席啦,向凡舒,張彥,張海波,郭壯*
1(湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心,湖北 襄陽(yáng),441053) 2(湖北文理學(xué)院 乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽(yáng)市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 襄陽(yáng),441053) 3(安琪酵母股份有限公司生物技術(shù)研究院,湖北 宜昌,443003)
鲊,作為我國(guó)流傳千年的一種食物保存方法,通常是用米粉或面粉等加入其他佐料經(jīng)過(guò)密封發(fā)酵,在我國(guó)云貴川湘鄂贛等地常見(jiàn)[1]。鄂西地區(qū)將辣椒稱(chēng)為廣椒,則有了鲊廣椒這一特色菜肴,其滋味酸辣咸香,烹飪方式多種多樣。近年來(lái),國(guó)內(nèi)針對(duì)鲊廣椒的品質(zhì)、工藝和微生物類(lèi)群等方面均有開(kāi)展研究。尚雪嬌等[2]采用仿生技術(shù)對(duì)當(dāng)陽(yáng)地區(qū)鲊廣椒的感官品質(zhì)及有機(jī)酸進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)鲊廣椒中芳香類(lèi)揮發(fā)性物質(zhì)較少,且在酸味指標(biāo)上差異較大,而酸味的來(lái)源主要為乳酸。王玉榮等[3]采用第二代測(cè)序技術(shù)分別對(duì)當(dāng)陽(yáng)地區(qū)鲊廣椒中的真菌和細(xì)菌多樣性進(jìn)行了解析,結(jié)果顯示念珠菌屬(Candida)、曲霉菌屬(Eurotium)和畢赤酵母屬(Pichia)為鲊廣椒中主要的真菌屬;乳桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)和片球菌屬(Pediococcus)等乳酸菌為鲊廣椒中主要的細(xì)菌屬[4]。此外,CAI等[5]針對(duì)恩施土家族苗族自治州鲊廣椒細(xì)菌類(lèi)群展開(kāi)了研究,結(jié)果亦表明鲊廣椒中蘊(yùn)含了大量的Lactobacillus等乳酸菌類(lèi)群。不同地域和制作工藝等因素可能對(duì)鲊廣椒中的微生物類(lèi)群有著一定的影響[6],因此解析不同地區(qū)鲊廣椒的微生物類(lèi)群對(duì)全面掌握鲊廣椒中的微生物種類(lèi)具有重要意義。
作為湖北省直接管轄的縣級(jí)市之一,天門(mén)市坐落于長(zhǎng)江中游城市群,當(dāng)?shù)匾嘤绪噺V椒的制作與食用習(xí)俗,而其較為特殊的地理環(huán)境可能使天門(mén)地區(qū)鲊廣椒與其他地區(qū)鲊廣椒的微生物類(lèi)群存在一定差異。本研究采用MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)天門(mén)地區(qū)鲊廣椒中細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析的同時(shí),對(duì)菌屬之間的相關(guān)性亦展開(kāi)探討,并進(jìn)一步預(yù)測(cè)菌群功能,此外還采用純培養(yǎng)方式對(duì)其中的乳酸菌進(jìn)行鑒定和保藏,以期在后續(xù)鲊廣椒產(chǎn)業(yè)化加工和產(chǎn)品創(chuàng)新中提供理論參考和菌株支持。
樣品采集:15份鲊廣椒樣品分別于2019年10月采集自湖北省天門(mén)市人民路市場(chǎng)、官路農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和南湖臨時(shí)菜市場(chǎng),樣品編號(hào)為T(mén)M01~15。所有樣品均為不同農(nóng)戶(hù)家中自制,樣品選擇標(biāo)準(zhǔn):發(fā)酵時(shí)間超過(guò)30 d,且未經(jīng)過(guò)熟制;色澤呈玉米黃或略帶紅色;不存在除鲊廣椒以外的異味。
基因組提取試劑盒,德國(guó)QIAGEN公司;DNA聚合酶、rTaq酶和10×Buffer、dNTP,寶生物工程(大連)有限公司;MRS、LB培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司;正向引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)、反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′),武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。
Veriti FAST梯度PCR儀,美國(guó)ABI公司;UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng),美國(guó)Protein Simple公司;Illumina MiSeq PE250高通量測(cè)序平臺(tái),美國(guó)Illumina公司;R930型機(jī)架式服務(wù)器,美國(guó)DELL公司;DG250型厭氧工作站,英國(guó)Don Whitley公司。
1.3.1 宏基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序
