易琪昆，孫晨博，楊中光，王日，寇松姿，李朝霞，孫飛，

（1香港科技大學(xué)化學(xué)及生物工程學(xué)系，中國(guó)香港 000000；2深圳灣實(shí)驗(yàn)室粵港澳生物醫(yī)學(xué)創(chuàng)新中心，廣東 深圳 518000；3鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224000）

點(diǎn)擊化學(xué)的靈感源于自然界生物分子的合成，著眼于化學(xué)反應(yīng)的高效、選擇性與模塊化。自其問(wèn)世以來(lái)［1］，點(diǎn)擊化學(xué)，以銅催化的疊氮-炔基Husigen環(huán)加成反應(yīng)為代表，發(fā)展成為一系列近乎“理想”的化學(xué)反應(yīng)，開(kāi)辟了以碳-雜原子鍵（C-XC）合成為基礎(chǔ)的組合化學(xué)新方法，進(jìn)而簡(jiǎn)單高效地獲得了結(jié)構(gòu)的多樣性。點(diǎn)擊化學(xué)是顛覆性的［2］，重塑了材料學(xué)、生物學(xué)等諸多領(lǐng)域。然而，當(dāng)傳統(tǒng)的點(diǎn)擊化學(xué)應(yīng)用于復(fù)雜生物系統(tǒng)時(shí)，通常需要對(duì)生物分子進(jìn)行額外的化學(xué)修飾，以引入非天然官能團(tuán)，而這些修飾往往難以在敏感的生物分子或者復(fù)雜的生命體系中實(shí)現(xiàn)。此外，由于缺乏有效的理性設(shè)計(jì)與快速的篩選工具，在傳統(tǒng)的化學(xué)空間里尋找新的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)是極其困難的?？上驳氖?，得益于定向進(jìn)化與理性設(shè)計(jì)等蛋白質(zhì)工程的手段，研究者已經(jīng)能夠有效地探索生物分子（如天然氨基酸）序列空間，這為很多現(xiàn)實(shí)問(wèn)題提供了新答案、新工具、新方法，包括尋找新的點(diǎn)擊化學(xué)。應(yīng)用蛋白質(zhì)工程開(kāi)發(fā)新的化學(xué)反應(yīng)目前已在合成生物學(xué)中蔚然成風(fēng)。

近年來(lái)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌黏附素中異肽鍵的發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了一系列基于多肽/蛋白質(zhì)共價(jià)反應(yīng)對(duì)的發(fā)展［3］。迄今為止，這些新的反應(yīng)對(duì)包括第1代的pilin-C/isopeptag-C和pilin-N/isopeptag-N［4］，后來(lái)被廣泛應(yīng)用的諜化學(xué)［SpyTag/SpyCatcher，圖1（a）］及其正交版本SnoopTag/SnoopCatcher，優(yōu)化后的升級(jí)版本Spy002和Spy003［圖1（b）］［5-9］，非共價(jià)反應(yīng)的SpyDock可逆系統(tǒng)［圖1（c）］［10］，以及三組分的反應(yīng)體系SpyStapler/BDTag/SpyTag［圖1（d）］［11］。因其特異且極穩(wěn)定的結(jié)合能力，這些反應(yīng)對(duì)也被稱(chēng)為“細(xì)菌超能膠”（bacterial superglue）［12-20］。以諜化學(xué)為例，這類(lèi)蛋白質(zhì)化學(xué)的獨(dú)特之處在于該反應(yīng)集分子識(shí)別和自發(fā)的異肽鍵形成于一體，不僅具有傳統(tǒng)點(diǎn)擊化學(xué)的特征，包括快速的動(dòng)力學(xué)、高產(chǎn)率、等摩爾配比、模塊化、化學(xué)選擇性和單一反應(yīng)軌跡等，而且超越了其他常見(jiàn)的蛋白分子連接技術(shù)（如sortase、split intein等），能夠發(fā)生在蛋白分子的任意位點(diǎn)（N，C兩端或者中間），極大拓展了對(duì)蛋白分子的結(jié)構(gòu)控制［21-23］。更重要的是，諜化學(xué)的底物完全由天然氨基酸構(gòu)成，可實(shí)現(xiàn)基因編碼［21］。由此觀之，諜化學(xué)是一種近乎理想的蛋白質(zhì)-多肽反應(yīng)對(duì)，既有點(diǎn)擊化學(xué)的基本特征又可以在基因?qū)用孢M(jìn)行編碼。因此，諜化學(xué)是一種可基因編碼點(diǎn)擊化學(xué)（genetically encoded click chemistry，GECC）。

圖1 可基因編碼點(diǎn)擊化學(xué)（GECC）概覽（a）代表性的可基因編碼點(diǎn)擊化學(xué)——諜化學(xué)（SpyTag/SpyCatcher chemistry）。伴隨著SpyTag與SpyCatcher的特異性的分子識(shí)別與結(jié)合，天冬氨酸與賴(lài)氨酸的側(cè)鏈自發(fā)形成異肽鍵［5-7］。SpyTag/SpyCatcher復(fù)合物結(jié)構(gòu)的PDB編號(hào)為4MLI。（b）諜化學(xué)及其優(yōu)化版本（Spy002與Spy003）的二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)［8，9］。（c）無(wú)異肽鍵的SpyTag/SpyDock可逆反應(yīng)體系［10］。SpyDock為SpyCatcher-E77A突變體，失去了形成異肽鍵的能力。（d）三組分SpyStapler/SpyTag/BDTag反應(yīng)體系及其二級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)［11］Fig.1 Overview of genetically encoded click chemistry(GECC)(a)SpyChemistry(SpyTag/SpyCatcher Chemistry),a representative GECC.The side chains of aspartic acid and lysine spontaneously form isopeptide bond when SpyTag and SpyCatcher specifically recognize and react with each other[5-7].PDB ID of SpyTag/SpyCatcher complex:4MLI.(b)Second order reaction kinetic constants of SpyChemistry and its optimized systems(Spy002 and Spy003)[8-9].(c)Reversible SpyTag/SpyDock system without isopeptide bond[10].SpyDock is the E77A mutant of SpyCatcher,which loses the ability to form isopeptide bond.(d)Three-component SpyStapler/SpyTag/BDTag reaction system and its second order reaction kinetic constant[11].

