黃華，謝文東，谷雨，孟照琦，孫元潔，杜洪淼，孫婭娜，康帥,李萌云

(北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，北京，101300)

我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，果蔬作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，農(nóng)藥殘留的問題日益顯著。隨著農(nóng)藥殘留的檢測技術(shù)飛速發(fā)展，尤其是隨著液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)的成熟應(yīng)用，農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)不斷提升，過往的檢測存在速度慢、檢測單一、靈敏度低等缺點(diǎn)，高通量、高選擇性、高靈敏度成為新的發(fā)展方向，這就對(duì)樣品前處理提出了更高標(biāo)準(zhǔn)，以滿足檢測技術(shù)的要求。

目前常用于農(nóng)藥殘留前處理技術(shù)主要包括：液液萃取法[1-4]、固相萃取法[5-6]、薄層色譜法、QuEChERS[7-10]等樣品前處理凈化方法，其中QuEChERS方法速度快、通量大、效率高且成本低，能夠很好地與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)進(jìn)行融合，滿足高通量、高選擇性、高靈敏度的檢測技術(shù)要求。QuEChERS方法自提出以來經(jīng)歷了多年的優(yōu)化和改良，已被國內(nèi)外學(xué)者廣泛使用。QuEChERS方法主要利用MgSO4等鹽類對(duì)樣品進(jìn)行除水，乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine, PSA)、C18[11-16]、石墨化碳黑(graphitized carbon black, GCB)、Al2O3等填料進(jìn)行混合搭配，清除樣品中的雜質(zhì)。QuEChERS方法在使用過程對(duì)于極性化和非極性的化合物都有很好的回收率，適用范圍廣泛，方法操作過程中也可以使用內(nèi)標(biāo)法校正使準(zhǔn)確度和精密度得到提升，樣品前處理分析過程簡便、快速、溶劑消耗少且價(jià)格低廉。QuEChERS方法在提升樣品提取率的同時(shí)損失了凈化效果，樣品的凈化效果不如固相萃取法，對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)的凈化不徹底導(dǎo)致樣品基質(zhì)干擾問題嚴(yán)重。隨著近年來新型的凈化材料的出現(xiàn)，如多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotube，MWCNT)和磁珠材料，提升了復(fù)雜樣品基質(zhì)的凈化效果，其在農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸引起廣泛關(guān)注。碳納米材料表面經(jīng)過官能化的修飾，在表面鍵合特殊官能團(tuán)，大大增加對(duì)色素、脂肪酸等干擾物質(zhì)的選擇性。通過表面去活技術(shù)，控制了材料對(duì)藥物的過分吸附力，保證了敏感性農(nóng)藥的回收率。該材料比表面積大，具有典型的層狀中空結(jié)構(gòu)特征，增大了其比表面積，增加了材料的負(fù)載能力。

本文通過MWCNTs吸附劑與QuEChERS方法的有效融合，建立了MWCNTs分散固相萃取凈化技術(shù)，結(jié)合高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定果蔬中50種農(nóng)藥殘量的檢測方法，以期為食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測工作提供有效的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

UPLC-MS/MS-8050超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，日本島津；離心機(jī)，Sigma公司; Milli-Q 高純水發(fā)生器，美國 Millipore公司。

50種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于98%)，德國Dr.E公司;乙腈、甲醇、丙酮、乙酸銨，均為HPLC級(jí)，提取包(MgSO4+NaCl)、5種MWCNTs(純度>95%),天津博納艾杰爾公司。MWCNTs外徑、長度及比表面積見表1。

表1 5種MWCNTs的外徑、長度和批號(hào)Table 1 Difference specification of MWCNTs

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

稱取 10 mg (精確至0.1 mg) 標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL的棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容到刻度；對(duì)于部分不溶農(nóng)藥，可以選擇乙腈、丙酮等試劑輔助溶解?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)溶液的配制：移取適量的單標(biāo)儲(chǔ)備溶液，配制混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，所有標(biāo)準(zhǔn)溶液于-20 ℃避光保存。

1.3 樣品處理

稱取10.0 g果蔬樣品于50 mL離心管中，加入10.0 mL 1%乙酸乙腈溶液，迅速加入提取包(含有4.0 g MgSO4和1.5 g NaCl)，扣上蓋子用力搖勻，超聲波振蕩提取10 min，5 000 r/min離心5 min，取2.0 mL上清液于 IC-NANO(MWCNTs)凈化管中進(jìn)行凈化，收集流出液渦旋混勻，取1.0 mL流出液經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯濾膜過濾后，供UPLC-MS/MS測定。