鲊廣椒宏基因組DNA提?。好糠輼悠啡? g,參照基因組提取試劑盒使用方法提取宏基因組DNA。
PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序:在正向引物前段添加8個(gè)堿基對(duì)作為核苷酸標(biāo)簽以便進(jìn)行序列配對(duì)。針對(duì)提取合格的總DNA的16S rRNA V3~V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件均參照李娜等[7]的方法,檢測(cè)合格的擴(kuò)增產(chǎn)物寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測(cè)序。
1.3.2 序列質(zhì)控和生物信息學(xué)分析
參照郭壯等[8]的方法對(duì)下機(jī)序列進(jìn)行配對(duì)和質(zhì)控,下機(jī)后的序列采用QIIME平臺(tái)(v1.9.0)進(jìn)行生物信息學(xué)分析[9]。采用UCLUST兩步法按照100%和97%相似度構(gòu)建分類(lèi)操作單元(operational taxonomic units,OTU)[10]矩陣,使用ChimeraSlayer軟件將含有嵌合體序列的OTU刪除[11];余下OTU分別選出1 條代表性序列在數(shù)據(jù)庫(kù)[12-13]中進(jìn)行比對(duì),將OTU的分類(lèi)學(xué)地位分別鑒定到門(mén)、綱、目、科和屬水平上;使用主坐標(biāo)分析和圍繞中心點(diǎn)的劃分(partitioning around medoid,PAM)聚類(lèi)分析對(duì)鲊廣椒樣品進(jìn)行β多樣性分析;通過(guò)計(jì)算所有樣品的Chao 1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)對(duì)樣品進(jìn)行α多樣性分析;采用PICRUSt軟件預(yù)測(cè)鲊廣椒的菌群功能[14]。
1.3.3 乳酸菌的分離鑒定
乳酸菌的分離:參照向凡舒等[15]的方法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理和倍比稀釋涂布后,將MRS平板于30 ℃厭氧培養(yǎng)36~48 h后取出。選取形狀、顏色、表面光滑程度和大小均有不同,且周?chē)a(chǎn)生透明圈的疑似乳酸菌菌落,采用平板劃線(xiàn)法進(jìn)行純化,同時(shí)對(duì)純化后的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn),最后采用甘油保藏法將革蘭氏陽(yáng)性且過(guò)氧化氫酶陰性的菌株保藏于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>
乳酸菌的鑒定:首先富集菌體并提取疑似乳酸菌菌株DNA,繼而參照1.3.1中的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對(duì)合格產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化,最后挑取陽(yáng)性克隆子寄至上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序,返回的序列經(jīng)過(guò)手動(dòng)去引物后在BLAST網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)[16]。
1.3.4 數(shù)據(jù)處理
使用past3軟件進(jìn)行Mann-Whitnay檢驗(yàn),分析不同聚類(lèi)間的顯著差異;使用Origin2017軟件繪制主坐標(biāo)分析圖和柱形圖;使用R(v4.1.0)軟件繪制PAM聚類(lèi)圖[17]和α指數(shù)小提琴圖;使用GraphPad Prism 9繪制不同聚類(lèi)間菌屬差異柱形圖;使用Cytoscape(v3.7.2)繪制菌屬相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖;使用STAMP(2.1.3)繪制COG功能差異圖;使用MEGA7.0和R(v4.1.0)軟件共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
本研究首先采用主坐標(biāo)分析法和PAM聚類(lèi)分析法來(lái)探討不同鲊廣椒樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)特征,結(jié)果如圖1所示。由圖1-a可知,第一主成分和第二主成分的占比分別為86.38%和4.74%,且所有樣品在空間排布上呈現(xiàn)出了明顯的聚類(lèi)和分離趨勢(shì)。其中10個(gè)樣品(TM02、TM03、TM04、TM05、TM07、TM08、TM09、TM010、TM13和TM15)較為集中的排布在第一主成分的負(fù)軸周?chē)瑢⑵湟暈榫垲?lèi)Ⅰ。而另外5個(gè)樣品(TM01、TM06、TM11、TM12和TM14)則較為分散的排布在第一、三和四象限中,將其視為聚類(lèi)Ⅱ。