伴隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，材料學(xué)科亦迎來(lái)了新機(jī)遇。作為合成生物學(xué)的一個(gè)新的分支，材料合成生物學(xué)有望從根本上改變?nèi)祟?lèi)對(duì)新材料的開(kāi)發(fā)與獲取方式。在此過(guò)程中，以GECC為代表的新的蛋白質(zhì)化學(xué)已經(jīng)并將持續(xù)為材料合成生物學(xué)提供有力的工具［11-12，19，24］。此文將著重闡述GECC在材料合成生物學(xué)中的已知應(yīng)用，并探討可能的新發(fā)展。

1 可基因編碼點(diǎn)擊化學(xué)與蛋白質(zhì)拓?fù)涔こ?/h2>

與傳統(tǒng)化學(xué)合成相比，大分子的生物合成有如下優(yōu)勢(shì)：①能夠?qū)Υ蠓肿拥某叽?、序列及立體化學(xué)實(shí)現(xiàn)精確控制；②可利用自然進(jìn)化的成果，引入天然的蛋白質(zhì)序列，實(shí)現(xiàn)生物功能；③可借助定向進(jìn)化等手段進(jìn)行優(yōu)化。然而生物合成并不完美：從拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上看，中心法則中的3類(lèi)生物大分子DNA、RNA與蛋白質(zhì)多是線性大分子。雖然很多RNA與蛋白質(zhì)可通過(guò)折疊形成三維結(jié)構(gòu)，但本質(zhì)上仍為線性大分子。學(xué)術(shù)界面臨的一個(gè)根本問(wèn)題便是：能否利用生物體系精確地合成非線性的大分子？若能實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，便有望拓展蛋白質(zhì)工程，發(fā)展新的生物材料，并為生物學(xué)研究提供新的思路。

天然蛋白質(zhì)多為線性分子，即氨基酸從N端到C端依次通過(guò)肽鍵連接起來(lái)，而不會(huì)產(chǎn)生分支、閉環(huán)甚至更高等級(jí)的復(fù)雜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。但自然進(jìn)化仍然產(chǎn)生了少量具有非線性結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子，比如環(huán)形的細(xì)菌素AS-48和防御素RTD-1、打結(jié)型的甲基轉(zhuǎn)移酶YbeA和泛素羧基末端水解酶UCH-L3、索烴型的二硫化碳水解酶、嗜氣桿菌檸檬酸合成酶等等［25-30］。這些拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)于蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、蛋白酶抗性、機(jī)械穩(wěn)定性等具有重要的意義，因此，通過(guò)拓?fù)涔こ谈淖兊鞍踪|(zhì)性質(zhì)逐漸成為蛋白質(zhì)工程的一個(gè)新的維度。

一直以來(lái)，蛋白質(zhì)拓?fù)涔こ桃蕾?lài)于有限的幾種工具，包括內(nèi)含肽、轉(zhuǎn)肽酶以及蝶豆黏酶等［31-33］。但是這些工具能夠?qū)崿F(xiàn)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)極其有限，且轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)速率不高，這大大限制了蛋白質(zhì)拓?fù)涔こ痰膽?yīng)用范圍。GECC作為一種模塊化的快速蛋白質(zhì)偶聯(lián)方法，亦可作為蛋白質(zhì)拓?fù)涔こ痰墓ぞ?。近年?lái)，通過(guò)GECC構(gòu)建具有高級(jí)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的研究層出不窮。例如將SpyTag和SpyCatcher對(duì)應(yīng)的基因插入到彈性蛋白ELP（elastin-like polypeptide）的基因中，構(gòu)建了多種非線性的蛋白分子，包括分支狀、H型、環(huán)型、蝌蚪型等多種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（圖2）［34］。Zhang等［21］在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步插入了能夠相互交叉形成二聚體的p53結(jié)構(gòu)域，令大腸桿菌表達(dá)SpyTagp53-SpyCatcher重組蛋白并在細(xì)胞內(nèi)互相反應(yīng)，高產(chǎn)率地得到多種具有不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)索烴。

圖2 蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的控制Fig.2 Controlling the protein topological structures

在構(gòu)建多種復(fù)雜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，蛋白質(zhì)拓?fù)涔こ棠軌蜻M(jìn)一步優(yōu)化蛋白質(zhì)功能。Howarth等［35］將SpyTag和SpyCatcher分別放置于β-內(nèi)酰胺酶的N端和C端，通過(guò)控制蛋白的表達(dá)條件可以直接獲得環(huán)化的β-內(nèi)酰胺酶。經(jīng)過(guò)環(huán)化，在酶活性幾乎不發(fā)生改變的同時(shí)，β-內(nèi)酰胺酶能夠耐受100℃的高溫，相較于野生型的37℃有了顯著提升。對(duì)于二氫葉酸還原酶、苯丙氨酸脫氫酶、海藻糖合成酶等，SpyTag/SpyCatcher介導(dǎo)的環(huán)化有相似的效果［35-37］。除了熱穩(wěn)定性，這種環(huán)化策略對(duì)于蛋白的化學(xué)穩(wěn)定性、蛋白酶抗性等亦有顯著提升。在SpyTag/SpyCatcher和p53介導(dǎo)的蛋白索烴的構(gòu)建中，研究人員在基因中插入了二氫葉酸還原酶，使得生成的索烴相套兩環(huán)中各有一個(gè)。這樣的構(gòu)造使得酶熔化溫度提升了4℃，并將催化效率提升了27%，顯著高于線性酶和環(huán)化酶，證明了索烴結(jié)構(gòu)對(duì)于酶學(xué)性質(zhì)的重要影響［12］。利用相似的策略，Zheng等［38］將工業(yè)用耐熱γ-lactamase的活性提高了1.8～2.4倍，說(shuō)明該技術(shù)具有很強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。

綜上所述，利用GECC技術(shù)，不僅能夠方便快捷地創(chuàng)造非天然拓?fù)湫问降墓δ艿鞍?，還能借此調(diào)節(jié)分子的性質(zhì)，優(yōu)化其功能?？梢?jiàn)，隨著GECC工具包的拓展，對(duì)于蛋白質(zhì)多樣化拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的構(gòu)造與性質(zhì)研究亦會(huì)獲得明顯助益。

2 可基因編碼點(diǎn)擊化學(xué)與全蛋白水凝膠材料

水凝膠是具有極高含水量的親水聚合物分子網(wǎng)絡(luò)，其存在由聚合物鏈之間的交聯(lián)作用與分子網(wǎng)絡(luò)在溶液中的溶解過(guò)程所達(dá)成的微妙平衡所維持［39-40］。由于可高度模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的生物物理特性，水凝膠被視為生物大分子和干細(xì)胞的理想載體，有著諸多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括組織工程、干細(xì)胞療法和藥物遞送等，極具發(fā)展前景［41-43］。

化學(xué)合成的水凝膠材料雖然易得，但是受限于生物活性的匱乏［43-44］。利用蛋白質(zhì)來(lái)構(gòu)建具有生物活性的水凝膠有望將生物分子多樣性、生物活性與可工程優(yōu)化（定向進(jìn)化）等優(yōu)勢(shì)充分整合到聚合物學(xué)科中［45］。蛋白質(zhì)的性質(zhì)（包括其高級(jí)結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和生物功能）基本由其氨基酸序列決定，因而利用蛋白質(zhì)構(gòu)建的水凝膠材料可通過(guò)基因編碼實(shí)現(xiàn)對(duì)其生化和機(jī)械性能的調(diào)控，這一優(yōu)勢(shì)令全蛋白水凝膠相較大多數(shù)天然和合成生物材料更具有吸引力［46］。

