邵云菲，王卉，朱怡然，王樹春，姜雨淋，胡建臣，王晶，張克勤

（1蘇州大學(xué)紡織與服裝工程學(xué)院，現(xiàn)代絲綢國家工程實驗室（蘇州），紡織行業(yè)絲綢功能材料與技術(shù)重點實驗室，江蘇蘇州 215123；2西安交通大學(xué)機(jī)械工程學(xué)院，陜西 西安 710049）

骨骼是一種保護(hù)內(nèi)部器官、提供身體支撐的特殊組織，盡管其具有一定的自我修復(fù)與再生能力，但因先天性缺陷、退行性疾病、創(chuàng)傷性損傷或手術(shù)切除腫瘤等原因造成的嚴(yán)重骨缺損并不能自行愈合，如果要實現(xiàn)其功能恢復(fù)和完全愈合，仍然需要臨床干預(yù)［1-2］。在臨床上，目前治療嚴(yán)重骨缺損的標(biāo)準(zhǔn)治療方法通常是使用生物惰性金屬裝置進(jìn)行骨固定，或自體骨移植和異體骨移植。然而，金屬骨固定裝置往往需要后續(xù)手術(shù)切除，而自體骨移植來源有限且會導(dǎo)致與供體部位愈合相關(guān)的額外發(fā)病，異體骨移植還會存在疾病傳播和產(chǎn)生免疫排斥的風(fēng)險等，這些與骨移植相關(guān)的風(fēng)險在老年人中尤其嚴(yán)重［3-4］。近年來，骨組織工程技術(shù)的發(fā)展為促進(jìn)骨缺損部位修復(fù)再生提供了一條新的研究策略，而組織工程支架材料在骨組織工程研究中發(fā)揮著十分重要的作用，在骨組織再生過程中模擬細(xì)胞外基質(zhì)，為細(xì)胞提供合適的生長環(huán)境和機(jī)械支撐［5-7］。

骨組織工程支架材料臨床需求是巨大的，而成功的骨組織工程材料設(shè)計需要理解骨骼的組成和結(jié)構(gòu)，適當(dāng)選擇具有良好生物相容性的生物材料，并通過靈活多變的制造技術(shù)在多尺度上控制骨修復(fù)材料的結(jié)構(gòu)形式。多層級的多孔結(jié)構(gòu)是骨組織系統(tǒng)的特征，也是骨組織系統(tǒng)實現(xiàn)其功能的基礎(chǔ)。向自然學(xué)習(xí)，模仿此種結(jié)構(gòu)的材料設(shè)計與合成已成為制備高性能骨組織修復(fù)材料的一種有效策略［8-10］。骨修復(fù)材料的多孔結(jié)構(gòu)可促進(jìn)新血管和血管周圍神經(jīng)纖維的浸潤，以及細(xì)胞在整個結(jié)構(gòu)中的生長。雖然這些多孔結(jié)構(gòu)降低了支架的整體力學(xué)性能，但細(xì)胞、神經(jīng)和血管進(jìn)入支架內(nèi)并繼續(xù)駐留，對于使骨缺損部位再生和功能的恢復(fù)十分必要。而在骨組織工程原材料的選擇上由多種因素決定，包括天然組織成分的啟發(fā)，預(yù)期的制造和實現(xiàn)方法［11］。目前，對于可作為骨組織工程應(yīng)用的最常見的候選材料主要包括金屬材料、生物陶瓷材料和聚合物材料。金屬材料具有較高的力學(xué)性能，常用于修補(bǔ)承重的骨組織部位，但大多數(shù)不可降解，并且會面臨腐蝕產(chǎn)物釋放引起不良的生物反應(yīng)。生物陶瓷材料特別是磷酸鈣生物材料因其與天然骨中的無機(jī)成分相似，成為目前的研究熱點，但其脆性大、抗疲勞強(qiáng)度低。聚合物材料中包含人工合成聚合物和天然聚合物：合成聚合物提供了更多的化學(xué)修飾和分子改變的可能性，但通常缺乏特定的生物功能性；而天然聚合物通常具有良好的生物相容性、生物降解性等特點，受到了越來越多的關(guān)注［12-14］。其中絲素蛋白（silk fibroin，SF）作為一種可工業(yè)化生產(chǎn)的天然聚合物材料，已被廣泛用于骨組織工程領(lǐng)域［15-16］。研究者們致力于發(fā)展多種制造技術(shù)將SF材料重建為三維（3D）多孔支架材料，如常見的冷凍干燥法和粒子瀝濾法。近年來新興發(fā)展起來的3D打印技術(shù)對支架微觀結(jié)構(gòu)具備優(yōu)越的可控性，這為制造具有復(fù)雜的幾何和表面特征的類骨結(jié)構(gòu)材料提供了新的機(jī)會［17-18］。值得注意的是，制備技術(shù)對支架材料多孔結(jié)構(gòu)的控制，可以進(jìn)而影響支架材料的降解性質(zhì)、機(jī)械以及生物性能［19］。