經(jīng)PAM聚類(lèi)分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)15份樣品被分為2個(gè)聚類(lèi)時(shí),CH指數(shù)最高,為39,而當(dāng)樣品被分為3~5個(gè)聚類(lèi)時(shí),CH指數(shù)分別為27、10和5,這表明最佳聚類(lèi)數(shù)為2。由圖1-b可知,利用主坐標(biāo)分析將K-Means聚類(lèi)分析結(jié)果可視化后的2個(gè)聚類(lèi)分離趨勢(shì)亦非常明顯,其中10 個(gè)樣品全部分布在第二象限和第三象限,而另外5個(gè)樣品則全部分布在第一象限和第四象限。K-Means聚類(lèi)趨勢(shì)同主坐標(biāo)分析得到的聚類(lèi)其樣品組成完全相同。值得注意的是,聚類(lèi)Ⅰ中的樣品與聚類(lèi)Ⅱ相比分布更為集中,這說(shuō)明聚類(lèi)Ⅰ中樣品的菌群結(jié)構(gòu)更為相近。

a-基于加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析; b-基于OTU水平的PAM聚類(lèi)分析圖1 基于加權(quán)UniFrac距離的主坐標(biāo)分析和基于 OTU水平的PAM聚類(lèi)分析Fig.1 Principal coordinate analysis based on weighted UniFrac distance and PAM cluster analysis based on OTU level
在對(duì)樣品進(jìn)行β多樣性分析的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步通過(guò)α指數(shù)來(lái)分析2個(gè)聚類(lèi)中的物種豐富度和均勻度。本研究對(duì)所有樣品序列均進(jìn)行了抽平處理,2個(gè)聚類(lèi)的Chao 1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)如圖2所示。
由圖2可知,聚類(lèi)Ⅰ的4項(xiàng)α多樣性指數(shù)均小于聚類(lèi)Ⅱ,且兩個(gè)聚類(lèi)在Chao 1指數(shù)(圖2-a)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)(圖2-b)上的差異非常顯著(P<0.01),在香農(nóng)指數(shù)(圖2-c)上差異顯著(P<0.05),而在辛普森指數(shù)(圖2-d)上差異不顯著(P>0.05)。這表明聚類(lèi)Ⅰ的細(xì)菌類(lèi)群在豐富度和多樣性上均要顯著低于聚類(lèi)Ⅱ。

圖2 兩個(gè)聚類(lèi)的α多樣性指數(shù)比較分析Fig.2 Comparative analysis of α diversity index of the two clusters注:*表示差異顯著,P<0.05;**表示差異非常顯著,P<0.01;NS表示差異不顯著,P>0.05
所有樣品經(jīng)過(guò)測(cè)序共得到359 236條高質(zhì)量序列,經(jīng)過(guò)97%相似度劃分得到11 582個(gè)OTU,經(jīng)比對(duì)共鑒定到18個(gè)門(mén)和260個(gè)屬。本研究將平均相對(duì)含量>1.0%的門(mén)和屬作為鲊廣椒中的優(yōu)勢(shì)門(mén)和屬[18],2個(gè)聚類(lèi)中的優(yōu)勢(shì)門(mén)相對(duì)含量分布及差異分析如圖3所示。聚類(lèi)Ⅰ中的優(yōu)勢(shì)門(mén)為Firmicutes(硬壁菌門(mén),96.99%)和Proteobacteria(變形菌門(mén),2.30%),聚類(lèi)Ⅱ中的優(yōu)勢(shì)門(mén)為Proteobacteria(62.94%)、Firmicutes(22.86%)和Actinobacteria(放線(xiàn)菌門(mén),9.00%)。經(jīng)過(guò)Mann-Whitnay檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2個(gè)聚類(lèi)在3個(gè)門(mén)上均差異顯著,且在Firmicutes(圖3-b)和Proteobacteria(圖3-c)上的差異極顯著(P<0.001)。

a-優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)分布;b-硬壁菌門(mén);c-變形菌門(mén)圖3 兩個(gè)聚類(lèi)中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)分布及硬壁菌門(mén)和變形菌門(mén)相對(duì)含量差異分析Fig.3 Analysis on the distribution of dominant bacteria and the relative content difference of Firmicutes and Proteobacteria in the two clusters注:***表示差異極顯著,P<0.001(下同)
