肖 雪 言柯柯 李麗媚 趙 軍 張 哲 周曉瑩

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1 耳鼻咽喉頭頸外科，2 放療科，廣西南寧市 530021； 3 廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院-附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科，廣西南寧市 530021； 4 廣西醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，廣西南寧市 530021)

GLOBOCAN2020數(shù)據(jù)顯示，頭頸部腫瘤是世界上第七高發(fā)的惡性腫瘤，2020年全球新發(fā)病例超過90萬[1]。頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(簡稱為頭頸鱗癌)是發(fā)生于口腔、口咽、下咽、喉、鼻竇、唾液腺等解剖位置的惡性腫瘤，約占頭頸部腫瘤的90%。由于頭頸鱗癌的臨床癥狀不典型，許多病例初診時就已經(jīng)處于晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)。盡管在過去的二三十年間腫瘤治療手段飛速發(fā)展，但是頭頸鱗癌患者的治療效果仍不佳。如何尋找有效的診斷及預(yù)后評估的標(biāo)記物，是當(dāng)今頭頸鱗癌研究的熱點。

頭頸鱗癌的發(fā)病危險因素有很多，包括經(jīng)典的危險因素如吸煙、飲酒，以及近年來備受關(guān)注的人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)[2]。HPV相關(guān)性頭頸鱗癌約占所有頭頸鱗癌的25%，這類患者以青壯年人群為主，治療效果通常較好，預(yù)后也好于HPV陰性患者[3]，但具體的原因和機(jī)制尚未完全闡明。

脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)，又稱含Patatin樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域蛋白3，是脂肪分解過程中的限速酶[4]。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細(xì)胞通過表觀遺傳沉默UbcH8后下調(diào)ATGL的表達(dá)，導(dǎo)致脂滴堆積從而維持其惡性表型[5]。我們還報告了EB病毒編碼的潛伏膜蛋白2A通過影響ATGL的表達(dá)從而抑制鼻咽癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[6]。但是ATGL在頭頸鱗癌中的表達(dá)及作用尚未見研究報告。因此，本研究分析ATGL在頭頸鱗癌中的表達(dá)及與腫瘤預(yù)后的關(guān)系，并基于腫瘤免疫和表觀遺傳探討相關(guān)分子機(jī)制，以及HPV感染通過調(diào)控ATGL表達(dá)對頭頸鱗癌免疫微環(huán)境的影響。

1 資料與方法

1.1 ATGL在頭頸鱗癌中轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平的分析 首先，通過UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)對ATGL在頭頸鱗癌中的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析[7]，其中轉(zhuǎn)錄水平分析納入520例頭頸鱗癌組織和44例頭頸部非癌組織，蛋白表達(dá)水平分析納入108例頭頸鱗癌組織和71例頭頸部非癌組織。另外，UALCAN數(shù)據(jù)庫提供以“HPV感染狀態(tài)”為分層因素的分析，因此本研究納入80例HPV陽性和434例HPV陰性的頭頸鱗癌組織，聯(lián)合44例非癌組織，進(jìn)行ATGL的轉(zhuǎn)錄水平分析。

隨后，通過GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索ATGL微陣列數(shù)據(jù)集，納入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)包含腫瘤和非腫瘤分組；(2)腫瘤組為根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)[8]確診為頭頸鱗癌的患者；(3)每組病例數(shù)>3例；(4)可獲得ATGL的數(shù)據(jù)。對入選的微陣列進(jìn)行Meta分析以驗證ATGL在頭頸鱗癌中的轉(zhuǎn)錄水平。使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計學(xué)分析，使用漏斗圖和Begg′s檢驗進(jìn)行發(fā)表偏倚評價，使用Cochran′sQ檢驗進(jìn)行異質(zhì)性分析，當(dāng)P<0.05、I2>50%時被認(rèn)為有異質(zhì)性，此時使用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析。通過繪制森林圖分析ATGL在頭頸鱗癌中的表達(dá)情況，通過繪制漏斗圖并進(jìn)行Begg′s檢驗以評價和檢驗發(fā)表偏倚。以P<0.05視為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 ATGL表達(dá)與頭頸鱗癌分級和預(yù)后的關(guān)系 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析ATGL蛋白表達(dá)與頭頸鱗癌腫瘤分級的關(guān)系。根據(jù)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)繪制不同腫瘤分期(Ⅲ、Ⅵ期)頭頸鱗癌患者和整體頭頸鱗癌患者的生存曲線[9]，分析ATGL基因表達(dá)與生存情況的關(guān)系。