可基因編碼點(diǎn)擊化學(xué)（GECC）無(wú)須借助任何化學(xué)修飾力量，便可在溫和條件下實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的共價(jià)組裝，進(jìn)而形成穩(wěn)定的分子網(wǎng)絡(luò)?；贕ECC的共價(jià)組裝技術(shù)相較于其他基于分子的物理相互作用或者酶促反應(yīng)構(gòu)建的蛋白水凝膠具有更加穩(wěn)定高效的優(yōu)勢(shì)［33，47］。利用GECC設(shè)計(jì)蛋白網(wǎng)絡(luò)可以通過(guò)基因編碼引入各種天然甚至“從頭設(shè)計(jì)”（de novodesign）的功能蛋白或多肽序列［48］，從而實(shí)現(xiàn)了將功能從分子層面到宏觀材料層面的無(wú)損轉(zhuǎn)移［49-56］。

作為蛋白質(zhì)拓?fù)涔こ痰囊粋€(gè)延伸性應(yīng)用，Sun等利用GECC合成了具有生物活性的全蛋白分子網(wǎng)絡(luò)——“諜網(wǎng)絡(luò)”（spy network）［圖3（a）］［49］，并以此為靈感進(jìn)一步構(gòu)建了各類(lèi)智能響應(yīng)的全蛋白質(zhì)水凝膠材料［52］。

圖3 利用GECC構(gòu)建全蛋白水凝膠材料LIF—白血病抑制因子；A-LIF-A—SpyTag-ELP-LIF-ELP-SpyTagFig.3 Development of entirely protein-based hydrogels based on GECC(Adapted from Ref.49 with permission from National Academy of Sciences,copyright 2014.)LIF—Leukemia inhibitory factor;A-LIF-A—SpyTag-ELP-LIF-LEP-SpyTag

“諜網(wǎng)絡(luò)”由含有多個(gè)GECC反應(yīng)基團(tuán)的重組蛋 白 如SpyTag-ELP-SpyTag-ELP-SpyTag（AAA）和SpyCatcher-ELP-SpyCatcher（BB）自組裝形成，并且可以通過(guò)基因工程引入各種具有生物活性的蛋白序列，包括細(xì)胞結(jié)合配體Arg-Gly-Asp（RGD），幫助細(xì)胞進(jìn)行對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）重塑的金屬蛋白酶（MMP）識(shí)別位點(diǎn)，以及用于維持干細(xì)胞多能性（pluripotency）的白血病抑制因子（LIF）。Gao等［56］利用相似的原理將一種球狀蛋白（GB1）共價(jià)交聯(lián)成分子網(wǎng)絡(luò)，獲得了具有高機(jī)械強(qiáng)度的生物相容的水凝膠材料，并用于細(xì)胞的3D培養(yǎng)。

GECC還被用于構(gòu)建智能水凝膠。Wang等［52］利用諜化學(xué)組裝光響應(yīng)蛋白CarHC，構(gòu)建了一類(lèi)依賴(lài)B12的光響應(yīng)全蛋白水凝膠［圖4（a）］。CarH是細(xì)菌內(nèi)控制類(lèi)胡蘿卜素合成的光敏轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其C端結(jié)構(gòu)域（CarHC）在黑暗條件下與AdoB12結(jié)合并形成四聚體，在綠光下隨著AdoB12的光解而分解成單體［57-59］。通過(guò)重組蛋白質(zhì)SpyTag-ELPCarHC-ELP-SpyTag（ACA）和SpyCatcher-ELP-CarHCELP-SpyCatcher（BCB）的等當(dāng)量混合所得的線性聚合物（溶液），能夠在AdoB12誘導(dǎo)下快速組裝形成水凝膠（固體），實(shí)現(xiàn)液固相變；在光照下，CarHC四聚體解離，繼而經(jīng)歷快速的固液相變［52］。Luo等［60-61］則利用了生物體系中普遍存在的鈣調(diào)蛋白（CaM）與其結(jié)合肽（M13）構(gòu)建鈣離子響應(yīng)的蛋白質(zhì)水凝膠。在CaM、Ca2+的誘導(dǎo)下，從富含helix的閉合結(jié)構(gòu)變?yōu)閱♀彔罱Y(jié)構(gòu)，進(jìn)而與其配體M13結(jié)合［62］。受此啟發(fā)，該研究利用 諜化學(xué)將CaM/M13直接組裝成了聚合物，成功構(gòu)建了Ca2+依賴(lài)、具有可控黏彈性（viscoelasticity）和應(yīng)力松弛行為（stress relaxation）的動(dòng)態(tài)水凝膠。Yang等［55］則利用綠色熒光蛋白裂分片段（splitGFP）的自主重構(gòu)直接在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)合成了一種四臂星狀蛋白——（SpyCatcher）4GFP。這一星狀蛋白可通過(guò)諜化學(xué)進(jìn)一步共價(jià)組裝成具有規(guī)整空間結(jié)構(gòu)的分子網(wǎng)絡(luò)。

圖4 利用GECC制備“智能”光響應(yīng)水凝膠（a）利用諜化學(xué)將CarHc組裝成線性聚合物，后者在黑暗條件下經(jīng)歷AdoB12誘導(dǎo)的液固相變與光誘導(dǎo)的固液相變。（b）光誘導(dǎo)的細(xì)胞釋放。3T3—成纖維細(xì)胞；hMSCs—人間充質(zhì)干細(xì)胞。Fig.4 Development of smart photo-responsive hydrogel based on GECC Adapted from Ref.52 with permission from National Academy of Sciences,copyright 2017.(a)Constructing CarHc into linear polymer utilizing SpyChemistry,which can undergo liquid-to-solid phase transition induced by AdoB12,and solid-to-liquid phase transition induced by light.(b)Photo-induced release of 3T3 cells or hMSCs.

由于在可基因編碼性（genetic programmability）和生物功能化（biofunctionalization）方面的優(yōu)勢(shì)，上述基于GECC的全蛋白水凝膠在細(xì)胞三維培養(yǎng)和組織工程等領(lǐng)域中有巨大的應(yīng)用前景。上文提到的Spy network水凝膠，經(jīng)過(guò)白血病抑制因子（LIF）修飾后，可用于小鼠胚胎干細(xì)胞（mESC）的三維培養(yǎng)并且能夠維持其多能性［圖3（b）］［49］?？蒲腥藛T也利用GECC以成膠后修飾的方式將LIF整合到全蛋白水凝膠中，后者作為激活JAK/STAT3通路的關(guān)鍵細(xì)胞因子，可以促進(jìn)神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)［53，63］。

目前面臨細(xì)胞三維培養(yǎng)的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)便是如何從培養(yǎng)基質(zhì)中回收并傳代細(xì)胞。盡管不少水凝膠都可以用于細(xì)胞三維培養(yǎng)，卻無(wú)法實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的有效釋放與回收。Wang等［52］合成的CarHC水凝膠在B12的誘導(dǎo)下可以完成快速的液固相變，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)3T3成纖維細(xì)胞和人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）的三維封裝；在三維培養(yǎng)之后，這些水凝膠可在白光或綠光照射下迅速液化，釋放這些細(xì)胞，而且釋放后的細(xì)胞擁有良好的存活率［圖4（b）］。該體系是為數(shù)不多的能夠?qū)崿F(xiàn)多代細(xì)胞三維培養(yǎng)及無(wú)害轉(zhuǎn)移的體系。