1.4 色譜工作條件

色譜柱：Shim-pack XR-ODS Ⅲ (100 mm×2.0 mm×2.2 μm)；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.5 mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫條件：30%A→30%A(0.5 min)→95%A(6.0 min)→30%A(7.0 min)→30%A(8.0 min)；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

1.5 質(zhì)譜工作條件

電噴霧離子源(electrospray ionization，ESI)，接口電壓4 kV(ESI+)、2.8 kV(ESI-)；DL溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；接口溫度300 ℃；霧化氣流量3 L/min；加熱器流量10 L/min；干燥氣流量10 L/min；監(jiān)測模式多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)正、負(fù)離子掃描。50種農(nóng)藥殘留質(zhì)譜條件參數(shù)見表2。

表2 50種農(nóng)藥的化合物名稱、保留時(shí)間、質(zhì)荷比、 碰撞能量、掃描方式Table 2 MS parameters, retention times of the 50 pesticides

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將各農(nóng)藥分別配制成50 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。通過液相色譜直接注入質(zhì)譜儀，建立正、負(fù)兩種離子同時(shí)掃描模式，得到準(zhǔn)確的母離子，首選[M+H]+ 或[M-H]-利用質(zhì)譜儀自動(dòng)優(yōu)化功能，篩選二級(jí)碎片離子信息，獲得碎片離子及碰撞能量，并將母離子和 2個(gè)信號(hào)較強(qiáng)的子離子組成監(jiān)測離子對(duì)，以MRM模式進(jìn)行檢測。

2.1.2 流動(dòng)相條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-乙酸銨水溶液、作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)化合物分析結(jié)果的影響。乙腈-水作為流動(dòng)相與甲醇-水相比，可提高部分農(nóng)藥的質(zhì)譜信號(hào)，但殺螟丹、抗蚜威、阿維菌素等部分農(nóng)藥的質(zhì)譜響應(yīng)信號(hào)仍偏低。在乙腈-水中加入甲酸，可增加正離子的電離程度，但負(fù)離子的電離受到影響。在乙腈水溶液中加入乙酸銨，絕大部分農(nóng)藥的靈敏度均明顯提高，表明乙腈-乙酸銨水溶液更適合作流動(dòng)相。同時(shí)考察了不同濃度(0.5，1.0，5.0，10.0 nmol/L)的乙酸銨對(duì)檢測結(jié)果的影響。隨著乙酸銨濃度的增加，大部分農(nóng)藥的響應(yīng)值降低，形成了離子抑制。且高濃度的乙酸銨溶液會(huì)加速質(zhì)譜的污染，從而增加離子源的清洗頻次。因此，最終采用乙腈-0.5 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相響應(yīng)值最佳。50種農(nóng)藥總離子流色譜圖見圖1。

圖1 50種農(nóng)藥總離子流色譜圖Fig.1 TIC of 50 pesticides

2.1.3 提取溶劑的選擇

農(nóng)藥殘留分析中, 常用的提取溶劑包括乙腈、甲醇、二氯甲烷、正己烷、丙酮或有機(jī)溶劑添加一定比例的酸或堿等。本實(shí)驗(yàn)以回收率為指標(biāo)，選取回收率相對(duì)較差的咪鮮胺、稻瘟靈和肟菌酯3種化合物，分別考察了乙腈、甲醇、二氯甲烷、正己烷、丙酮等有機(jī)溶劑，對(duì)白菜、蘋果、紅心火龍果、韭菜空白基質(zhì)中加入0.010 mg/kg的3種混標(biāo)，進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)。如圖2所示，使用乙腈、甲醇、丙酮作為提取溶劑，目標(biāo)物回收率普遍高于用二氯甲烷和正己烷；但丙酮作為提取溶劑時(shí)，提取液中雜質(zhì)較多，因此，初步選定甲醇、乙腈作為提取溶劑。

圖2 不同基質(zhì)、不同溶劑的提取回收率統(tǒng)計(jì)(n=6)Fig.2 Effect of different extraction solvent,different sample on recovery (n=6)

