蔡思娜 陳劍光 關(guān)小倩 梁衛(wèi)江

1南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤科（廣州 510630）；2廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究部轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實驗室（廣州 510080）；3南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院腫瘤科（廣州 510515）

宮頸癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤第4 位，僅2018年在中國就有10.6 萬例發(fā)?。?］。晚期宮頸鱗癌的復(fù)發(fā)和死亡率高［2］，提高其5年生存率的一個關(guān)鍵是找到能夠準(zhǔn)確預(yù)測療效且靈敏度高腫瘤標(biāo)志物。表面增強激光解吸飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（surface enhanced lasar desorption/ionization time of flight?mass spectrometry，SELDI?TOF?MS）［3］是近年來發(fā)展新技術(shù)，在較多腫瘤中已進(jìn)行相關(guān)研究，如乳腺惡性腫瘤［4-5］、卵巢惡性腫瘤［6］、肺惡性腫瘤［7］等。然而大部分實驗均是比較癌與正常人之間的差異蛋白質(zhì)，很少研究腫瘤治療后蛋白質(zhì)變化情況，目前在國內(nèi)外中未見宮頸鱗癌手術(shù)前后三個不同時期差異蛋白質(zhì)的研究，因而本研究采取上述技術(shù)結(jié)合弱陽離子芯片（CM10），動態(tài)分析宮頸鱗癌患者手術(shù)前后蛋白質(zhì)變化，從而找出相應(yīng)差異蛋白質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料本研究在南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院共收集27 例宮頸鱗癌患者的血清（2008年3月至2008年12月期間），患者術(shù)后病理分期具體如下：Ⅰa 期1 例，Ⅰb 期14 例，Ⅱa 期10 例，Ⅱb期2 例（其中高分化3 例，中分化16 例，低分化8 例）?；颊叩腜S 評分均> 70 分，血清總蛋白及白蛋白正常，中位年齡46 歲（42～50 歲）。有20 例宮頸鱗癌患者隨訪收集了其術(shù)后30～40 d 的血清標(biāo)本，中位年齡47歲（42～52歲）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）確診時未經(jīng)手術(shù)放化療等治療；（2）相關(guān)資料完整；（3）患者均行廣泛全子宮切除＋盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)。按照手術(shù)時間將宮頸癌患者分為術(shù)前（A1組）、術(shù)后7～10 d（A2 組）及術(shù)后30～40 d（A3 組）。將健康對照組設(shè)為B 組，取自健康體檢女性的血清（同期南方醫(yī)院），對照組和手術(shù)組之間的年齡構(gòu)成比無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究已通過南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院倫理委員會的倫理批準(zhǔn)和獲得相關(guān)患者及健康組人員的知情同意。

1.2 儀器和試劑弱陽離子芯片（CM10）（美國Ciphergen 公司），5810R 低溫臺式離心機（德國Ep?pendorf），SELDI?TOF?MS（美國Ciphergen 公司），millipore 去離子水，尿素、Tris.Hcl、乙腈以及二硫蘇糖醇等來自美國Sigma 公司。

1.3 檢測血清蛋白

1.3.1 收集樣品采集3～5 mL靜脈血（需清晨空腹，血液不抗凝），60 min 靜置后，在4 ℃1 000 rpm/min條件下用離心機離心20 min，小心吸取離心后上清放入EP 管內(nèi)，于-80℃冰箱保存。

1.3.2 處理樣品步驟在冰盒上融化樣品，上述同樣條件離心2 min ，用18 μL U9 緩沖液充分稀釋9 μL 血清，進(jìn)行30 min 冰浴震蕩，隨后將上述樣品加入90 μL 的結(jié)合緩沖液（50 mmol/L NaAC，pH 4.0），混勻。

1.3.3 CM10 芯片的預(yù)處理步驟準(zhǔn)備好生物芯片處理器，將芯片裝入，然后每孔加200 μL 的結(jié)合緩沖液，在450 rpm/min 條件下，振蕩5 min 后甩掉緩沖液；重復(fù)一次。

1.3.4 蛋白質(zhì)結(jié)合反應(yīng)步驟按照100 mL/孔的標(biāo)準(zhǔn)將上面處理好的樣品加入處理器中，在450 rpm/min條件下，進(jìn)行60 min 室溫震蕩，甩出樣品后每孔再加入200 μL的結(jié)合緩沖液，相同條件下振蕩5 min，再次甩去緩沖液，重復(fù)一次；隨后每孔加入去離子水200 μL，馬上甩出，待芯片微干時，加SPA 0.5 mL/孔，微干后，重復(fù)一次。

