時(shí)間內(nèi)使用某藥劑使試蟲(chóng)死亡的數(shù)量，當(dāng)試蟲(chóng)致死數(shù)量占到總數(shù)1/2的時(shí)間稱(chēng)為半數(shù)死亡時(shí)間，全部試蟲(chóng)死亡的時(shí)間稱(chēng)為全數(shù)死亡時(shí)間。該試驗(yàn)的農(nóng)藥(高效氯氟氰菊酯類(lèi))和煙堿[17]是神經(jīng)性毒物，有試蟲(chóng)暈死一段時(shí)間后再恢復(fù)爬行的現(xiàn)象，這里把暈死定義為試蟲(chóng)出現(xiàn)不動(dòng)且會(huì)恢復(fù)爬動(dòng)或死亡的現(xiàn)象，死亡指試蟲(chóng)超過(guò)15min不動(dòng)即認(rèn)為死亡。

煙草廢棄物生物農(nóng)藥試驗(yàn)的指標(biāo)有煙堿濃度、致死數(shù)、有半數(shù)死亡時(shí)間和全數(shù)死亡時(shí)間，試驗(yàn)數(shù)據(jù)的記錄和分析采用Excel 2013，結(jié)果以“平均值(M)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 廢棄煙葉的煙堿含量

煙草廢棄物的煙稈干燥物的硬度太大，無(wú)法使用固體粉碎機(jī)(型號(hào)XA-1)粉碎，在本研究中沒(méi)有檢測(cè)其煙堿含量。煙草烘烤后的廢棄煙葉煙堿含量在1.98%～2.06%，結(jié)果是(2.01±0.03)%，與劉項(xiàng)[18]的研究成果相近。假設(shè)廢葉的煙堿全部溶解在液體中，則100%、50%、25%和10%試驗(yàn)組的煙堿濃度是2.79mg·mL-1、1.39mg·mL-1、0.70mg·mL-1、0.28mg·mL-1。

表1 廢棄煙葉樣品中煙堿的含量

表2 不同煙葉液濃度對(duì)蚜蟲(chóng)的毒性試驗(yàn)

2.2 不同藥劑對(duì)黏蟲(chóng)毒性作用

在煙葉液、煙稈液、紅薯葉液、農(nóng)藥和碳粉液等不同藥劑試驗(yàn)中，對(duì)照組不噴灑任何液劑，見(jiàn)表3。第1次噴灑后，噴煙葉液和碳粉液的黏蟲(chóng)立即出現(xiàn)逃避現(xiàn)象，煙稈液和紅薯葉液的黏蟲(chóng)在噴灑2min后開(kāi)始逃避，農(nóng)藥組的逃避現(xiàn)象不明顯。最早出現(xiàn)死亡的是煙葉組(14∶32，10只)，其次農(nóng)藥組在14∶37死亡1只、14∶40死亡2只，煙稈液組在15∶10死亡2只，其他組無(wú)死亡現(xiàn)象。煙葉液組的半數(shù)死亡時(shí)間出現(xiàn)在15∶36—15∶50、全數(shù)死亡時(shí)間是16∶22，其次是農(nóng)藥組死亡6只、煙稈組死亡2只，其他組無(wú)死亡現(xiàn)象。試驗(yàn)期間，對(duì)照組黏蟲(chóng)始終正常如初，碳粉液組始終逃避，紅薯葉液組后期少數(shù)不動(dòng)外其他一直逃避，煙稈液組后期有部分黏蟲(chóng)與農(nóng)藥組相似。此外，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有的黏蟲(chóng)在死亡后一段時(shí)間出現(xiàn)恢復(fù)爬動(dòng)的現(xiàn)象，主要與煙草廢棄物的煙堿及農(nóng)藥的氯氟氰菊酯類(lèi)都是神經(jīng)性毒素有關(guān)。因此，不同藥劑對(duì)黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒性作用效果從強(qiáng)到弱為煙葉液﹥農(nóng)藥﹥煙稈液﹥碳粉液﹥紅薯葉液。

2.3 不同濃度煙葉液對(duì)黏蟲(chóng)的毒性作用

前面研究發(fā)現(xiàn)煙葉液對(duì)黏蟲(chóng)的毒性作用效果最好，為了進(jìn)一步探究不同濃度煙葉液的殺蟲(chóng)效果，設(shè)計(jì)100%煙葉液(原液)、50%煙葉液、25%煙葉液、10%煙葉和對(duì)照組(農(nóng)藥)對(duì)黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的作用效果，見(jiàn)表4。第1次噴藥劑后，100%煙葉液組逃避最強(qiáng)烈、50%組和對(duì)照組相近、25%組較強(qiáng)烈、10%組不明顯。100%煙葉組在14∶19死亡1只，對(duì)照組在14∶21暈死1只但在4min后恢復(fù)爬動(dòng)，25%組在15∶04死亡2只，其他組無(wú)死亡。同濃度煙葉液組隨給藥次數(shù)增加，黏蟲(chóng)的逃避行為先增強(qiáng)后減弱；黏蟲(chóng)的逃避行為強(qiáng)度隨著煙葉液濃度降低而下降，并且濃度越低與農(nóng)藥組的暈死態(tài)越相似。煙葉液在15∶45時(shí)添加碳粉，但對(duì)黏蟲(chóng)幾乎無(wú)影響?？傊?，不同濃度藥劑的毒性試驗(yàn)從強(qiáng)到弱為100%煙葉液﹥25%煙葉液﹥農(nóng)藥﹥50%煙葉液﹥10%煙葉液。