2.1.4 混合提取溶劑的選擇

不同農(nóng)藥溶解性和極性相差較大，選擇的提取溶劑要與樣品和農(nóng)藥的性質(zhì)相符合,目標(biāo)農(nóng)藥在提取溶劑中要有足夠大的可溶性和穩(wěn)定性。使用單一溶劑提取不能完全兼顧所有待測農(nóng)藥的回收率，為兼顧多種農(nóng)藥同時(shí)檢測的需要，進(jìn)一步提高樣品提取率，對(duì)白菜、蘋果、紅心火龍果、韭菜空白基質(zhì)中加入回收率相對(duì)較差的咪鮮胺、稻瘟靈和肟菌酯3種化合物混標(biāo)0.010 mg/kg，進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)，分別考察了甲醇∶乙腈(1∶1、1∶2、2∶1)、1%乙酸甲醇、1%乙酸乙腈混合溶劑的提取效果(圖3)。

圖3 不同基質(zhì)、混合溶劑的提取回收率統(tǒng)計(jì)(n=6)Fig.3 Effect of different extraction, different sample solvent on recovery (n=6)

結(jié)果表明，使用1%乙酸乙腈作為提取溶劑，農(nóng)藥的回收率普遍偏高，并且雜質(zhì)干擾少，所以選定1%乙酸乙腈作為提取溶劑。

2.1.5 MWCNTs的種類和使用量

為考察MWCNTs的種類及用量，選用空白樣品，添加3種已知濃度有代表性農(nóng)藥目標(biāo)物,依據(jù)前述方法進(jìn)行樣品前處理,并在凈化階段依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案分別添加不同種類(5種MWCNTs)和用量(3,5,10,15和20 mg)MWCNTs凈化，LC-MS/MS檢測后計(jì)算獲得各目標(biāo)物加標(biāo)回收率，通過對(duì)比回收率來評(píng)判凈化效果，結(jié)果見圖4。通常情況下，多農(nóng)殘分析方法中各目標(biāo)物的平均回收率應(yīng)滿足的范圍是60%～120%。由圖4可以看出，在相同用量MWCNTs條件下，隨著MWCNTs外徑尺寸的增大，回收率遞增，說明整體凈化效果改善；在相同種類 MWCNTs條件下，隨著使用量的增加，盡管通過提取液顏色可以直觀判斷吸附效果增強(qiáng)，但回收率呈明顯降低趨勢，不能滿足檢測回收率要求。

圖4 不同MWCNTs種類和用量條件下目標(biāo)物 回收率統(tǒng)計(jì)(n=6)Fig.4 Effect of different amounts of different MWCNTs on recovery(n=6)

由于5種MWCNTs的主要區(qū)別在于外徑尺寸，外徑減小則比表面積增大，吸附力增強(qiáng)，但對(duì)基質(zhì)吸附增強(qiáng)的同時(shí)也會(huì)對(duì)目標(biāo)物產(chǎn)生吸附。同種MWCNTs使用量越大，吸附效果越強(qiáng)，也會(huì)在吸附除雜的同時(shí)造成目標(biāo)物損失。可見，以 MWCNTs作為吸附劑實(shí)現(xiàn)凈化功能時(shí)，并非比表面積越大越好，而是尺寸和用量要合適，控制吸附凈化作用以滿足實(shí)驗(yàn)需要。由圖4可知，選用MWCNTs5用量為3和5 mg時(shí)目標(biāo)物回收率均在60%～120%,但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),用量5 mg較3 mg的除雜效果更好。因此，確定凈化劑材料為 MWCNTs5，用量為5 mg。

2.1.6 MWCNTs與PSA結(jié)構(gòu)差異對(duì)凈化效果的比較

MWCNTs吸附劑材料管體由石墨組成具有較好的疏水性能、多孔結(jié)構(gòu)比表面積大、吸附性能強(qiáng)、耐高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等化學(xué)特性。它可以除去植物源性樣品中色素、甾醇、有機(jī)酸和酚類雜質(zhì)，常用于農(nóng)殘檢測分析中樣品的前處理，結(jié)構(gòu)見圖5。

圖5 MWCNTs結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Structure diagram of MWCNTs

而PSA是與氨基相似的吸附劑，其具有2個(gè)氨基，pKa值分別為10.1和10.9左右，比氨基柱具有更強(qiáng)的離子交換能力。同時(shí)PSA可與金屬離子產(chǎn)生鰲合作用，常用于提取金屬離子。它可以去除許多基質(zhì)類糖，脂肪酸和有機(jī)酸等雜質(zhì)，結(jié)構(gòu)圖見圖6。對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜且含有較多天然色素的樣品，進(jìn)行前處理凈化時(shí)MWCNTs更具有優(yōu)勢。