1.3.5 檢測芯片質(zhì)譜儀先用標(biāo)準(zhǔn)芯片進(jìn)行校正，然后進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，隨后在軟件（Ciphergen ProteinChip）中按照設(shè)置程序來讀取芯片數(shù)據(jù)，以及準(zhǔn)確地得出相關(guān)蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法設(shè)有意義蛋白峰的最低信噪比為5，最低出現(xiàn)頻率閾值為15%。將信噪比（S/N）>3 和分子量偏差<0.5%的峰也標(biāo)記為有效蛋白峰（為避免遺漏小的蛋白峰）。聯(lián)用Ciphergen Protein Chip 3.1 和Biomarker Wizard 軟件，對質(zhì)譜圖進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，比較血清蛋白質(zhì)譜峰差異。統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0，不同組之間蛋白峰比較采用t檢驗，對于手術(shù)前后三個不同時期蛋白峰對比采用析因分析，當(dāng)P<0.05 時為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

對B 組與宮頸鱗癌患者A1 組、A2 組及A3 組的蛋白質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行對比，得到了2 組不同血清差異蛋白質(zhì)。

2.1 宮頸鱗癌患者手術(shù)不同時期的16 種差異蛋白質(zhì)第一組為16 個宮頸鱗癌與對照組相比的差異蛋白質(zhì)，在術(shù)后7～10 d 其含量呈上升趨勢（A3組與B 組比較，均P>0.1）；其中12 個蛋白質(zhì)（除表1中第13?16 蛋白）在A1 組與A2 組比較中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表1、圖1，P≤0.001）。

圖1 宮頸鱗癌患者第一組部分血清差異蛋白質(zhì)在不同手術(shù)時期質(zhì)譜峰圖Fig.1 The mass peak map of six different serum proteins in the same paitent with cervical squamous cell carcinoma between pre?operation and post?operation

表1 16 種差異蛋白質(zhì)在宮頸鱗癌患者手術(shù)不同時期血清中的質(zhì)譜峰值Tab.1 The peek intensity of 16 different proteins in the patient with cervical squamous cell carcinoma between pre?operation ±s

表1 16 種差異蛋白質(zhì)在宮頸鱗癌患者手術(shù)不同時期血清中的質(zhì)譜峰值Tab.1 The peek intensity of 16 different proteins in the patient with cervical squamous cell carcinoma between pre?operation ±s

編號A1 組（images/BZ_42_2142_2300_2165_2333.png±s）組內(nèi)比較P 值Mass（Da）2 950.38 3 885.53 4 074.49 4 473.88 5 334.74 5 632.30 5 901.93 6 087.13 6 109.62 6 627.27 7 765.25 9 286.48 3 315.77 3 397.42 12 860.11 13 263.98 A2 組（images/BZ_42_2142_2300_2165_2333.png±s）A3 組（images/BZ_42_2142_2300_2165_2333.png±s）1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 7.058±2.765 4.832±1.488 8.844±2.807 3.782±1.671 7.282±3.171 28.502±12.421 36.991±10.794 1.999±0.985 4.320±1.616 45.631±16.555 15.911±5.343 5.463±3.538 12.407±6.906 5.655±1.629 0.396±0.252 0.255±0.217 11.390±4.320 9.528±3.749 12.674±3.927 6.212±2.358 14.232±5.920 41.286±9.453 57.339±10.506 4.847±1.861 9.228±3.242 61.471±10.474 32.016±9.982 12.884±5.479 19.757±7.146 12.357±6.240 0.771±0.448 0.606±0.370 15.612±7.308 8.545±3.853 13.842±4.781 7.518±2.426 18.228±10.339 49.212±13.970 62.509±14.690 5.256±2.936 11.061±5.464 61.868±12.078 27.220±11.452 10.197±5.368 20.944±9.712 11.998±6.222 0.537±0.260 0.501±0.478 P 值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 0.004 0.002 0.003 0.004 A1：A2 0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 A1：A3<0.001 0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001 0.001 0.002 0.002<0.001 0.038 0.026 A2：A3 0.026 0.413 0.368 0.104 0.095 0.087 0.238 0.549 0.169 0.883 0.169 0.060 0.681 0.874 0.057 0.318

2.2 宮頸鱗癌患者手術(shù)不同時期的12 種差異蛋白質(zhì)第二組為12 個A1 組與A3 組之間相比的差異蛋白質(zhì)，在術(shù)前患者、術(shù)后7～10 d 及術(shù)后30～40 d 血清中的含量不斷上升，有11 個蛋白質(zhì)在術(shù)后30～40 d時基本恢復(fù)到對照組水平（表2、圖2）。

圖2 宮頸鱗癌患者第二組部分血清差異蛋白質(zhì)在不同手術(shù)時期質(zhì)譜峰圖Fig.2 The mass peak map of five different serum proteins in the same paitent with cervical squamous cell carcinoma between pre?operation and post?operation

表2 12 種差異蛋白質(zhì)在宮頸鱗癌患者手術(shù)不同時期的質(zhì)譜峰值Tab.2 The peek intensity of 12 different proteins in the patient with cervical squamous cell carcinoma between pre?operation x±s