本文首先概述了自然骨組織的結(jié)構(gòu)特征；其次，總結(jié)了SF材料重要的基本特性；隨后，介紹了SF基多孔骨組織支架的典型制備技術(shù)冷凍干燥法和粒子瀝濾法，以及新興的3D打印技術(shù)和復(fù)合制造系統(tǒng)，并探討了各種制造技術(shù)對SF支架多孔結(jié)構(gòu)的可控性；最后，討論了在構(gòu)建具有仿生多層級多孔結(jié)構(gòu)特征的骨組織再生材料中所面臨的挑戰(zhàn)，并對該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢進(jìn)行了展望。

1 自然骨組織的結(jié)構(gòu)特征

骨組織的多層次結(jié)構(gòu)及其在胚胎發(fā)育和骨修復(fù)過程中的自然形成過程為骨組織工程材料的設(shè)計和制造提供了靈感［20-21］。骨是一種由礦物質(zhì)和骨組織構(gòu)成的活性組織。骨骼由典型的細(xì)胞類型組成（包括骨原細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞以及破骨細(xì)胞等）［21］，并被細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）包圍。盡管骨組織的性質(zhì)隨所處部位不同而有所差異，并且各種組成物質(zhì)的比例也隨骨骼的不同部位有一定的變化，但一般而言，骨組織中含有約60%～70%的以羥基磷灰石（HA）為主的無機(jī)礦物，約10%～20%的以膠原蛋白為主的有機(jī)物質(zhì)，剩余包含一些多糖、蛋白質(zhì)、水和鉀、鈉、鎂元素等［22］。從結(jié)構(gòu)上看人體骨組織具有從宏觀大尺寸到納米小尺寸的多級復(fù)雜層級結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)如圖1所示［23］。在宏觀結(jié)構(gòu)上，骨包括骨質(zhì)、骨膜和骨髓等部分。骨質(zhì)由外層的皮質(zhì)骨和內(nèi)部的松質(zhì)骨組成，是一種不均勻的多孔結(jié)構(gòu)，其密度從外到內(nèi)逐漸減?。?4］。皮質(zhì)骨高度致密并提供骨的主要力學(xué)性能，占骨量的80%，孔隙率低，為5%～10%，其中有哈弗斯管在縱向上承載著豐富的血管和神經(jīng)，哈弗斯管中的血管通過橫向通道中的血管相互連接，這些通道被稱為沃爾克曼管［25］。而松質(zhì)骨是由相互連接的骨小梁排列而成，厚度約為200 μm，松質(zhì)骨僅占人體骨骼重量的20%，但其孔隙率卻達(dá)到50%～90%，比表面積幾乎是皮質(zhì)骨的20倍［26-28］。在微觀結(jié)構(gòu)上，膠原分子有序排列形成直徑約80～120 nm的膠原纖維，其上有特定的結(jié)合點用作骨礦物晶體的成核位點，在這些位點上骨磷灰石晶體定向生長，通常以板狀或針狀形式出現(xiàn)［2，20］。骨組織所具有的特殊的組分和層級多孔結(jié)構(gòu)使其在減輕重量的同時也能夠保持堅硬，并且在人體中承擔(dān)著重要的生物功能［29］。

圖1 天然骨組織的多尺度結(jié)構(gòu)［23］Fig.1 Schematic diagrams for the multi-scale structure of native bone tissue[23]

