趙琦琦郭玉靜于夢(mèng)斐王穎高文偉張斌

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所，山東 濟(jì)南 250100；3.湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；4.曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165)

油莎豆(Cyperus esculentus)是莎草科莎草屬的禾本科作物，原產(chǎn)于非洲及地中海沿岸的干旱和半干旱地區(qū)[1，2]，現(xiàn)廣泛分布于我國(guó)的東北、華北及長(zhǎng)江流域等中、低緯度地區(qū)，性喜溫暖濕潤(rùn)氣候，具有生長(zhǎng)速度快、生物量大、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[3]，耐旱、耐澇、耐貧瘠、耐鹽堿[4]。油莎豆塊莖含油量達(dá)27%左右[5]，且含有相當(dāng)豐富的膳食纖維、礦物質(zhì)(如鉀、磷、鈣、鎂、鋅、銅)、維生素C和E以及人體必需脂肪酸(如肉豆蔻酸、油酸和亞油酸)等[6]。目前，大多數(shù)油莎豆研究主要集中在種植技術(shù)[7]、油脂提取工藝[8，9]、營(yíng)養(yǎng)成分[10]及藥用價(jià)值分析[11]等方面，對(duì)于其種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究相對(duì)較少。

SRAP又稱相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequencerelated amplified polymorphism，SRAP)，由美國(guó)加州大學(xué)作物系Li和Quiros于2001年提出[12]，是一種無(wú)需任何序列信息即可直接PCR擴(kuò)增的新型分子標(biāo)記技術(shù)，具有簡(jiǎn)便、高共顯性、易分離條帶及測(cè)序等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、比較基因組及品種鑒定等研究[13，14]。目前，SRAP分子標(biāo)記技術(shù)在紫花苜蓿[15]、馬鈴薯[16]、紫錐菊[17]、草果菊[18]、石榴[19]等多種生物的遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析中取得重大進(jìn)展，但在探究油莎豆種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系上的應(yīng)用卻很少。

本研究利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，基于引物濃度、混合酶體積、模板DNA濃度三因素，探究了SRAPPCR的最佳擴(kuò)增體系，并對(duì)收集到的16份油莎豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，以探明不同地區(qū)油莎豆種質(zhì)資源的遺傳距離和親緣關(guān)系，以期為油莎豆的種質(zhì)資源鑒定和遺傳育種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試16份油莎豆種質(zhì)資源材料的來源及特性見表1。于2021年4月收集種子，5月底浸種3~5 d，6月初種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院核心區(qū)溫室大棚內(nèi)底徑26 cm、高23 cm、口徑34 cm的花盆中，盆土為沙質(zhì)土。每盆播種3穴，每穴1粒種子，穴深4~5 cm。播種后及時(shí)澆水，保持土壤濕潤(rùn)，便于種子萌發(fā)。播種后10 d左右出芽，20 d左右采集油莎豆幼嫩葉片，保存于－80℃超低溫冰箱，用于提取DNA。7~12月進(jìn)行油莎豆SRAPPCR體系優(yōu)化試驗(yàn)及相關(guān)遺傳多樣性分析。所用引物見表2。

表1 供試16份油莎豆材料的特性及來源

1.2 油莎豆基因組DNA提取與檢測(cè)

采用改良的CTAB法提取油莎豆幼嫩葉片基因組DNA，通過微量核酸蛋白濃度測(cè)定儀測(cè)定DNA濃度。將5μL DNA樣品與1μL 6×Loading buffer混合均勻后點(diǎn)入1%瓊脂糖凝膠，置于100 V電壓下電泳20 min，檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.3 SRAP－PCR擴(kuò)增體系建立與優(yōu)化

選用條帶清晰且多態(tài)性高的Me2＋Em2引物對(duì)，以2號(hào)油莎豆種質(zhì)材料DNA為模板，采用單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法確定SRAPPCR最佳擴(kuò)增體系。