3 討論

宮頸鱗癌的治療以綜合治療為主，加強對手術(shù)效果監(jiān)控和評價，盡早發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)，對宮頸鱗癌整體診療非常重要［8］。目前國際上有許多蛋白組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于宮頸癌［9］，而SELDI?TOF 技術(shù)則是一種非常有用的生物標(biāo)志物篩選技術(shù)，可以直接分析復(fù)雜樣品，可檢測20 kda 以下的蛋白質(zhì)，這些小分子量蛋白質(zhì)可能因疾病而被切斷或脫落，因此具有生物學(xué)意義。本技術(shù)在肝癌［10-11］、腦部疾?。?2］、感染疾?。?3］、Wilms 腫瘤［14］及篩選結(jié)腸癌手術(shù)后復(fù)發(fā)差異蛋白質(zhì)［15］等多種疾病的診斷以及治療中應(yīng)用廣泛，然而目前在國內(nèi)外中未見宮頸鱗癌手術(shù)前后三個不同時期血清差異蛋白質(zhì)的研究。

本研究通過對比宮頸鱗癌患者手術(shù)前后血清中蛋白質(zhì)變化，結(jié)合對比健康人血清蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)了兩組差異蛋白質(zhì)：第一組所含有的3 397.42（M/Z）、4 473.88（M/Z）、5 901.93（M/Z）等16 個差異蛋白質(zhì)在術(shù)前患者的血清含量中，與對照組相比，明顯處于低值，有可能作為生物標(biāo)志物，用于區(qū)分宮頸鱗癌與健康人；進(jìn)一步分析這16 個差異蛋白質(zhì)含量在術(shù)后30～40 d 基本恢復(fù)至健康人水平；這種變化趨勢與郭社珂等［16］采用不同于CM10 的銅離子芯片，使用SELDI 技術(shù)對比宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)前和術(shù)后血清蛋白質(zhì)，結(jié)果得到6 個低表達(dá)的差異蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)在術(shù)后3 個月有明顯回升，和本實驗結(jié)果一致，而且該研究中的M/Z為9 280.63 的差異蛋白質(zhì)和本組所得到的差異蛋白質(zhì)9 286.48（M/Z）幾乎相同，可認(rèn)為是同一蛋白質(zhì)。由此可以推斷通過SELDI?TOF 技術(shù)所檢測出的結(jié)果有較高的可靠性及可重復(fù)性。第二組的差異蛋白質(zhì)中有5 個在術(shù)前患者血清的含量明顯低于對照組，也可作為區(qū)分宮頸癌患者與健康人的生物標(biāo)志物；尤其是2 741.41（M/Z）、4 173.61（M/Z）、6 479.29（M/Z）3 個用于組成宮頸鱗癌診斷樹模型的差異蛋白質(zhì)［17］。雖然第二組差異蛋白的含量在A1 和A2 的對比中沒有發(fā)生顯著變化，但是在術(shù)后30～40 d 含量上升，結(jié)合第一組蛋白質(zhì)含量變化趨勢，由此可以推斷這兩組蛋白質(zhì)是一組機體或其它器官組織分泌保護(hù)因子或抑癌因子，由于存在腫瘤組織的抑制，使其含量明顯降低，在手術(shù)切除腫瘤后，含量不斷上升至正常。從本研究可看出，手術(shù)治療效果能夠通過SELDI 技術(shù)結(jié)合芯片盡早檢測出來，具體可通過觀察相關(guān)差異蛋白質(zhì)的變化趨勢，而其他腫瘤研究也支持這個結(jié)論，CHAI 等［18］研究表明，通過該技術(shù)進(jìn)行血清蛋白質(zhì)組學(xué)分析，可以在盆腔放療前發(fā)現(xiàn)易出現(xiàn)放射性直腸炎的宮頸癌患者，從而對后續(xù)干預(yù)起到指導(dǎo)作用。而ZHOU 等［15］使用該技術(shù)比較了結(jié)腸癌術(shù)后原位復(fù)發(fā)患者的特異性血清生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組和非復(fù)發(fā)組之間共有9 個蛋白質(zhì)峰顯示出差異，從而對疾病復(fù)發(fā)起到監(jiān)測可能。

下一步的研究將是利用液相色譜?質(zhì)譜等二級質(zhì)譜方法鑒別出差異蛋白質(zhì)，最后進(jìn)行臨床驗證等。本研究樣本量偏小，需繼續(xù)收集，并結(jié)合患者臨床特征如HPV 感染、病理等進(jìn)行相應(yīng)分層分析［19-20］。

綜上所述，本研究采用SELDI?TOF 結(jié)合CM10芯片技術(shù)，得到了兩組不同的差異蛋白質(zhì)。第一組差異蛋白質(zhì)可作為區(qū)分宮頸鱗癌與正常人生物學(xué)指標(biāo)，在宮頸鱗癌和對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，同時兩組差異蛋白質(zhì)含量在宮頸鱗癌患者手術(shù)前后三個不同時期均有明顯不同，預(yù)測能作為宮頸鱗癌手術(shù)療效評價和術(shù)后病情監(jiān)測的指標(biāo)。