具有可控藥物遞送能力的水凝膠，尤其是由具有高時(shí)空精度和低侵害特性的光響應(yīng)水凝膠，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有較高需求［63-64］。Yang等［55］利用GECC合成了四臂星狀蛋白（CarHC）4GFP，后者所具備的可控相變行為，包括AdoB12誘導(dǎo)的液固相變和光誘導(dǎo)的固液相變，被用于生物被膜降解酶PslG的封裝和光控釋放。該體系可以有效抑制細(xì)菌生物被膜的形成，有望用來(lái)對(duì)抗由多重耐藥細(xì)菌病原體引起的慢性感染。Jiang等［65］以CarHC為基元設(shè)計(jì)了另外一種可注射的光響應(yīng)全蛋白水凝膠。研究者利用金屬離子（Zn2+/His6-tag的配位以及AdoB12誘導(dǎo)的CarHC四聚這兩種反應(yīng)機(jī)理構(gòu)建水凝膠網(wǎng)絡(luò)。該體系兼具了可注射（源自物理交聯(lián)）與光響應(yīng)（源自CarHC）這兩個(gè)主要特性。該體系，作為L(zhǎng)IF的載體，被注射到小鼠視神經(jīng)的缺損位置，可以長(zhǎng)期激活JAK/STAT3信號(hào)傳導(dǎo)，并增強(qiáng)軸突再生，驗(yàn)證了其在藥物遞送和神經(jīng)再生等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。

由于其優(yōu)異的止血與傷口閉合效果，防水生物黏合劑被視為外科手術(shù)中傳統(tǒng)縫合線和縫合釘?shù)睦硐胩娲罚?6-67］。常用的生物黏合劑如合成聚合物（例如聚氰基丙烯酸酯［68］和PEG［67］）或生物大分子（例如纖維蛋白［69］、明膠［70］或多糖［71］）具有降解性差、毒性高、引起炎癥和組織壞死可能性高等風(fēng)險(xiǎn)。具有高生物相容性的防水蛋白黏合劑原則上可以規(guī)避這些缺陷。自然界的貽貝足蛋白（Mfp）是海洋貽貝（Mytilus edulis）實(shí)現(xiàn)水下黏附的主要原因，其分子機(jī)制啟發(fā)了眾多涂層和黏合劑材料的開(kāi)發(fā)［72-73］。Sun課題組利用重組抗生素鏈霉菌酪氨酸酶（Streptomyces antibioticustyrosinase）［74］對(duì)重組貽貝足蛋白Mfp3或者具有Mfp序列特征的多肽進(jìn)行氧化修飾，進(jìn)而合成了具有水下黏合能力的全蛋白水凝膠［75-76］。這些材料具有強(qiáng)防水黏合和高細(xì)胞相容性的特點(diǎn)，同時(shí)這些材料含有SpyTag或SpyCatcher等反應(yīng)基元，因此可以通過(guò)GECC以成膠后修飾的形式將具有生物活性的蛋白分子整合到材料之中。

蛋白質(zhì)材料也為能源與環(huán)境問(wèn)題的解決提供了新的思路。在這個(gè)亟需替代能源的時(shí)代，核裂變?cè)诳深A(yù)見(jiàn)的將來(lái)依然是低碳能源的主要來(lái)源。迄今為止，幾乎所有的鈾燃料都來(lái)自陸地開(kāi)采。然而陸地鈾礦儲(chǔ)量有限，并非取之不盡，而且當(dāng)前的采礦工藝對(duì)環(huán)境的破壞巨大。另一方面，海洋中的鈾儲(chǔ)量巨大，為陸地儲(chǔ)量的1000倍。但海水鈾（UO2+2）的絕對(duì)濃度極低（約14 nmol/L），加上海水中大量的鈣鎂及碳酸根離子，使得大規(guī)模低成本提取海水鈾的設(shè)想依舊停留在理論或小規(guī)模的試驗(yàn)階段［77］。自然進(jìn)化與蛋白質(zhì)工程技術(shù)已經(jīng)提供了各類(lèi)特異的金屬離子結(jié)合蛋白，但是這些蛋白的應(yīng)用常常受限于穩(wěn)定性差、成本高、可擴(kuò)展性差等缺點(diǎn)［78］。將這些蛋白組裝成宏觀材料可以提高蛋白分子的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)重復(fù)使用，進(jìn)而降低成本。Kou等［51］利用GECC將重組超級(jí)鈾酰結(jié)合蛋白（SUP）——一種對(duì)鈾具有飛摩爾級(jí)別結(jié)合能力的金屬蛋白——及其優(yōu)化的突變體SUP-E64D［79］共價(jià)組裝成全蛋白水凝膠材料，并利用微流體裝置制造了單分散的SUP水凝膠微珠，成功從海水中提取UO2+2（圖5）。類(lèi)似的分離技術(shù)也可以擴(kuò)展至重金屬離子的去除等其他環(huán)境問(wèn)題［80］。Kou等［51］將鉬酸鹽/鉻酸鹽結(jié)合蛋白ModA共價(jià)組裝成分子網(wǎng)絡(luò)，用于去除自來(lái)水中的污染物之一——鉻酸鹽。

圖5 利用GECC合成重金屬結(jié)合蛋白水凝膠（a）超級(jí)鈾酰吸附蛋白材料與鉻酸根吸附蛋白材料的合成。（b）SUP水凝膠與擁有更強(qiáng)鈾酰結(jié)合能力的突變體SUP（E64D）水凝膠從天然海水中富集鈾元素。富集指數(shù)是指富集后蛋白材料中鈾的濃度與水體中鈾的濃度的比值。（c）ModA水凝膠去除自來(lái)水樣品中的鉻酸鹽。去除比例是指吸附后水體中鉻酸鹽的減少比例。去除效率是指蛋白材料吸附鉻酸鹽的實(shí)際質(zhì)量與理論上最大可能質(zhì)量的比例Fig.5 Applying GECC to develop heavy-metal binding protein hydrogel Adapted from Ref.51 with permission from The Royal Society of Chemistry,copyright 2017.(a)Synthesis of super uranyl-binding protein(SUP)materials and chromate-binding protein materials.(b)Uranium extraction from seawater using the hydrogels comprising SUP or its mutant,SUP-E64D,which exhibits stronger uranyl binding.Enrichment index was calculated as the ratio of uranium concentration in protien material to that in water body after enrichment.(c)Removal of chromate from tap water using ModA hydrogels.Removal percentage was calculated as the reduced percentage of chromate in water body after removal.Removal efficiency was calculated as the ratio of the actual amount of chromate absorbed by the material to the theoretical maximum by the material.

