林 兵 王倩倩 陽(yáng) 靜 胡煒倩 張圳甜 邵建忠 張和平 朱翠鳳

(1 南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科，廣東省深圳市 518101； 2 湖州聚療康復(fù)醫(yī)療中心有限公司，浙江省湖州市 313000； 3 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古呼和浩特市 010018)

孤獨(dú)癥譜系障礙(autistic spectrum disorder，ASD)患兒的主要特征為存在社交、言語和非言語溝通上的困難，以及刻板或重復(fù)行為，多數(shù)病例的發(fā)育異常始于嬰幼兒期，在5歲前就已表現(xiàn)出明顯的癥狀，部分可持續(xù)至成年。該病給患兒家庭帶來重大的精神負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)壓力，受到社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。近年來，ASD的發(fā)病率一直處于快速增長(zhǎng)的狀態(tài)，根據(jù)美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心公布的數(shù)據(jù)，2010年美國(guó)ASD患病率為1.47%[1]， 2021年時(shí)已達(dá)到2.27%[2]。目前我國(guó)仍缺乏ASD患病率的官方統(tǒng)計(jì)報(bào)告，2018年一項(xiàng)Meta分析結(jié)果顯示，我國(guó)ASD的患病率約為0.39%，且處于快速增長(zhǎng)階段[3]。

以往有關(guān)ASD的研究主要集中在基因遺傳方面，然而近年來的研究表明環(huán)境因素對(duì)ASD的影響更大，包括飲食因素、腸道菌群變化、生命早期暴露于有毒有害物質(zhì)等都可能對(duì)ASD的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生影響[4]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)近一半的ASD患兒伴有胃腸道疾病癥狀，主要表現(xiàn)為腹瀉、腹脹、便秘、胃食管反流等，且ASD的嚴(yán)重程度與胃腸功能障礙嚴(yán)重程度往往呈正相關(guān)[5]。正常情況下，腸道具有屏障功能，可有效地阻擋腸道內(nèi)寄生菌向腸腔外組織、器官移位，防止機(jī)體受內(nèi)源性微生物及其分泌毒素的侵害。當(dāng)腸道屏障功能受損或異常時(shí)，如出現(xiàn)缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激、腸道微生物群失調(diào)、細(xì)胞自噬、不良遺傳和環(huán)境因素等影響，則需要使用合適的指標(biāo)來準(zhǔn)確評(píng)估腸道屏障的損傷情況及程度[6]。近年來，血清二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、D-乳酸和細(xì)菌內(nèi)毒素作為評(píng)估腸道屏障功能的指標(biāo)，已逐漸得到重視。本研究通過比較ASD患兒和正常同齡兒童血清的DAO、D-乳酸和細(xì)菌內(nèi)毒素水平，來評(píng)估ASD兒童的腸道屏障功能及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入于2021年1～10月期間，因合并生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等問題至南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科門診和湖州聚療康復(fù)醫(yī)療中心就診的ASD患者(ASD組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)由具有資質(zhì)的兒科或康復(fù)科醫(yī)師根據(jù)美國(guó)精神病學(xué)會(huì)出版的《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第5版》[2]標(biāo)準(zhǔn)診斷為ASD；(2)年齡在3～16周歲之間，性別不限；(3)無已知的免疫缺陷性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良的患兒，診斷參考2009年我國(guó)九市兒童生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)查結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)[7]，體重低于同性別、同年齡兒童平均體重-2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差；(2)患有需要立即治療(或危及生命)的嚴(yán)重胃腸道疾病者；(3)有嚴(yán)重過敏史的患兒；(4)腎功能不全和肝功能障礙的患兒；(5)患有炎癥性腸病、腸梗阻、腸穿孔、腸出血、乳糜瀉、腸易激綜合征、嗜酸性粒細(xì)胞增多癥、食管炎、嗜酸細(xì)胞性胃腸炎或類似病癥的患兒；(6)具有嚴(yán)重感知覺或運(yùn)動(dòng)障礙的患兒。選擇同期因偏食等問題至營(yíng)養(yǎng)科門診就診的3～16周歲非孤獨(dú)癥兒童作為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：生長(zhǎng)發(fā)育正常，即身高/體重均在同年齡、同性別兒童平均身高/體重±2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差范圍內(nèi)。排除標(biāo)準(zhǔn)同ASD組。共納入ASD組患兒19例，正常對(duì)照組兒童38例，兩組性別、年齡、食物和藥物過敏史、近1個(gè)月抗生素和益生菌使用史比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。所有調(diào)查對(duì)象的家屬均簽署了知情同意書，本項(xiàng)目通過了南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審查(批號(hào)：NYSZYYEC20200045)。