1.3 ATGL在頭頸鱗癌中的DNA甲基化水平分析 通過MethSurv(https://biit.cs.ut.ee/methsurv/)分析ATGL CpG島在頭頸鱗癌中的甲基化狀態(tài)，并評估ATGL CpG島甲基化與頭頸鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性[10]，預(yù)后評價指標(biāo)為總體生存率。

1.4 ATGL相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的基因富集分析 通過基因富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)軟件[11]，解析ATGL參與調(diào)控的信號通路。將基因集設(shè)置為“h.all.v7.5.1.symbols.gmt”，對TCGA數(shù)據(jù)庫的頭頸鱗癌基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行富集分析，F(xiàn)DR<0.25，基因數(shù)量設(shè)置為≥35。

1.5 ATGL與頭頸鱗癌中免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性分析 使用TIMER數(shù)據(jù)庫(http://timer.cistrome.org/)分析ATGL基因表達(dá)與頭頸鱗癌中免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性，分析在不同HPV感染狀態(tài)下，ATGL基因表達(dá)與免疫細(xì)胞標(biāo)志物的相關(guān)性[12]。

2 結(jié) 果

2.1 ATGL在頭頸鱗癌中的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ATGL在頭頸鱗癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平低于頭頸部非癌組織(P<0.01)，見圖1。隨后，納入GEO數(shù)據(jù)庫的21個數(shù)據(jù)集(表1)進(jìn)行Meta分析，由于數(shù)據(jù)集之間存在異質(zhì)性(I2=60.2%，P<0.001)，因此使用隨機(jī)效應(yīng)模型，分析結(jié)果顯示ATGL在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)下調(diào)[SMD(95%CI)=-0.34(-0.58，-0.10)，P<0.05]，漏斗圖提示數(shù)據(jù)沒有發(fā)表偏倚(Begg′s檢驗P>0.05)，見圖2。在蛋白表達(dá)水平方面，UALCAN數(shù)據(jù)平臺分析結(jié)果提示ATGL在頭頸鱗癌組織中的蛋白表達(dá)水平亦低于頭頸部非癌組織(P<0.001)，見圖1。

圖1 ATGL在頭頸鱗癌組織中的表達(dá)情況

表1 納入數(shù)據(jù)集的基本信息

圖2 ATGL在頭頸鱗癌中轉(zhuǎn)錄水平的驗證結(jié)果

2.2 ATGL表達(dá)與頭頸鱗癌分級和預(yù)后的關(guān)系 對ATGL蛋白表達(dá)水平與頭頸鱗癌腫瘤分級之間的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果提示，與中分化(Grade 2)頭頸鱗癌組織相比，低分化(Grade 3)頭頸鱗癌組織中ATGL的蛋白表達(dá)更低(P<0.05)，見圖3A。對78例Ⅲ期、259例Ⅳ期的頭頸鱗癌患者中進(jìn)行總體生存分析，結(jié)果提示ATGL高表達(dá)的患者的生存率更高(均P<0.05)，見圖3B、圖3C；對499例頭頸鱗癌患者進(jìn)行總體生存分析，結(jié)果提示ATGL低表達(dá)、ATGL高表達(dá)的頭頸鱗癌患者的中位生存期分別為48.87個月、58.73個月，ATGL高表達(dá)者的總體生存率更高(P<0.05)，見圖3D。

圖3 ATGL表達(dá)與頭頸鱗癌分級、分期和預(yù)后的關(guān)系

2.3 ATGL DNA甲基化與頭頸鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性 MethSurv數(shù)據(jù)庫中ATGL共有20個候選CpG島位點，由于甲基化改變通常發(fā)生在CpG島，因此我們對ATGL CpG島的7個甲基化位點進(jìn)行分析，結(jié)果提示共有3個位點的甲基化與患者的預(yù)后相關(guān)，分別為cg04519421、cg09051513和cg19713609(均P<0.05)，見表2。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)與cg04519421、cg09051513位點未發(fā)生高甲基化的頭頸鱗癌患者相比，發(fā)生高甲基化的頭頸鱗癌患者生存率更低(均P<0.05)，預(yù)后更差；而與cg19713609位點未發(fā)生高甲基化的頭頸鱗癌患者相比，發(fā)生高甲基化的頭頸鱗癌患者的生存率更高(均P<0.05)。見圖4。