3 可基因編碼點(diǎn)擊化學(xué)與合成疫苗

疫苗依賴(lài)于機(jī)體的免疫系統(tǒng)來(lái)識(shí)別外源蛋白從而產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并通過(guò)產(chǎn)生獲得性免疫來(lái)抵御真正病原體的入侵。100多年來(lái)，疫苗的誕生已經(jīng)拯救了無(wú)數(shù)生命。但是傳統(tǒng)的滅活或者減毒活疫苗在生物安全性上依舊不夠完美，而且其研發(fā)與生產(chǎn)工藝較為緩慢。隨著氣候變化、生態(tài)變遷、人口增長(zhǎng)，人類(lèi)面臨越來(lái)越多的大流行疾病的威脅。考慮到病原體的進(jìn)化速度之快，人類(lèi)必須能夠迅速開(kāi)發(fā)出更加高效安全的新型疫苗。相比于傳統(tǒng)的滅活或者減毒活疫苗，由高度純化的抗原蛋白基元合成的現(xiàn)代疫苗更加安全，但是其誘導(dǎo)保護(hù)性免疫的效果較低［81-82］。為了提高合成疫苗的保護(hù)效果，研究者致力于發(fā)展相對(duì)安全的類(lèi)病毒顆粒（virus-like particle，VLP），后者表面可以有效結(jié)合并有序展示相應(yīng)的抗原，以模擬病原體、提高免疫原性［83-84］。一些病毒或非病毒來(lái)源的天然蛋白或者人工設(shè)計(jì)的蛋白分子可自組裝成納米顆粒，且具有高度對(duì)稱(chēng)性與穩(wěn)定性，直徑為10～150 nm，適合作為類(lèi)病毒疫苗載體［18］。而如何在這些納米顆粒表面以可控且可靠的方式連接抗原蛋白便成了一大技術(shù)難點(diǎn)。利用傳統(tǒng)重組DNA技術(shù)直接合成融合蛋白可能會(huì)影響抗原蛋白的折疊或者VLP有效組裝［85］。另一種途徑便是以天然的或工程化的蛋白質(zhì)納米顆粒作為支架，將異源表達(dá)的抗原通過(guò)GECC等蛋白共價(jià)組裝技術(shù)添加到蛋白質(zhì)納米顆粒上。這種模塊化的策略可作為一個(gè)強(qiáng)大的合成疫苗“工具包”，實(shí)現(xiàn)含有多種單抗原甚至組合抗原的VLP的設(shè)計(jì)與合成。

首先針對(duì)瘧疾的疫苗研發(fā)，Brune等［86］利用大腸桿菌表達(dá)了一類(lèi)重組噬菌體蛋白，后者可自組裝形成類(lèi)病毒顆粒（VLP）。研究者進(jìn)一步利用諜化學(xué)將瘧疾抗原蛋白共價(jià)連接到VLP表面，并證明了這些修飾后的類(lèi)病毒顆粒經(jīng)一次注射后便可以有效誘導(dǎo)小鼠的抗體響應(yīng)，顯示了這種簡(jiǎn)單、高效、模塊化的疫苗合成策略的可行性［87-90］。Brune等［91］還同時(shí)利用兩種正交的GECC反應(yīng)對(duì)SpyTag/SpyCatcher和SnoopTag/SnoopCatcher將 多抗原與VLP進(jìn)行連接。同時(shí)展示兩種瘧疾抗原Pfs25和Pfs2可以增強(qiáng)小鼠體內(nèi)抗體響應(yīng)，效果好于單一抗原體系。這種基于GECC的多抗原展示平臺(tái)有望為抗擊瘧疾和其他傳染性疾病提供有力武器［圖6（a）］。最近，純理性設(shè)計(jì)的基于Mi3的多孔十二面體蛋白質(zhì)納米顆粒［92］也被應(yīng)用于合成疫苗的設(shè)計(jì)，Brune等將SpyCatcher展示于納米顆粒表面，并通過(guò)諜化學(xué)與抗原蛋白連接［圖6（b）］，結(jié)果證實(shí)該種完全計(jì)算設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)納米顆粒疫苗亦能引起較強(qiáng)的抗體響應(yīng)。計(jì)算設(shè)計(jì)出的形成納米籠的蛋白（包括Mi3）通常在組成、結(jié)構(gòu)和折疊方式方面會(huì)有所不同，繼而會(huì)影響其表面所展示抗原的空間位置、方向與數(shù)量，而這些因素會(huì)共同影響合成疫苗的免疫原性，因此疫苗的設(shè)計(jì)與優(yōu)化需要考慮這些因素［93］。

圖6 GECC在重組蛋白質(zhì)疫苗中的應(yīng)用Fig.6 Application of GECC in recombinant protein vaccines Adapted from Ref.91,92 and 98 with permissions.

利用腫瘤新生抗原發(fā)展個(gè)體化治療性疫苗是腫瘤免疫療法的重要方向之一。而相關(guān)疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵在于快速鑒別獲取新抗原并實(shí)現(xiàn)在疫苗顆粒表面的有效展示。Wang等［94］利用鐵蛋白（ferritin）納米顆粒來(lái)作為腫瘤抗原的載體，其表面通過(guò)GECC得以展示特異性腫瘤抗原。修飾后的鐵蛋白納米顆?？裳杆俦涣馨徒Y(jié)并靶向樹(shù)突狀細(xì)胞識(shí)別，進(jìn)而產(chǎn)生特異的免疫T細(xì)胞響應(yīng)。該成果展示了基于GECC的合成疫苗平臺(tái)在個(gè)性化腫瘤免疫療法這一領(lǐng)域的巨大潛力。

始于2019年末的新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）已造成席卷全球的疫情大流行，各類(lèi)疫苗包括全蛋白的合成疫苗已成為人類(lèi)應(yīng)對(duì)這場(chǎng)公共健康危機(jī)的有力武器。目前已有不少基于GECC的新冠疫苗的設(shè)計(jì)與研究，在此做一些簡(jiǎn)單的總結(jié)。