SRAP－PCR擴(kuò)增初始體系(15μL):模板DNA 60 ng，2×PCR Master Mix 7.5μL，正反向引物各0.3μL，ddH2O補(bǔ)足至15μL。SRAP－PCR程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃1 min，35℃1 min，72℃1.5 min，10個(gè)循環(huán)；94℃1 min，50℃1 min，72℃1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。用2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.3.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 影響SRAP－PCR擴(kuò)增體系的主要因素有引物濃度、混合酶體積、模板DNA含量，所以，基于初始擴(kuò)增體系，對(duì)這3個(gè)因素分別設(shè)計(jì)6個(gè)濃度梯度(表2)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以確定各因素的基礎(chǔ)濃度范圍。

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素所選濃度范圍基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，共9個(gè)處理組合，如表3所示。利用陳璨等[20]的方法，對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，即:依據(jù)擴(kuò)增條帶的清晰度和穩(wěn)定性對(duì)9個(gè)組合的PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行評(píng)分，條帶數(shù)量最多、清晰度最高的產(chǎn)物記16分，最差的產(chǎn)物記1分；根據(jù)各處理組合評(píng)分結(jié)果，計(jì)算各因素各水平的得分均值ki，進(jìn)而計(jì)算該因素的極差R＝kimax－kimin。

表3 油莎豆SRAP－PCR擴(kuò)增體系的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表4 油莎豆SRAP－PCR擴(kuò)增體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 供試16個(gè)油莎豆種質(zhì)材料的SRAP－PCR遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析所用SRAP引物由上海生工生物工程有限公司合成，設(shè)計(jì)正向引物6條、反向引物17條(表2)，組合成102對(duì)引物。利用上述試驗(yàn)確定的最佳擴(kuò)增體系對(duì)16份油莎豆材料進(jìn)行擴(kuò)增，采用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，恒壓200 V，電泳1.0~1.5 h，用銀染法顯影，拍照記錄。

利用人工讀帶的方法統(tǒng)計(jì)PCR產(chǎn)物中相同位置清晰的條帶數(shù)，有條帶的記為“1”，無(wú)條帶的記為“0”，轉(zhuǎn)換為“0/1”數(shù)字矩陣。利用NTSYS 2.1計(jì)算遺傳一致度和遺傳距離，采用UPGMA法繪制聚類圖，進(jìn)而分析16份油莎豆材料的親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)過檢測(cè)，提取的DNA濃度范圍在141.5~269.7 ng/μL，OD260/OD280值 在1.8以 上，OD260/OD230值在1.96~2.18之間；DNA條帶清晰完整，無(wú)降解和拖尾現(xiàn)象(圖1)。綜上，利用改良CTAB法提取的油莎豆DNA質(zhì)量較好，濃度較高，可用于SRAP－PCR反應(yīng)。

圖1 16份油莎豆材料的DNA電泳檢測(cè)圖譜

2.2 SRAP－PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析 由圖2可知，隨著引物濃度提升，條帶逐漸清晰且多態(tài)性增加，最終根據(jù)條帶的擴(kuò)增情況選擇0.4、0.5、0.6μmol/L三個(gè)引物濃度用于正交試驗(yàn)?；旌厦阁w積在3.0μL時(shí)無(wú)擴(kuò)增條帶，在4.5、6.0μL時(shí)擴(kuò)增條帶較模糊，在7.5、9.0、10.5μL時(shí)條帶擴(kuò)增情況最好，所以選擇7.5、9.0、10.5μL用于正交試驗(yàn)。DNA模板用量為20 ng時(shí)擴(kuò)增條帶較模糊，其他濃度時(shí)擴(kuò)增情況均較好，選擇60、80、100 ng用于正交試驗(yàn)。

圖2 SRAP－PCR擴(kuò)增體系單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 油莎豆SRAP－PCR最佳擴(kuò)增體系的確立