表2 ATGL DNA甲基化對頭頸鱗癌患者預(yù)后的相關(guān)性

圖4 ATGL CpG位點cg04519421、cg09051513和cg19713609不同甲基化水平患者的生存曲線比較

2.4 ATGL相關(guān)信號傳導(dǎo)通路的GSEA結(jié)果 最終納入富集分?jǐn)?shù)最高、同時滿足P<0.05和FDR>0.25的15個信號通路，發(fā)現(xiàn)在頭頸鱗癌中ATGL主要涉及轉(zhuǎn)錄因子E2F、DNA損傷檢查點G2M、原癌基因MYC、蛋白分泌、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、Hedgehog、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，MTOR)、糖酵解等信號傳導(dǎo)通路，見表3。ATGL的表達(dá)與這些信號通路的基因富集呈負(fù)相關(guān)，即頭頸鱗癌可能通過下調(diào)ATGL來激活這一系列信號通路。

表3 ATGL參與調(diào)控的信號傳導(dǎo)通路列表

2.5 ATGL表達(dá)與頭頸鱗癌的腫瘤純度及免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)性分析 結(jié)果顯示，ATGL的基因表達(dá)水平與腫瘤純度無相關(guān)性(r=0.038，P=0.394)，而與B淋巴細(xì)胞(r=0.215，P=2.09×10-6)、CD4+T淋巴細(xì)胞(r=0.246，P=4.61×10-8)及CD8+T淋巴細(xì)胞(r=0.124，P=6.75×10-3)、巨噬細(xì)胞(r=0.215，P=1.94×10-6)、中性粒細(xì)胞(r=0.230，P=3.50×10-7)及樹突狀細(xì)胞(r=0.243，P=6.38×10-8)等免疫細(xì)胞的浸潤水平呈正相關(guān)，見圖5。

圖5 ATGL基因表達(dá)與頭頸鱗癌的腫瘤純度和免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性

2.6 HPV通過上調(diào)ATGL的表達(dá)影響頭頸鱗癌免疫微環(huán)境 通過ULACAN數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，與HPV陰性的頭頸鱗癌組織相比，ATGL的轉(zhuǎn)錄水平在HPV陽性的頭頸鱗癌組織中表達(dá)更高，見圖6?；诖死^續(xù)探索在HPV感染狀態(tài)下ATGL對頭頸鱗癌免疫微環(huán)境的影響，結(jié)果顯示，與HPV陰性的頭頸鱗癌組織相比，在HPV陽性的頭頸鱗癌組織中ATGL基因表達(dá)水平與CD8+T淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞(總)、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性更高，見表4。

圖6 不同HPV感染狀態(tài)的頭頸鱗癌組織中的ATGL表達(dá)水平

表4 ATGL與免疫細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

ATGL在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中扮演了重要角色。ATGL具有腫瘤特異性，在不同的腫瘤類型中其表達(dá)情況也不同，例如，ATGL在乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等組織中表達(dá)上調(diào)[13-15]，但在更多的腫瘤中，如肺癌、胰腺癌、平滑肌肉瘤，ATGL的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)異常下調(diào)，并參與腫瘤進(jìn)展的調(diào)控[16]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ATGL在頭頸鱗癌中的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)(P<0.05)；與中分化頭頸鱗癌相比，在低分化頭頸鱗癌中ATGL蛋白的表達(dá)水平更低(P<0.05)；且ATGL基因表達(dá)水平越低，腫瘤Ⅲ期及Ⅳ期患者的生存率、頭頸鱗癌患者的總體生存率均更低(P<0.05)。這表明ATGL低表達(dá)與頭頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后均有關(guān)。Qiao等[17]在一項病例對照研究中發(fā)現(xiàn)，外周血中ATGL的異常甲基化與早期肺癌，尤其是年輕女性罹患肺癌的發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)。本研究的甲基化水平分析結(jié)果也提示ATGL CpG島的3個位點的甲基化與患者的預(yù)后相關(guān)(P<0.05)，其中cg04519421、cg09051513位點發(fā)生高甲基化的頭頸鱗癌患者生存率更低。結(jié)合甲基化水平分析結(jié)果，我們推測頭頸鱗癌細(xì)胞可能通過表觀遺傳機(jī)制沉默ATGL的表達(dá)，以促進(jìn)自身的惡性生物學(xué)行為，從而導(dǎo)致預(yù)后不良。