對于目標(biāo)骨組織生物學(xué)和結(jié)構(gòu)的深入理解是設(shè)計和制造理想骨組織修復(fù)材料的前提條件，骨組織缺損的修復(fù)會受到缺陷部位相關(guān)因素和患者相關(guān)因素的影響［30］。如果骨缺損修復(fù)發(fā)生在承重部位時，如脊柱和長骨，需要新骨盡快生長，以固定修補(bǔ)缺損部位而減輕病人的疼痛，同時還需表現(xiàn)出一定的承重能力。此時，修復(fù)支架材料的多孔結(jié)構(gòu)是影響新骨長入形成穩(wěn)定骨整合的重要因素，同時高孔隙率和高機(jī)械強(qiáng)度這兩個相互沖突的要求也需要考慮合并在一個材料體系中。因此，設(shè)計調(diào)控支架的孔徑、孔隙率、孔分布等結(jié)構(gòu)特征，以實現(xiàn)在多尺度上對材料性能的卓越控制，是骨組織工程的一個研究重點和難點［25］。相比之下，在顱骨缺陷修復(fù)中一般不承重，但是顱面骨缺損通常形狀復(fù)雜，骨修復(fù)過程不僅必須起到完全填補(bǔ)缺陷空間的作用，還會影響患者面部外觀，從而影響病人的日常和職業(yè)生活。因此在制造方法的選擇上，也需要考慮是否能夠精確控制材料的結(jié)構(gòu)特征。

2 SF的結(jié)構(gòu)與基本性能

2.1 SF的結(jié)構(gòu)

天然絲纖維是一種由節(jié)肢動物（蠶、蜘蛛等）分泌紡成的高分子有機(jī)物。家蠶易于養(yǎng)殖，可被用做批量化生產(chǎn)蠶絲纖維。蠶絲主要由兩根SF纖維及其外包裹的絲膠蛋白組成（圖2），其他包括少量的色素、蠟和礦物質(zhì)［31］。當(dāng)絲膠與SF結(jié)合時，會引起人體的免疫炎癥反應(yīng)，因此，在將SF應(yīng)用于骨組織支架制備時，需要先去除絲膠［6］。SF富含18種氨基酸，一級結(jié)構(gòu)包括由二硫鍵連接的疏水重鏈（391.6 kDa）和親水輕鏈（27.7 kDa），以及以非共價鍵連接的P25蛋白［16，32］，二級結(jié)構(gòu)主要包含無規(guī)卷曲、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和β-折疊。SF基本結(jié)構(gòu)主要由非結(jié)晶區(qū)和結(jié)晶區(qū)組成，結(jié)晶區(qū)主要包括silkⅠ和silkⅡ。其中，silkⅠ是存在于蠶腺中的亞穩(wěn)態(tài)液體，由α-螺旋和無規(guī)卷曲堆疊而成，silkⅡ具有反向平行的β-折疊結(jié)構(gòu)，更加穩(wěn)定，使SF在大部分情況下不溶，并且具有優(yōu)異的機(jī)械強(qiáng)度［33］。

圖2 SF的分層結(jié)構(gòu)和化學(xué)結(jié)構(gòu)［31］Fig.2 Schematic illustration of hierarchical and chemical structure of SF[31]