表4 不同濃度煙葉液對(duì)黏蟲(chóng)的毒性作用

2.4 不同濃度煙葉液對(duì)蚜蟲(chóng)的毒性作用

不同煙葉液濃度對(duì)蚜蟲(chóng)的半數(shù)死亡時(shí)間、全數(shù)死亡時(shí)間不同，見(jiàn)表2。其中,25%的半數(shù)死亡率時(shí)間是60min，50%和100%的半數(shù)死亡率時(shí)間都是50min。在240min內(nèi)只有100%組全部死亡，50%組死亡率是96.67%、25%組死亡率是93.33%、對(duì)照組死亡率是3.33%，說(shuō)明煙葉液濃度越高對(duì)蚜蟲(chóng)的毒害作用越強(qiáng)。

3 討論與結(jié)論

本研究參考了LD50、LD100[16]和KT50[19]，定義半數(shù)死亡時(shí)間和全數(shù)死亡時(shí)間。盡管試驗(yàn)內(nèi)容有不同藥劑濃度，但試驗(yàn)時(shí)間只有2h或4h，因此有異于LD50、LD100的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將來(lái)可進(jìn)一步進(jìn)行煙草廢棄物的LD50、LD100和KT50研究。

試驗(yàn)觀察用到死亡、恢復(fù)和暈死的狀態(tài)記錄，是由于農(nóng)藥(高效氯氟氰菊酯類(lèi))及煙堿[17]都是神經(jīng)類(lèi)毒物，使試蟲(chóng)的暈死和死亡狀態(tài)難以真實(shí)區(qū)分，因此在記錄過(guò)程中常有暈死和死亡交叉記錄的情況。

煙草廢棄物的煙堿含量只檢測(cè)了煙葉中煙堿含量是由于煙稈在干燥后硬度極高，實(shí)驗(yàn)室的破碎設(shè)備無(wú)法破碎，所以在本試驗(yàn)中沒(méi)有檢測(cè)，建議將來(lái)補(bǔ)充煙葉、煙稈中煙堿含量的檢測(cè)。表3中煙稈液的殺蟲(chóng)效果比煙葉液差，可能與煙稈的煙堿含量[20]低于煙葉煙堿含量有關(guān)。

表4中100%煙葉液組比表3的煙葉液的毒殺效果差，可能與表4的試蟲(chóng)日齡大于表3的蟲(chóng)齡，導(dǎo)致試蟲(chóng)抗藥性增加有關(guān)。此外，表3給藥方式是噴灑，而表4是蘸刷，表4給藥效果比表3的差，因此給藥對(duì)試藥效果也有影響。在表4中，25%煙葉濃度對(duì)黏蟲(chóng)的毒性作用強(qiáng)于50%可能與毛筆蘸刷不均勻有關(guān)。

紅薯葉液組后期有少數(shù)黏蟲(chóng)不爬動(dòng)，可能與前期一直逃避過(guò)度消耗能量有關(guān)，也可能是紅薯葉里某些成分開(kāi)始起作用。黏蟲(chóng)遇到紅薯葉會(huì)逃避的真實(shí)原因尚需進(jìn)一步研究，將來(lái)可嘗試高粱與紅薯套種防治黏蟲(chóng)的效果以推進(jìn)酒用高粱的生物防治。

試驗(yàn)中蚜蟲(chóng)全數(shù)死亡時(shí)間是黏蟲(chóng)的2倍，可能與給藥形式不同有關(guān)，蚜蟲(chóng)只給藥1次(噴2下)而黏蟲(chóng)給藥7次(噴2下/次)，黏蟲(chóng)的給藥劑量遠(yuǎn)大于蚜蟲(chóng)；此外可能與試驗(yàn)氣候有關(guān)，蚜蟲(chóng)試驗(yàn)在陰冷潮濕的3月，黏蟲(chóng)試驗(yàn)在炎熱干燥的7月。

農(nóng)藥(氯氟氰菊酯類(lèi))是常用的廣譜性高效殺蟲(chóng)劑，由于對(duì)蚜蟲(chóng)和黏蟲(chóng)等效果較好，近年來(lái)得到廣泛應(yīng)用[21]，但是其在植物[22]、動(dòng)物[23]有殘留，影響人類(lèi)健康安全和生態(tài)環(huán)境安全。本研究初步證明,利用煙草廢棄物(煙葉液、煙稈液)防治豌豆蚜蟲(chóng)、黏蟲(chóng)有效果，將進(jìn)一步研究煙草廢棄物防治酒用高粱等作物害蟲(chóng)的半數(shù)擊倒時(shí)間(KT50)、致死濃度和給藥方式等，以早日實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)應(yīng)用。

試驗(yàn)結(jié)果表明，煙草廢棄物中煙葉的煙堿含量是(2.01±0.03)%；不同藥劑對(duì)黏蟲(chóng)幼蟲(chóng)的毒性作用效果從強(qiáng)到弱為煙葉液﹥農(nóng)藥﹥煙稈液﹥碳粉液﹥紅薯葉液，其中煙葉液的全數(shù)死亡時(shí)間是112min；不同濃度藥劑的毒性試驗(yàn)從強(qiáng)到弱為100%煙葉液﹥25%煙葉液﹥農(nóng)藥﹥50%煙葉液﹥10%煙葉液；煙葉液對(duì)豌豆蚜蟲(chóng)的防治效果與其濃度呈正比，其100%組的全數(shù)死亡時(shí)間是240min、半數(shù)死亡時(shí)間是50min。因此，初步證明利用煙草廢棄物(煙葉、煙桿)制作生物農(nóng)藥是可行的。