利用GECC可以實(shí)現(xiàn)快速多樣的疫苗設(shè)計(jì)與合成，以應(yīng)對(duì)SARS-CoV2的不斷突變。天然的二氧四氫蝶啶合酶（lumazine synthase，LuS）和鐵蛋白ferritin可分別自組裝成60聚體和24聚體的納米顆粒［95］，Zhang等利用此特點(diǎn)，構(gòu)建了帶有SpyTag的LuS和ferritin納米顆粒。這些納米顆粒進(jìn)一步與融合了SpyCatcher的SARS-CoV-2抗原——刺突糖蛋白受體結(jié)合區(qū)域（spike glycoprotein RBD）——共價(jià)結(jié)合。最終生成的全蛋白合成疫苗在體內(nèi)能夠引起非常強(qiáng)的中和抗體反應(yīng)，為對(duì)照組（未經(jīng)修飾的S蛋白）的約25倍。Kang等［96］則利用諜化學(xué)同時(shí)構(gòu)建了3類(lèi)蛋白質(zhì)納米顆粒候選疫苗，包括RBD-ferritin（24聚體）、RBD-Mi3（60聚體）和RBD-I53-50（120聚體）。研究結(jié)果顯示所得這些設(shè)計(jì)在小鼠體內(nèi)引起的中和抗體活性比單體RBD高8～120倍，而且所產(chǎn)生的小鼠血清在體外能有效阻斷RBD與人體細(xì)胞表面受體ACE2的結(jié)合。Ma等［97］開(kāi)發(fā)了另一類(lèi)合成疫苗。他們通過(guò)諜化學(xué)將SARS-CoV-2的受體結(jié)合區(qū)域（RBD）和七肽重復(fù)區(qū)（HR）連接到了鐵蛋白納米顆粒上。接種此疫苗后，感染了SARS-CoV-2的轉(zhuǎn)基因小鼠的肺部病毒載量顯著降低。整合了RBD或RBD-HR的疫苗在小鼠上同時(shí)引起了中和抗體響應(yīng)與較強(qiáng)的T細(xì)胞免疫響應(yīng)。RBD-HR疫苗更是引起了針對(duì)其他冠狀病毒的交叉免疫響應(yīng)?；诤愫雍锏幕铙w實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)此種疫苗產(chǎn)生持續(xù)（3個(gè)月以上）免疫響應(yīng)的能力（包括中和抗體響應(yīng)與T細(xì)胞響應(yīng)等）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了GECC是實(shí)現(xiàn)快速多樣的構(gòu)建疫苗的有效工具。除了當(dāng)前的SARSCoV2，自然界冠狀病毒的種類(lèi)紛繁，宿主多樣，因而人類(lèi)必將持續(xù)面對(duì)這類(lèi)病毒的威脅。理想的疫苗應(yīng)當(dāng)能夠保護(hù)人體免于多種冠狀病毒的侵染。Cohen等［98］利用GECC將多種冠狀病毒（包括SARS-CoV-2和一些寄生于動(dòng)物的β-冠狀病毒）的RBD連接到Mi3蛋白納米顆粒上，構(gòu)建了原則上可以針對(duì)數(shù)種冠狀病毒的普適疫苗。這類(lèi)多抗原的組合疫苗在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體響應(yīng)可識(shí)別多種異源RBD，中和抗體效應(yīng)也有所增強(qiáng)。該方法表明這種含多抗原的組合體合成疫苗策略有望應(yīng)對(duì)現(xiàn)有的和潛在的冠狀病毒對(duì)公共健康的威脅［圖6（c）］。值得注意的是，該課題組［99］用類(lèi)似的方法將8種來(lái)自流感病毒的血球凝集素蛋白（hemagglutinin，HA）整合到疫苗顆粒表面，所產(chǎn)生的多抗原組合體相較于同抗原納米顆粒的混合物并不能更有效地引起免疫反應(yīng)，這結(jié)果表明多抗原組合體疫苗的設(shè)計(jì)策略的普適性還需進(jìn)一步提高。

新冠疫情的全球蔓延為疫苗的貯存運(yùn)輸分配帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)，尤其是在發(fā)展中國(guó)家、基礎(chǔ)設(shè)施薄弱及偏遠(yuǎn)地區(qū)，這對(duì)疫苗的穩(wěn)定性及可靠度提出了新的要求。Tan等［100-101］利用了第3代諜化學(xué)Spy003在Mi3蛋白納米顆粒表面實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同對(duì)稱(chēng)性的抗原（包括S蛋白R(shí)BD）的展示。所產(chǎn)生的蛋白納米顆粒顯示了更特異的免疫原性，而且耐高溫、抗凍，有望在實(shí)際應(yīng)用中可減少對(duì)冷鏈的依賴(lài)。

4 可基因編碼點(diǎn)擊化學(xué)與工程活體材料

自然界中的生命體能夠通過(guò)基因編碼的方式發(fā)展出多種不同尺度、不同功能的生物復(fù)合材料，例如木質(zhì)纖維、貝殼、肌肉組織，這類(lèi)材料能幫助生命體適應(yīng)外部環(huán)境的變化，并對(duì)外界刺激做出響應(yīng)，同時(shí)往往還具有自我修復(fù)的能力。受此啟發(fā)，“工程活體材料”（engineered living material，ELM）這一概念被提出，并在近年有了廣泛的研究發(fā)展。在工程活體材料中，活體細(xì)胞（如細(xì)菌、真菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞）作為主體，通過(guò)產(chǎn)生不同類(lèi)型的生物大分子聚合物（如蛋白質(zhì)、纖維素），或者通過(guò)與外加的高分子、微?；蚱渌羌芊磻?yīng)，自組裝形成更大規(guī)模的材料［102-105］。相較于傳統(tǒng)材料，工程活體材料不僅能人為機(jī)械控制其組裝過(guò)程和材料的拓?fù)湫螒B(tài)，還能通過(guò)活體細(xì)胞基因表達(dá)這一高穩(wěn)健性的方式進(jìn)行自我調(diào)節(jié)；同樣的通過(guò)基因編輯的方式，工程活體材料能對(duì)特定的外界刺激進(jìn)行動(dòng)態(tài)響應(yīng)，或表現(xiàn)出特定的生物功能；活體細(xì)胞的存在也給予了工程活體材料自我修復(fù)、自我生長(zhǎng)的特性［圖7（a）］［102，106］?；谶@些特點(diǎn)，工程活體材料在生物傳感、生物催化、藥物釋放等領(lǐng)域均有建樹(shù)［107-109］。

GECC因其高共價(jià)鍵強(qiáng)度、高效率、高度特異性，在工程活體材料的發(fā)展中被廣泛運(yùn)用。大腸桿菌curli生物被膜是一種常見(jiàn)的工程活體材料，主要通過(guò)基因工程使大腸桿菌分泌淀粉樣蛋白CsgA，并以此為基元互相連接形成，一般通過(guò)對(duì)CsgA蛋白的修飾來(lái)改變材料的性能。然而，研究表明CsgA蛋白與大于260個(gè)氨基酸的蛋白融合表達(dá)會(huì)嚴(yán)重影響生物被膜的形成［110］。Joshi等［111-112］將SpyTag基因插入淀粉樣蛋白CsgA基因中，使SpyTag在不影響CsgA蛋白功能的前提下融合，并共表達(dá)在生物被膜上，同時(shí)將SpyCatcher與功能蛋白融合，再利用這一特異性點(diǎn)擊反應(yīng)，將功能蛋白固定在生物被膜上，通過(guò)基因編輯的方式成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物被膜的功能控制，并將多種酶固定在生物薄膜上以用于生物催化［圖7（b）］。Chen等［113］則在此基礎(chǔ)上將SpyCatcher與金納米顆?；蛄孔狱c(diǎn)融合，制作出具有良好導(dǎo)電效應(yīng)的生物被膜納米電子元件。利用GECC對(duì)生物被膜進(jìn)行功能化修飾已經(jīng)成為一種普適的方法。

圖7 GECC與工程活體材料（a）工程活體材料的特點(diǎn)［102］。（b）利用GECC修飾大腸桿菌生物被膜［111］。（c）利用GECC修飾新月柄桿菌表層蛋白晶格。左圖：原子力顯微鏡下修飾有SpyTag的新月柄桿菌表層蛋白晶格結(jié)構(gòu)，比例尺40 nm；右圖：用SpyCatcher-mRFP1熒光蛋白特異性標(biāo)記的含SpyTag的新月柄桿菌材料，比例尺3 μm［114］Fig.7 GECC and engineered living materials(a)Features of engineered living materials.(b)Decoration of E.coli biofilm via GECC.(c)Decoration of 2D hexameric protein lattice(S-layer)on the surface of C.crescentus via GECC.Left:SpyTagged S-layer visualized by AFM.Scale bar:40 nm.Right:the C.crescentus material labelled with SpyCatcher-mRFP1 imaged via fluorescence microscopy.Scale bar:3 μm.