表1 兩組兒童一般情況的比較

1.2 臨床資料的收集 包括年齡、性別、身高、體重、食物和藥物過敏史、各種疾病史(遺傳性疾病、血液系統(tǒng)疾病、腎病)、近1個(gè)月的用藥史等。

1.3 腸道屏障功能的檢測(cè) 空腹8 h以上后采集靜脈血5 mL，用抗凝管于4 ℃冷藏備檢。檢測(cè)時(shí)先以3 500 r/min的速度離心6 min，取上層血清20 μL，采用腸屏障功能生化檢測(cè)儀(北京中生金域診斷技術(shù)股份有限公司，型號(hào)：JY-DLT)和DAO/D-乳酸/細(xì)菌內(nèi)毒素試劑盒(北京中生金域診斷技術(shù)有限公司，批號(hào)：09210101)，由檢驗(yàn)師專人進(jìn)行血清DAO、D-乳酸、細(xì)菌內(nèi)毒素水平的測(cè)定。

1.4 ASD患兒病情嚴(yán)重程度的評(píng)估 采用兒童孤獨(dú)癥評(píng)定量表(Childhood Autism Rating Scale，CARS)[8]進(jìn)行評(píng)估。該量表由15項(xiàng)內(nèi)容組成，每項(xiàng)按1～4級(jí)評(píng)分，最高60分，總分≥30分可診斷為ASD，其中≥30分但<36分為輕-中度ASD，≥36分為重度ASD。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均服從正態(tài)分布，以(x±s)表示，方差齊時(shí)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，方差不齊時(shí)采用t′檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；采用Pearson檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組血清DAO、D-乳酸和細(xì)菌內(nèi)毒素水平 與對(duì)照組相比，ASD組血清D-乳酸水平更高(P<0.05)，而兩組血清DAO和細(xì)菌內(nèi)毒素水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 兩組血清DAO、D-乳酸和細(xì)菌內(nèi)毒素水平的比較(x±s)

2.2 ASD患兒病情嚴(yán)重程度與血清DAO、D-乳酸、細(xì)菌內(nèi)毒素水平的相關(guān)性 與輕-中度ASD患兒相比，重度ASD患兒的血清D-乳酸水平更高(P<0.05)，而不同嚴(yán)重程度ASD患兒之間的血清DAO和細(xì)菌內(nèi)毒素水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表3。在ASD組中，CARS評(píng)分與血清D-乳酸水平呈正相關(guān)(r=0.555，P=0.014)，與血清DOA、細(xì)菌內(nèi)毒素水平之間無相關(guān)性(r=-0.052、0.075，P=0.832、0.760)。

表3 不同病情嚴(yán)重程度ASD患者血清DAO、D-乳酸和細(xì)菌內(nèi)毒素水平的比較(x±s)

3 討 論

腸道作為人體的“第二大腦”，可影響大腦認(rèn)知和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。常見的胃腸道癥狀可能與ASD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，這是因?yàn)槟c道功能異?？梢酝ㄟ^腸道微生物-腸-腦軸影響腸道神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等，從而間接地調(diào)控大腦功能，5-羥色胺、細(xì)菌內(nèi)毒素等有毒有害物質(zhì)穿過腸道屏障后，可直接作用于大腦或引發(fā)炎癥因子分泌間接作用于大腦，最終誘發(fā)神經(jīng)和社交功能障礙[9-10]。