圖6 PSA結(jié)構(gòu)圖Fig.6 Structure diagram of PSA

為比較MWCNTs與PSA對(duì)果蔬樣品提取液的凈化效果，實(shí)驗(yàn)選用空白果蔬樣品依前述方法提取后分別使用MWCNTs(5 mg)和PSA(25 mg)凈化，并進(jìn)行LC-MS/MS檢測。比較二者的總離子流圖后發(fā)現(xiàn)，使用MWCNTs凈化可以獲得比PSA更好的凈化效果，結(jié)果見圖7～9。由于MWCNTs市售價(jià)格更為低廉，用量也僅為PSA的1/5，因而有效降低了成本。在本實(shí)驗(yàn)中，還與以PSA為凈化劑的傳統(tǒng)QuEChERS方法的定量限進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以MWCNTs作為吸附劑的方法定量限(limit of quantification,LOQ)可低至0.002 g/kg水平，在50種農(nóng)藥目標(biāo)物中，LOQ多數(shù)在0.002～0.010 mg/kg之間；傳統(tǒng)QuEChERS方法的最低LOQ為0.010 mg/kg，50種農(nóng)藥目標(biāo)物中，LOQ多數(shù)在0.010～0.050 mg/kg。顯然，MWCNTs比PSA有更加優(yōu)異的表現(xiàn)。這是由于MWCNTs具有納米級(jí)別的中空管狀結(jié)構(gòu)、大的比表面積和疏水的表面能強(qiáng)烈吸附某些重金屬離子和有機(jī)化合物，具有較強(qiáng)的吸附和去除色素的能力，因此目標(biāo)物的LOQ更低。

圖7 空白樣品的50種農(nóng)藥總離子流色譜圖Fig.7 Chromatograms of blank sample

圖8 50種農(nóng)藥總離子流色譜圖空白加標(biāo) 0.010 mg/kg使用PSA凈化Fig.8 Chromatograms of sample purified by PSA spiked at 0.010 mg/kg 50 pesticides

圖9 50種農(nóng)藥總離子流色譜圖空白加標(biāo)0.010 mg 使用MWCNTs凈化Fig.9 Chromatograms of sample purified by MWCNTs spiked at 0.010 mg/kg 50 pesticides

2.2 方法驗(yàn)證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限(limit of detection，LOD)

選擇與被測樣品性質(zhì)相同或相似的空白樣品按1.3方法進(jìn)行前處理，得到空白基質(zhì)溶液。精確吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級(jí)用空白基質(zhì)溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.000 5、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1 mg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，根據(jù)儀器性能和檢測需要選擇不少于5個(gè)濃度點(diǎn)供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。以農(nóng)藥定量用子離子的質(zhì)量色譜圖峰面積為縱坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。50種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和LOD見表3。

表3 50種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 3 Linear equations, correlation coefficients, LODs for 50 pesticides

續(xù)表3

2.2.2 方法的回收率和精密度

在蔬菜、水果樣品基質(zhì)中加入不同用量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行樣品前處理，得到信噪比為10∶1的每種化合物的樣品最低濃度，此添加量就是該種化合物的方法LOQ。分別取白菜、蘋果空白樣品，添加低、中、高3個(gè)不同添加量水平的50種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行前處理，測定目標(biāo)化合物。每個(gè)水平進(jìn)行6次實(shí)驗(yàn)，50種化合物的平均回收率為66.82%～105.91%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.07%～9.96%。以白菜、蘋果樣品為代表，50種化合物的添加量、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4。

表4 50種化合物的添加量、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Recoveries，relative standard deviations of 50 pesticides spiked in 4 kinds of samples(n=6)

續(xù)表4

續(xù)表4

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一套可同時(shí)測定蔬菜水果中50種高風(fēng)險(xiǎn)農(nóng)藥殘留量的檢測分析方法，采用MWCNTs結(jié)合QuEChERS的農(nóng)藥殘留樣品前處理方法，解決了多種農(nóng)藥殘留QuEChERS樣品前處理部分化合物回收率低及凈化效果差的問題。利用UPLC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行快速定性、定量分析檢測，解決了常規(guī)儀器分析方法靈敏度低、分離效果差、選擇性單一、抗干擾能力弱等技術(shù)難題。本方法能夠滿足各種不同的檢測需求，該方法快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確、適用的樣品基質(zhì)廣泛，尤其適合應(yīng)對(duì)食品安全突發(fā)事件應(yīng)急處置工作，可快速地確定農(nóng)藥殘留的檢測項(xiàng)目、發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)，進(jìn)行有針對(duì)性的檢測，為實(shí)現(xiàn)對(duì)市場的有效監(jiān)管提供技術(shù)支撐。