新月柄桿菌（Caulobacter crescentus）的表層是由RsaA蛋白組成的高度有序二維晶格結(jié)構(gòu)，每個(gè)細(xì)菌表面約有450 000個(gè)晶胞，加之其相較大腸桿菌的低內(nèi)毒素水平和致病性，是一種潛在的高密度生物功能材料基底。Charrier等［114］通過(guò)基因編輯，將SpyTag插入到RsaA中，使其展示在新月柄桿菌的表面，再利用GECC對(duì)其進(jìn)行功能化修飾，從而制成了一種具有二維高度有序結(jié)構(gòu)的工程活體材料。這種材料可被含有SpyCatcher的熒光蛋白特異性標(biāo)記［圖7（c）］。此外，他們還發(fā)現(xiàn)通過(guò)將SpyTag插入到RsaA蛋白的不同位點(diǎn)，得到的細(xì)菌與SpyCatcher的反應(yīng)率不同，由此可以證明該材料的功能化程度可以通過(guò)基因控制的方法實(shí)現(xiàn)。

在此基礎(chǔ)上，Orozco-Hidalgo等［115］發(fā)展出了一種可自組裝并自封裝的工程活體材料。他們通過(guò)基因編輯改造了一種新月柄桿菌，使其表達(dá)并分泌與SpyCatcher融合的ELP蛋白，產(chǎn)率高達(dá)60 mg/L，再將這種桿菌與表面有SpyTag的桿菌混合，SpyCacher-ELP蛋白會(huì)與SpyTag反應(yīng)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，最終形成黏附在桿菌外表面的水凝膠，并將桿菌封裝在其中。這種合成的細(xì)胞外基質(zhì)不僅具有極高的表達(dá)效率和良好的機(jī)械強(qiáng)度，同時(shí)能通過(guò)GECC對(duì)其進(jìn)一步功能化。

傳統(tǒng)的生物制造工業(yè)往往只能進(jìn)行大批量生產(chǎn)，且需要多種復(fù)雜的設(shè)備協(xié)作，在物流、技術(shù)人員等方面也有各種限制。為了彌補(bǔ)這些不足，Dai等［116］發(fā)展了一種基于刺激相應(yīng)的細(xì)胞-材料反饋的通用的生物制造技術(shù)，他們將基因編輯過(guò)的可產(chǎn)生目的產(chǎn)物的大腸桿菌包裹在天然殼聚糖膠囊中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)大腸桿菌在膠囊中的局部濃度足夠高時(shí)，它們會(huì)自動(dòng)發(fā)生局部自裂解，釋放目的小分子或蛋白；培養(yǎng)過(guò)程中的環(huán)境變化會(huì)導(dǎo)致膠囊體積改變，產(chǎn)生擠壓效應(yīng)，促進(jìn)目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)到膠囊外部，而大腸桿菌仍留在內(nèi)部；最后，通過(guò)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能重置膠囊內(nèi)部環(huán)境條件，使大腸桿菌數(shù)量恢復(fù)［圖8（a）］。通過(guò)這種思路，構(gòu)建了一種用于生產(chǎn)的微生物群機(jī)器人平臺(tái)，是一種可以模塊化的工程活體材料。用這種方法合成酶可以直接與后續(xù)的模塊一起，流水線化進(jìn)行定量的酶活性檢測(cè)。他們以修飾有SpyTag的mCherry和融合了SpyCatcher的GFP為例，令平臺(tái)同時(shí)生產(chǎn)這兩種蛋白，隨著蛋白被排出膠囊，進(jìn)入監(jiān)測(cè)單元，兩種熒光蛋白會(huì)因點(diǎn)擊化學(xué)而相互結(jié)合，產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移信號(hào)（FRET），而在監(jiān)測(cè)單元中被定量測(cè)定其活性［圖8（b）］。

圖8 基于GECC的智能化平臺(tái)Fig.8 Smart production platform enabled by GECC.

基于這種工程活體材料，他們發(fā)展了一種新的互穿插的聚合物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［117］。通過(guò)基因編輯讓上述大腸桿菌表達(dá)含有多個(gè)SpyTag或SpyCatcher的類(lèi)彈性蛋白多肽（elastin-like protein，ELP），以此作為單體；將兩種大腸桿菌在高聚物膠囊中共同培養(yǎng)，隨著大腸桿菌的自裂解，兩種單體釋放到膠囊中，通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)自組裝成穿插在膠囊內(nèi)的高分子網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［圖8（c）］。這種工程活體材料有更強(qiáng)的機(jī)械性能，且可以通過(guò)基因編輯在ELP上融合更多功能蛋白，賦予其更多功能。通過(guò)將β-內(nèi)酰胺酶加入體系中，這種膠囊可以幫助降解小鼠腸胃內(nèi)積累的多余的內(nèi)酰胺抗生素，減少使用內(nèi)酰胺時(shí)對(duì)腸道微生物群的擾動(dòng)。

直接以GECC連接細(xì)胞的方式構(gòu)筑工程活體材料的研究也有所進(jìn)展。Kozlowski等［118］通過(guò)基因編輯，在大腸桿菌表面分別表達(dá)了SpyTag和SpyCatcher蛋白，再將這兩種細(xì)菌混合，通過(guò)點(diǎn)擊反應(yīng)使其自然相互結(jié)合、聚集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)材料［圖9（a）］。通過(guò)讓大腸桿菌同時(shí)在體內(nèi)表達(dá)不同的熒光蛋白，可以對(duì)這兩種大腸桿菌在聚集體中的分布進(jìn)行準(zhǔn)確的定位。而通過(guò)控制兩種大腸桿菌的混合比例及順序，可以合成殼層結(jié)構(gòu)的聚集體［圖9（b）］。作者推測(cè)形成的聚集體大小與大腸桿菌表面表達(dá)的蛋白數(shù)量有關(guān)，于是通過(guò)基因編輯減少了近4倍的蛋白表達(dá)并通過(guò)免疫染色等方法驗(yàn)證，隨后用這些新編碼過(guò)的大腸桿菌自組裝成聚集體，發(fā)現(xiàn)聚集體的體積減少了近1個(gè)數(shù)量級(jí)，證明可以通過(guò)控制蛋白表達(dá)的方式對(duì)聚集體的大小進(jìn)行控制。最后，通過(guò)引入哈維弧菌（Vibrio harveyi）的群聚感應(yīng)系統(tǒng)LuxR-LuxI到這種工程化大腸桿菌中，該系統(tǒng)能夠被自誘導(dǎo)劑AHL激活進(jìn)而表達(dá)特定基因，此處他們選擇mWasabi熒光蛋白作為報(bào)告基因［圖9（c）］。研究者們認(rèn)為這種通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)形成的聚集體能夠使得自誘導(dǎo)劑AHL的局部濃度增加，進(jìn)而不斷地激活這個(gè)系統(tǒng)，促使細(xì)菌產(chǎn)生群聚感應(yīng)效應(yīng)，最終整個(gè)聚集體產(chǎn)生綠色熒光；而作為對(duì)照，當(dāng)未表達(dá)SpyTag/SpyCatcher的大腸桿菌與外源性AHL混合時(shí)，僅少量細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生熒光；該實(shí)驗(yàn)證明這種材料能產(chǎn)生群聚感應(yīng)效應(yīng)，能自我調(diào)節(jié)基因表達(dá)。這種基于GECC的新型工程活體材料優(yōu)點(diǎn)眾多，尤其是其群聚感應(yīng)特性，在全細(xì)胞生物催化等領(lǐng)域頗具潛力，而這種構(gòu)建方法和思路也能推廣開(kāi)來(lái)，用于發(fā)展基于其他微生物的工程活體材料。