2.2 SF的基本性能

生物相容性是骨組織工程應(yīng)用材料的關(guān)鍵先決條件，由于SF獨特的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)，使其展現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性。早在公元150年，SF就已作為縫合材料應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［34］。近年來，SF材料因其良好的生物相容性、可調(diào)的生物降解性、非免疫原性，以及豐富的原料供應(yīng)，在組織工程領(lǐng)域越來越受到人們的關(guān)注，SF也在1993年被美國食品藥品管理局（FDA）認(rèn)證為一種可用于臨床的生物材料［35］。特別的是，SF材料易于加工，通過常規(guī)的溶解方案可獲得再生SF的水溶液，此時的SF在熱力學(xué)上是不穩(wěn)定的，以一種亞穩(wěn)定狀態(tài)形式存在。這種非晶結(jié)構(gòu)的SF可通過物理和化學(xué)方法進(jìn)行調(diào)控，從而促使SF中的β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加，使其逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闊崃W(xué)上穩(wěn)定的silkⅡ結(jié)構(gòu)［36-37］。而這種結(jié)構(gòu)上的可調(diào)控性和快速轉(zhuǎn)變能力，使得SF材料作為組織工程材料應(yīng)用時，可根據(jù)實際需要對材料的呈現(xiàn)形態(tài)、力學(xué)性能、生物降解性能等進(jìn)行靈活的調(diào)控。Sartika等［38］制備了純SF支架及接種人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（hASCs）的SF支架，并進(jìn)行了生物相容性、體外成骨分化及大鼠顱骨缺損修復(fù)的評估，研究結(jié)果證明了SF具有優(yōu)異的生物相容性并可以顯著促進(jìn)hASCs的成骨分化，同時實現(xiàn)有效的骨再生。另一方面，SF不僅本身對組織機(jī)體沒有毒性，同時它的降解產(chǎn)物也不會引起不良反應(yīng)［39-40］。對于骨組織工程支架，其降解速率應(yīng)當(dāng)匹配骨再生的速率，SF受控的降解性展現(xiàn)出重要的優(yōu)勢［41］。有研究表明，水衍生SF支架可以在1年內(nèi)完全降解［42］。此外，骨組織工程支架要求一定的機(jī)械強(qiáng)度，在植入時可以為缺損部位和新生組織提供機(jī)械支撐和穩(wěn)定性。SF纖維具有優(yōu)異的力學(xué)性能，脫膠的SF具有10～17 GPa的拉伸彈性模量、300～740 MPa的拉伸強(qiáng)度以及4%～26%的斷裂應(yīng)變。然而，溶解過程常常會導(dǎo)致SF分子間氫鍵的斷裂，使SF支架無法達(dá)到天然蠶絲的強(qiáng)度。但已有研究表明，可以通過調(diào)節(jié)SF溶液濃度和蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，以及調(diào)控多孔結(jié)構(gòu)特征，或引導(dǎo)HA與其復(fù)合的手段，增強(qiáng)SF支架的力學(xué)性能［43-45］。SF因其優(yōu)良的生物相容性、可調(diào)控的生物降解性、易加工性以及來源豐富等優(yōu)點，使其在組織工程領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注［46-47］。特別是，已有研究表明SF可以誘導(dǎo)HA納米晶體的成核，并優(yōu)先沿著HA晶體的（002）晶面擇優(yōu)生長，預(yù)示著SF可能在羥基磷灰石（HA）納米晶體的礦化過程中起到重要的作用。因此，SF通常與HA結(jié)合形成支架用于骨組織工程，為骨組織修復(fù)提供相關(guān)的成骨環(huán)境，誘導(dǎo)新骨的生成［8，48-49］。

3 SF基3D骨組織修復(fù)支架的制備技術(shù)及其對多孔結(jié)構(gòu)的調(diào)控

在組織工程材料設(shè)計中，材料的制備技術(shù)是一個必須考慮的關(guān)鍵問題，制備技術(shù)可以決定生物材料的形態(tài)結(jié)構(gòu)、降解性質(zhì)、力學(xué)性能以及生物性能。根據(jù)組織工程材料預(yù)期的應(yīng)用場景，材料可以被制造成微/納米顆粒、纖維、涂層、薄膜和3D結(jié)構(gòu)等多種形式［50］。在骨組織工程中受到廣泛關(guān)注的SF基3D多孔支架可以通過傳統(tǒng)的冷凍干燥法、粒子瀝濾法來制備，也可以通過新興發(fā)展起來的3D打印技術(shù)進(jìn)行制備，還可以結(jié)合多種制造技術(shù)以實現(xiàn)在多種長度尺度上對組織工程材料結(jié)構(gòu)的精確控制［51］。