2個(gè)聚類(lèi)中的優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)含量分布及差異分析如圖4所示。由圖4可知,聚類(lèi)Ⅰ中有4個(gè)優(yōu)勢(shì)屬,分別為L(zhǎng)actobacillus(乳桿菌屬,89.77%)、Tetragenococcus(四聯(lián)球菌屬,3.29%)、Weissella(魏斯氏菌屬,2.20%)和Staphylococcus(葡萄球菌屬,1.52%),其中乳酸菌含量高達(dá)95.26%;聚類(lèi)Ⅱ中有8 個(gè)優(yōu)勢(shì)屬,分別為Klebsiella(克雷伯氏菌屬,19.81%)、Kosakonia(小坂菌屬,12.24%)、Tetragenococcus(10.89%)、Lactobacillus(8.17%)、Pseudomonas(假單胞菌屬,5.5%)、Xanthomonas(黃單胞菌屬,4.08%)、Rhizobium(根瘤菌屬,4.08%)和Corynebacterium(棒狀桿菌屬,3.35%),乳酸菌含量?jī)H為19.06%。經(jīng)Mann-Whitnay檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),2個(gè)聚類(lèi)間在Lactobacillus、Klebsiella、Kosakonia和Pseudomonas上均存在極顯著差異(P<0.001)。由此可見(jiàn),聚類(lèi)Ⅱ中的優(yōu)勢(shì)菌屬數(shù)量要明顯多于聚類(lèi)Ⅰ,但聚類(lèi)Ⅰ中乳酸菌含量要遠(yuǎn)高于聚類(lèi)Ⅱ。王玉榮等[4]前期在解析湖北省當(dāng)陽(yáng)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌類(lèi)群時(shí)得到的結(jié)論與本研究的聚類(lèi)Ⅰ相似,而與聚類(lèi)Ⅱ中的菌群結(jié)構(gòu)差異較大。

a-優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬;b-乳桿菌屬;c-克雷伯氏菌屬;d-小坂菌屬e-假單胞菌屬圖4 兩個(gè)聚類(lèi)中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬分布及乳桿菌屬、克雷伯氏菌屬、小坂菌屬和假單胞菌屬相對(duì)含量差異分析Fig.4 Analysis on the distribution of dominant bacteria and the relative content difference of Lactobacillus, Klebsiella, Kosakonia and Pseudomonas in the two clusters
聚類(lèi)Ⅱ中的部分菌屬包含著一些具有條件致病性的菌種,例如隸屬于Klebsiella的Klebsiellapneumoniae被認(rèn)為是全球性的病原菌,可導(dǎo)致化膿性肝膿腫、肺炎和軟組織感染等[19];隸屬于Pseudomonas的Pseudomonasaeruginosa對(duì)人體健康具有急慢性感染性[20];而Xanthomonasspp.是一類(lèi)廣泛的植物病原菌[21]。由此可見(jiàn),2個(gè)聚類(lèi)樣品在安全品質(zhì)上可能亦存在差異,這或許是不同農(nóng)戶(hù)選擇的制作原料在品質(zhì)上存在較大偏差,亦或是制作環(huán)境差異所導(dǎo)致的。
為探討鲊廣椒中菌群間的相關(guān)關(guān)系,本研究進(jìn)一步對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析,結(jié)果如圖5所示。Xanthomonas與Rhizobium顯著正相關(guān)(R=0.540,P<0.05),與Kosakonia極顯著正相關(guān)(R=0.879,P<0.001);Pseudomonas與Klebsiella極顯著正相關(guān)(R=0.820,P<0.001);而Lactobacillus與Xanthomonas(R=-0.596,P<0.05)和Kosakonia(R=-0.552,P<0.05)顯著負(fù)相關(guān),與Pseudomonas(R=-0.698,P<0.01)和Klebsiella呈非常顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(R=-0.738,P<0.01)。王玉榮等[22]采用第三代測(cè)序技術(shù)解析當(dāng)陽(yáng)地區(qū)鲊廣椒中細(xì)菌多樣性,結(jié)果表明L.plantarum是其中最主要的菌種,而MAO等[23]的研究表明L.plantarum產(chǎn)生的乳酸等成分可起到抑菌作用。因而從理論上推斷,Lactobacillus對(duì)Xanthomonas等具有條件致病性菌屬的生長(zhǎng)繁殖可能具有一定的抑制作用。

圖5 鲊廣椒中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Correlation network of dominant genus in Zha-chili注:實(shí)線(xiàn)表示正相關(guān),虛線(xiàn)表示負(fù)相關(guān), 線(xiàn)條的粗細(xì)代表相關(guān)性的大小。