目前，評(píng)估腸道屏障功能的手段主要有血清DAO、D-乳酸、內(nèi)毒素水平測(cè)定，以及腸道黏膜組織病理學(xué)檢測(cè)、血培養(yǎng)查找致病菌、糖分子探針檢測(cè)腸黏膜通透性等[11]。其中，DAO是小腸黏膜上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中的一種高活性酶，正常情況下在其他組織和外周血中含量極低；如果腸道黏膜細(xì)胞受損或壞死，細(xì)胞內(nèi)DAO會(huì)釋放至血液中，導(dǎo)致血清DAO水平增加，因此其是評(píng)價(jià)腸道屏障功能非常敏感的指標(biāo)。血清D-乳酸主要來自腸道內(nèi)細(xì)菌無氧代謝，其他組織器官很少分泌，正常情況下其水平較低，但在缺血、缺氧條件下D-乳酸水平明顯升高，并穿過受損的腸黏膜，而人體自身缺少D-乳酸分解代謝酶，因此其濃度較為穩(wěn)定，臨床可將其用于評(píng)估腸道缺血缺氧情況和腸黏膜通透性的變化。內(nèi)毒素主要由革蘭陰性菌死亡裂解產(chǎn)生，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁中的脂多糖。當(dāng)腸道屏障功能受損導(dǎo)致腸黏膜通透性增加時(shí)，內(nèi)毒素可通過腸黏膜進(jìn)入血液系統(tǒng)，形成內(nèi)毒素血癥。上述3種實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)是評(píng)價(jià)患者腸道屏障功能的快捷經(jīng)濟(jì)指標(biāo)，近年來在重癥、頑固性腹瀉等患者中逐漸得到重視和應(yīng)用[12-13]。國(guó)內(nèi)有研究報(bào)告，成人抑郁癥患者血清中的D-乳酸和細(xì)菌內(nèi)毒素水平升高，且兩者水平與患者的年齡增長(zhǎng)呈正相關(guān)[14]。但目前上述3種實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)在ASD患兒中的相關(guān)研究仍較少。

本研究結(jié)果顯示，ASD組血清D-乳酸水平高于正常對(duì)照組(P<0.05)，但是兩組的血清DAO和細(xì)菌內(nèi)毒素水平之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。這表明ASD患兒可能主要存在腸道缺血缺氧和黏膜通透性改變的問題，而沒有急性的腸黏膜壞死或腸道革蘭陰性菌顯著增加的情況[15]。亞組分析提示重度ASD患兒的血清D-乳酸水平較輕-中度ASD患兒更高，ASD患兒的CARS評(píng)分與血清D-乳酸水平呈正相關(guān)(均P<0.05)，表明ASD患兒病情越重，其腸道屏障功能損傷越重。這也與既往一些有關(guān)ASD與腸道屏障功能之間關(guān)系的研究的結(jié)果相似。例如，de Magistris等[16]通過口服果糖/甘露醇回收率實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，36.7%的孤獨(dú)癥患兒和21.2%的孤獨(dú)癥患兒父母腸道通透性增加，而對(duì)照組中發(fā)生腸道通透性改變的兒童僅占4.8%。另有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，丙戊酸誘導(dǎo)的ASD大鼠模型存在黏膜肌層厚度變薄和腸動(dòng)力下降的情況[17]。Hsiao等[9]研究發(fā)現(xiàn)，孕期感染病毒的母鼠，其子代除了表現(xiàn)出ASD的核心癥狀，在成年后還會(huì)出現(xiàn)腸道通透性增加，以及血液中腸道微生物代謝產(chǎn)物增加的情況。這些研究結(jié)果表明，ASD與腸屏障功能損傷相關(guān)，但是腸黏膜組織病理學(xué)、口服乳糖/甘露醇回收率試驗(yàn)等檢測(cè)方法應(yīng)用較少，不適宜推廣，目前仍缺少認(rèn)可度高、可方便快捷評(píng)估ASD患者腸道屏障功能的方法，而本研究結(jié)果提示血清D-乳酸或可發(fā)揮這一評(píng)估作用。

當(dāng)前世界各國(guó)對(duì)ASD的研究基礎(chǔ)仍很薄弱[18-19]，尤其對(duì)ASD的病因研究仍較缺乏。近年來，腸道微生物-腸-腦軸機(jī)制逐漸受到重視，腸道屏障功能可能是其中的關(guān)鍵一環(huán)，本研究表明ASD患兒的血清D-乳酸水平升高，這反映其腸道屏障功能存在一定損傷，且孤獨(dú)癥疾病評(píng)分越高，腸道屏障功能損傷越嚴(yán)重。由此可見，對(duì)腸道屏障功能進(jìn)行及時(shí)和連續(xù)的監(jiān)測(cè)可以評(píng)估ASD患兒腸-腦軸的變化，具有重要的臨床價(jià)值。但本研究樣本量不大，加上飲食差異等因素可能對(duì)腸道屏障功能產(chǎn)生潛在影響[6，20]，因此未來仍需更加深入地研究以明確腸道屏障功能在ASD中的作用。