圖9 基于GECC自組裝的大腸桿菌活體材料及其特點(diǎn)（a）基于GECC自組裝的大腸桿菌活體材料示意圖［118］。（b）自組裝形成的殼層結(jié)構(gòu)工程活體材料，比例尺100 μm。（c）基于SpyTag/SpyCatcher的組裝能夠激活細(xì)菌的群聚感應(yīng)。AHL—N-Acyl-Homoserine Lactone，群聚感應(yīng)（quorum sensing）的自誘導(dǎo)劑。群聚感應(yīng)的報(bào)告基因?yàn)榫G色熒光蛋白mWasabi。阿拉伯糖（L-Arabinose或者L-Ara）用于誘導(dǎo)SpyTag/SpyCatcher的表達(dá)。比例尺100 μmFig.9 GECC-based self-assembled E.coli living material and its features(a)Diagram of GECC-based self-assembled E.coli living material[118].(b)Self-assembled engineered living materials with core-shell structure,scale bar:100 μm.(c)Intercellular assembly enabled by Spy chemistry activates quorum sensing.AHL,N-Acyl-Homoserine Lactone,an autoinducer of quorum sening.The green fluorescent protein,mWasabi,served as a reporter of quorum sensing.L-Arabinose(L-Ara)was used to induce the expression of SpyTag and SpyCatcher.Scale bar:100 μm.

5 展望與結(jié)論

盡管GECC在合成生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)初露鋒芒，我們也需承認(rèn)目前的GECC工具存在的不足。在諸如有機(jī)溶劑等變性環(huán)境下，蛋白質(zhì)間的點(diǎn)擊反應(yīng)將無(wú)法發(fā)生——不過(guò)目前GECC的主要應(yīng)用領(lǐng)域均要求有高生物相容性，這一缺點(diǎn)暫可不計(jì)。在蛋白質(zhì)拓?fù)涔こ痰膶?shí)踐中，研究者們發(fā)現(xiàn)目前的GECC反應(yīng)效率略有不足（60%～90%），這一策略的動(dòng)力學(xué)特性仍待優(yōu)化［23］。此外，有研究顯示SpyTag/SpyCatcher在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)程度通常會(huì)因?yàn)榈托识y以完全，這一問(wèn)題可能需要優(yōu)化過(guò)的反應(yīng)對(duì)如SpyTag003/SpyCather003來(lái)解決［119］。此外，還可以通過(guò)蛋白質(zhì)工程進(jìn)一步在反應(yīng)多樣性、反應(yīng)程度和與其他工具相結(jié)合的能力方面拓展和優(yōu)化。因此，蛋白質(zhì)工程的相關(guān)研究和發(fā)展，包括從自然界中發(fā)現(xiàn)更多GECC基序以及賦予GECC更多的特征，都有助于解決現(xiàn)有的困境。

GECC問(wèn)世至今已迭代出多種不同的版本，我們也期待這一工具包的進(jìn)一步拓展。原則上，基于異肽鍵的蛋白質(zhì)化學(xué)只是其中一種方式，而GECC并不局限于此——任何高效特異的具有“點(diǎn)擊”特征的蛋白質(zhì)或多肽的連接化學(xué)都將豐富這一概念。鑒于目前GECC多是基于自發(fā)形成異肽鍵的單一化學(xué)反應(yīng)模式，而且缺乏信號(hào)響應(yīng)等控制手段，Yang等［120］通過(guò)拆分B12/光響應(yīng)蛋白CarHC，構(gòu)建了一套全新的類(lèi)GECC的蛋白質(zhì)化學(xué)，實(shí)現(xiàn)了小分子B12和光誘導(dǎo)的高效特異的蛋白連接。其產(chǎn)物亦因雙組氨酸/鈷離子（Bis-His/Co）的絡(luò)合作用而極其穩(wěn)定。研究者進(jìn)而合成了一系列智能響應(yīng)的蛋白質(zhì)水凝膠材料，展示了其在材料合成生物學(xué)中的應(yīng)用。這種全新的蛋白質(zhì)化學(xué)拓展了已有的GECC的設(shè)計(jì)范式，可作為GECC的一個(gè)重要補(bǔ)充。

從廣義的合成化學(xué)角度來(lái)看，GECC可視為一種“信息編碼的化學(xué)反應(yīng)”。有關(guān)其化學(xué)反應(yīng)性的信息完全編碼在反應(yīng)組分的序列中，通過(guò)鏈折疊和分子識(shí)別讀出，并通過(guò)自催化轉(zhuǎn)化為化學(xué)鍵。它代表了一種通過(guò)改變信息或特定序列來(lái)調(diào)整化學(xué)反應(yīng)性的獨(dú)特方法。如果有關(guān)化學(xué)結(jié)構(gòu)的信息可以以簡(jiǎn)單直接的方式表示，我們認(rèn)為這種反應(yīng)控制模式可以擴(kuò)展到更廣泛意義上的合成分子。例如，我們推測(cè)主客體化學(xué)（host-guest chemistry）和自催化鍵形成的結(jié)合可能會(huì)導(dǎo)致一種新的超分子相互作用模式，其中二級(jí)相互作用和化學(xué)鍵能夠相互加強(qiáng)［23］，而這種相互作用模式能催生出更多具有全新性質(zhì)的材料。

擁有高特異性、強(qiáng)穩(wěn)定性、快反應(yīng)速率、可編碼等特性，可基因編碼點(diǎn)擊化學(xué)（GECC）已經(jīng)成為材料合成生物學(xué)的一個(gè)重要工具。大量基于GECC的合成生物學(xué)材料被設(shè)計(jì)發(fā)展并得到應(yīng)用，以一種全新的體系為人類(lèi)應(yīng)對(duì)健康、能源、環(huán)境等領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)提供了新的思路。其中，利用GECC設(shè)計(jì)的重組疫苗更是為解決新冠肺炎疫情這一緊急公共衛(wèi)生事件添磚加瓦。在可預(yù)見(jiàn)的將來(lái)，強(qiáng)大的蛋白質(zhì)工程手段如定向進(jìn)化與理性設(shè)計(jì)等必將會(huì)生成更多的“完美”的蛋白質(zhì)化學(xué)與生物組裝策略，繼而助力材料合成生物學(xué)以解決關(guān)乎國(guó)計(jì)民生的重大應(yīng)用問(wèn)題。