從圖3可看出，處理組合1、7沒有擴(kuò)增出條帶，處理組合4、8擴(kuò)增條帶多態(tài)性較少，其余組合擴(kuò)增條帶較好但清晰度存在差異。正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果(表5)顯示，3個(gè)因素對(duì)SRAP－PCR反應(yīng)體系的影響為混合酶體積>模板DNA含量>引物濃度，引物濃度為0.5μmol/L、混合酶體積為10.5 μmol/L、模板DNA含量為80 ng時(shí)擴(kuò)增效果最佳。以此組合作為最佳反應(yīng)體系，選用不同引物組合，用4號(hào)、5號(hào)油莎豆材料進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果(圖4)表明，不同引物組合在兩種質(zhì)中均能穩(wěn)定擴(kuò)增，說明所選體系穩(wěn)定可靠，適用于油莎豆SRAP分子標(biāo)記研究。

表5 正交試驗(yàn)直觀分析結(jié)果

圖3 SRAP－PCR擴(kuò)增體系的正交試驗(yàn)結(jié)果

圖4 SRAP－PCR最佳擴(kuò)增體系在不同品種不同引物穩(wěn)定擴(kuò)增結(jié)果

2.3 16份油莎豆種質(zhì)材料的遺傳多樣性分析

2.3.1 SRAP－PCR多態(tài)性分析 利用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳從102對(duì)引物組合中篩選出30對(duì)條帶清晰且多態(tài)性較好的引物組合(表6)，用這30對(duì)引物組合共擴(kuò)增出312個(gè)位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)289個(gè)，平均多態(tài)性比率達(dá)92.82%；每對(duì)引物擴(kuò)增出的總位點(diǎn)數(shù)在6~17個(gè)之間，平均10.40個(gè)位點(diǎn)；多態(tài)性位點(diǎn)有5~16個(gè)，平均9.63個(gè)位點(diǎn)。表明篩選出的30對(duì)SRAP分子標(biāo)記在16份油莎豆材料中所擴(kuò)增出的條帶都具有較好的多態(tài)性，可用于遺傳多樣性分析。圖5是引物Me1＋Em7和Me2＋Em1對(duì)16份油莎豆材料的SRAP擴(kuò)增結(jié)果。

表6 多態(tài)性引物組合擴(kuò)增結(jié)果

圖5 Mel＋Em7和Me2＋Eml對(duì)16份油莎豆種質(zhì)材料的擴(kuò)增結(jié)果

2.3.2 16份油莎豆種質(zhì)材料的SRAP－PCR遺傳距離與遺傳一致度分析 由表7可知，遺傳一致度范圍為0.60~0.93，遺傳距離范圍為0.07~0.40。8號(hào)與11號(hào)種質(zhì)的遺傳一致度最低，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳距離最大；來自新疆維吾爾自治區(qū)的14號(hào)與來自河北省的15號(hào)材料遺傳一致度最高，親緣關(guān)系最近，遺傳距離最小。由于14、15號(hào)材料的品種特性都為黃色圓粒，結(jié)合遺傳一致度結(jié)果，推測(cè)它們可能為同一品種。綜合分析油莎豆材料的遺傳距離和遺傳一致度，16份油莎豆種質(zhì)材料間遺傳一致度較高，遺傳背景較狹窄，遺傳差異較小，這可能是因?yàn)槲覈?guó)的油莎豆種質(zhì)是由國(guó)外引種而來，引種后地域間種質(zhì)交流較頻繁，從而造成了油莎豆種質(zhì)資源具有較高的遺傳一致度。

表7 16份油莎豆材料遺傳距離與遺傳一致度

2.3.3 16份油莎豆種質(zhì)材料的SRAP－PCR聚類分析 利用UPGMA法對(duì)16份油莎豆種質(zhì)材料進(jìn)行聚類分析，得到樹狀聚類圖見圖6，可見聚類結(jié)果與遺傳一致度和遺傳距離的結(jié)果一致。在遺傳相似系數(shù)0.824處，可將16份油莎豆種質(zhì)材料劃分為4個(gè)類群，第一、第二、第四類群均包含1份油莎豆種質(zhì)材料，第三類群包含13份種質(zhì)材料。在遺傳相似系數(shù)0.872處，可進(jìn)一步將第三類群劃分為5個(gè)亞類，其中第1亞類包含河南省的3份油莎豆材料，大部分為圓粒；第2亞類包含吉林省的3份油莎豆材料，均為長(zhǎng)粒；第5亞類包含其他4個(gè)地區(qū)的5份油莎豆材料，絕大部分為圓粒；來自吉林省的長(zhǎng)粒油莎豆7號(hào)和來自云南省的長(zhǎng)粒油莎豆11號(hào)材料單獨(dú)歸于一個(gè)亞類。表明，油莎豆種質(zhì)資源的地域來源和品種特性均對(duì)聚類結(jié)果產(chǎn)生影響。