有學(xué)者提出，ATGL 通過氧化物酶增殖體激活受體α、炎癥、氧化還原穩(wěn)態(tài)及自噬等途徑調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18]。而本研究結(jié)果提示，頭頸鱗癌中ATGL主要涉及轉(zhuǎn)錄因子E2F、DNA損傷檢查點G2M、原癌基因MYC、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、TGF-β、Hedgehog、PI3K/AKT/MTOR、糖酵解等信號傳導(dǎo)通路，表明上述通路均從不同層面或角度參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，這也印證了我們提出的關(guān)于頭頸鱗癌細(xì)胞通過下調(diào)ATGL從而激活腫瘤進(jìn)程的假說。

腫瘤微環(huán)境由腫瘤細(xì)胞及其周圍的免疫細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、微血管、細(xì)胞因子和趨化因子等構(gòu)成[19]。在這個復(fù)雜的體系中，腫瘤細(xì)胞及其微環(huán)境相互影響，維持腫瘤細(xì)胞的惡性表型。本研究結(jié)果顯示，頭頸鱗癌中ATGL的表達(dá)與B淋巴細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤程度呈正相關(guān)(P<0.05)。這提示頭頸鱗癌細(xì)胞可能通過下調(diào)ATGL，以抑制免疫細(xì)胞的防御功能，從而發(fā)生免疫逃避，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。

HPV也參與調(diào)控頭頸鱗癌的免疫微環(huán)境。有研究報告，HPV調(diào)控頭頸鱗癌腫瘤微環(huán)境中的體液免疫，從而導(dǎo)致HPV特異性B淋巴細(xì)胞反應(yīng)的發(fā)生，并激活抗體分泌細(xì)胞和生發(fā)中心B淋巴細(xì)胞[20]。在HPV相關(guān)性頭頸鱗癌中，CD8+T淋巴細(xì)胞占腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的30%[21]。2021年，Eberhardt等[21]提出，HPV特異性PD-1+干細(xì)胞樣CD8+T淋巴細(xì)胞具有很高的增殖潛能，對于維持腫瘤特異性CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答至關(guān)重要，靶向性調(diào)控這一細(xì)胞亞群可能可以通過利用局部免疫反應(yīng)，從而改善患者的臨床結(jié)局。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與HPV陰性的頭頸鱗癌組織相比，ATGL在HPV陽性的頭頸鱗癌組織中的表達(dá)較更高，并與CD8+T淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞(總)、B淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞高浸潤的相關(guān)性相對更強(qiáng)。由此可從HPV調(diào)控免疫重編程的角度切入，解釋HPV陽性的頭頸鱗癌患者臨床治療效果和預(yù)后較好的現(xiàn)象。

本研究從腫瘤免疫和表觀遺傳的角度，對ATGL在頭頸鱗癌尤其是HPV相關(guān)性頭頸鱗癌中的作用及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了多維度的探索。結(jié)合研究結(jié)果，我們提出：ATGL是頭頸鱗癌的抑癌基因，是候選的預(yù)后評估相關(guān)分子標(biāo)志物；頭頸鱗癌細(xì)胞可能通過表觀遺傳機(jī)制沉默ATGL的表達(dá)，從而促進(jìn)自身的惡性生物學(xué)行為，同時抑制免疫細(xì)胞的防御功能以發(fā)生免疫逃避，由此導(dǎo)致不良預(yù)后；而HPV可介導(dǎo)ATGL高表達(dá)從而激活腫瘤微環(huán)境中的免疫應(yīng)答，這是HPV相關(guān)性頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者治療應(yīng)答較好的可能機(jī)制。