本研究進(jìn)一步對(duì)不同聚類(lèi)的菌群功能以及功能差異進(jìn)行了分析。所有樣品共注釋4 166個(gè)COG,分別屬于23個(gè)功能大類(lèi)。2個(gè)聚類(lèi)在功能上存在的差異如圖6所示,聚類(lèi)Ⅰ在D、L、J、R和F功能上顯著大于聚類(lèi)Ⅱ(P<0.05),而聚類(lèi)Ⅱ在U、A、Q、C、T、O、P、K、G和E功能上顯著大于聚類(lèi)Ⅰ(P<0.05),但2個(gè)聚類(lèi)在R、G和E功能上的表達(dá)均較高。玉米面作為天門(mén)鲊廣椒的主要原料,其營(yíng)養(yǎng)成分主要為淀粉和蛋白質(zhì)[24-25],而這兩者通常是為微生物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的良好來(lái)源。因而,在菌群吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)維持生存的同時(shí),必將會(huì)引起一些產(chǎn)物的代謝反應(yīng),這或許是鲊廣椒中細(xì)菌類(lèi)群在碳水化合物和氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝功能上具有較高表達(dá)的原因。

A-RNA加工與修飾;C-能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換;D-細(xì)胞周期控制,細(xì)胞 分裂,染色體分割;E-氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝;F-核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝; G-碳水化合物運(yùn)輸和代謝;J-翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成; K-轉(zhuǎn)錄;L-復(fù)制、重組和修復(fù);O-翻譯后飾,蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn),伴侶; P-無(wú)機(jī)離子及代謝;Q-次生代謝物的生物合成、運(yùn)輸和分解代謝; R-一般功能預(yù)測(cè)預(yù)測(cè);T-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制;U-細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、 分泌和囊泡運(yùn)輸圖6 兩個(gè)聚類(lèi)中細(xì)菌基因功能預(yù)測(cè)差異分析Fig.6 Differential analysis of predicted bacterial gene functions in the two clusters
通過(guò)純培養(yǎng),本研究所采集的15份樣品共分離得到34株疑似乳酸菌分離株,經(jīng)序列比對(duì)后鑒定結(jié)果如圖7所示。

圖7 鲊廣椒中乳酸菌分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria isolates from Zha-chili
由圖7可知,所有分離株共被鑒定到10個(gè)種,其中有13株鑒定為L(zhǎng).plantarum(植物乳桿菌,38.24%),6株鑒定為L(zhǎng).brevis(短乳桿菌,17.65%),5株鑒定為L(zhǎng).curvatus(彎曲乳桿菌,14.7%),3株鑒定為L(zhǎng).sakei(清酒乳桿菌,8.82%),2株鑒定為L(zhǎng).alimentarius(食品乳桿菌,5.88%),各有1株鑒定為L(zhǎng).spicheri(辣味乳桿菌,2.94%)、L.acidipiscis(嗜酸乳桿菌,2.94%)、W.paramesenteroides(類(lèi)腸膜魏斯氏菌,2.94%)、L.buchneri(布氏乳桿菌,2.94%)和Leuconostocmesenteroides(腸膜明串珠菌,2.94%)。由此可見(jiàn),L.plantarum為天門(mén)地區(qū)鲊廣椒中的優(yōu)勢(shì)乳桿菌。
本研究采用高通量測(cè)序和傳統(tǒng)微生物學(xué)相結(jié)合的手段對(duì)天門(mén)地區(qū)鲊廣椒細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析,對(duì)其蘊(yùn)含的乳酸菌類(lèi)群進(jìn)行了分離鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),15份天門(mén)鲊廣椒樣品被劃分為2個(gè)聚類(lèi),聚類(lèi)Ⅰ中的細(xì)菌主要為隸屬于Firmicutes的Lactobacillus,而聚類(lèi)Ⅱ中的細(xì)菌主要為隸屬于Proteobacteria的Klebsiella和Kosakonia以及隸屬于Firmicutes的Tetragenococcus,其中L.plantarum、L.brevis和L.curvatus為鲊廣椒中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌。由此可見(jiàn),天門(mén)地區(qū)鲊廣椒的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣,乳酸菌類(lèi)群豐富,通過(guò)本研究的開(kāi)展可為后續(xù)鲊廣椒產(chǎn)業(yè)化的實(shí)現(xiàn)和產(chǎn)品的創(chuàng)新提供一定的理論參考和菌種支持。