圖6 16份油莎豆種質(zhì)材料的UPGMA聚類結(jié)果

3 討論

3.1 油莎豆SRAP－PCR體系的優(yōu)化

利用PCR擴(kuò)增體系獲得條帶清晰、多態(tài)性高的引物組合是研究SRAP分子標(biāo)記的基礎(chǔ)。本研究利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了適合油莎豆的SRAP－PCR最佳擴(kuò)增體系，即引物為0.5μmol/L，混合酶體積為10.5μL，模板DNA含量為80ng，用ddH2O補(bǔ)足15μL。這與趙永國(guó)等[21]確定的油莎豆SRAP優(yōu)化體系(15μL擴(kuò)增體系包括DNA模板25 ng、Mg2＋1.5 mmol/L、引物濃度1 μmol/L、dNTPs 0.3 mmol/L和Taq酶1 U)不一致，可能與DNA提取方法不同有關(guān)，另外，不同廠家的試劑、不同的實(shí)驗(yàn)操作方法也會(huì)對(duì)SRAPPCR的擴(kuò)增結(jié)果產(chǎn)生不同的影響。

本研究確定了3個(gè)因素對(duì)油莎豆SRAP－PCR擴(kuò)增體系的影響大小為混合酶體積>模板DNA含量>引物濃度。但不同植物中SRAP－PCR擴(kuò)增體系各因素產(chǎn)生的影響不同:戚華沙等[22]在海南油茶SRAP－PCR擴(kuò)增體系優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，各因素影響大小為引物濃度>dNTPs濃度>TaqDNA聚合酶用量>模板DNA含量；嚴(yán)莉等[23]對(duì)山桐子SRAP－PCR擴(kuò)增體系的優(yōu)化結(jié)果表明各因素的影響大小為TaqDNA聚合酶用量>Mg2＋濃度>引物濃度>模板DNA濃度>dNTPs濃度。

3.2 SRAP分子標(biāo)記探究油莎豆遺傳多樣性

SRAP分子標(biāo)記使用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，常被用于分析遺傳多樣性和親緣關(guān)系，如沈秀芬等[24]利用SRAP標(biāo)記分析草菇遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)草菇種質(zhì)資源在一定程度上出現(xiàn)了地域基因分化；Deng等[25]利用SRAP標(biāo)記首次對(duì)中國(guó)特有的10種莪術(shù)藥材進(jìn)行了親緣關(guān)系分析。這些研究表明，SRAP分子標(biāo)記技術(shù)可有效區(qū)分種質(zhì)資源間的遺傳差異，明確其親緣關(guān)系。本研究對(duì)收集到的16份種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選到30對(duì)多態(tài)性較好的引物組合，并用其擴(kuò)增出312個(gè)位點(diǎn)，平均多態(tài)性比率為92.82%，說明16份油莎豆種質(zhì)材料具有豐富的多態(tài)性。聚類分析結(jié)果表明，16份油莎豆種質(zhì)材料的遺傳差異與品種特性及來源均有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究基于引物濃度、混合酶體積和DNA模板含量3個(gè)因素，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確立了油莎豆SRAP－PCR的最佳擴(kuò)增體系為:引物0.5μmol/L，混合酶體積10.5μL，模板DNA含量80 ng，用ddH2O補(bǔ)足15μL。利用該體系從102對(duì)引物組合中篩選出30對(duì)多態(tài)性引物，并用于對(duì)16份油莎豆種質(zhì)材料的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)油莎豆種質(zhì)材料間的遺傳多樣性受品種特性和地域來源的雙重影響。本研究結(jié)果可為油莎豆種質(zhì)資源的品種鑒定和選育等提供一定的參考依據(jù)。