3.1 冷凍干燥法

冷凍干燥法是一種制備3D多孔支架的常用方法，使用該方法制備SF基多孔支架時，首先將SF材料溶解形成均相溶液，然后通過冷凍使SF溶液發(fā)生相分離，形成SF富集相和溶劑富集相，再在高度真空的環(huán)境下，通過冰晶升華的原理冷凍干燥去除凍結(jié)了的漿料中的溶劑，冰晶原來占據(jù)的空間即形成多孔的結(jié)構(gòu)［52-53］。該方法分為溶液配制、低溫冷凍和真空干燥3個步驟。通過改變SF的濃度、二級結(jié)構(gòu)、混合溶液成分、相分離時降溫速度和溫度等可以控制冰晶生長行為（包括生長速度和方向等），從而有效控制最終支架的多孔結(jié)構(gòu)。例如通過控制冷凍溫度可有效調(diào)控多孔結(jié)構(gòu)的孔徑變化，而通過控制冷凍的方向，可控制3D多孔支架呈現(xiàn)隨機(jī)（各向同性）、線性（各向異性）等不同的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［45，54］。在使用冷凍干燥法制備SF多孔支架時，可在冷凍前的SF溶液中靈活地添加其他功能材料，如納米鈣磷鹽（CaP）陶瓷材料或其他聚合物材料，以獲得性能更加優(yōu)異的SF基復(fù)合多孔支架［55-56］。該方法制備過程簡單，不需要復(fù)雜加工手段，也不使用有毒物質(zhì)，是一種對環(huán)境友好的綠色制備方法。然而，由于冰晶的生長具有隨機(jī)性，因此該方法對多孔結(jié)構(gòu)的控制也是有限的，獲得的多孔結(jié)構(gòu)通常是隨機(jī)分布的，對孔的形狀、尺寸、孔隙率和連通性等參數(shù)無法進(jìn)行精確控制。

Mandal等［57］通過冷凍干燥法制備SF多孔支架，研究了SF溶液濃度和冷凍溫度對支架多孔結(jié)構(gòu)的影響。研究結(jié)果表明，隨著SF濃度的增加，支架孔徑和孔隙率都會隨之減小。而隨著冷凍溫度的降低，支架孔徑減小而孔隙率增加，最高孔隙率可達(dá)到96%±4.1%。SF的濃度和冷凍溫度會影響冰晶生長行為，實現(xiàn)對多孔結(jié)構(gòu)的控制，從而進(jìn)一步影響細(xì)胞的生長行為。結(jié)果顯示較大的孔徑、較高的孔隙率和良好的內(nèi)部連通性可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，以及向支架內(nèi)部的長入。Wang等［58］通過引入鈣離子（Ca2+）調(diào)控蛋白質(zhì)相分離過程，從而調(diào)控冰晶的生長和分布，最終獲得具有多級多孔結(jié)構(gòu)的SF支架（Ca/SFS），如圖3所示。研究結(jié)果表明，與傳統(tǒng)冷凍干燥獲得的單一多孔結(jié)構(gòu)支架（SFS）相比，Ca/SFS支架中大孔孔壁上微小孔隙的存在可有效促進(jìn)人骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的黏附、增殖和成骨分化。Bicho等［59］通過設(shè)置3種不同的冷凍方式，從而對3D支架的多孔結(jié)構(gòu)進(jìn)行控制。將SF與摻雜的β-磷酸三鈣（β-TCP）混合均勻后，第1種采用直接冷凍方式，冰晶隨機(jī)生長，最終獲得各向同性（隨機(jī)）的多孔結(jié)構(gòu)；第2種采用底部冷凍方式，誘導(dǎo)冰晶垂直生長，最終獲得線性的多孔結(jié)構(gòu)；第3種采用上下絕熱橫向冷凍的方式，控制冰晶徑向生長，最終獲得徑向的多孔結(jié)構(gòu)。同時，研究結(jié)果還表明，通過對多孔結(jié)構(gòu)的控制可有效影響最終3D支架材料的力學(xué)性能。

圖3 Ca2+誘導(dǎo)多級多孔結(jié)構(gòu)Ca/SFS支架形成過程［58］（Ca/SFS支架的SEM照片及其表面生長細(xì)胞的增殖和成骨分化情況）Fig.3 Schematic diagram of the formation process of Ca2+induced multi-level porous structure Ca/SFS scaffolds,SEM micrographs of Ca/SFS scaffolds and proliferation and osteogenic differentiation of growing cells on surface[58]

3.2 粒子瀝濾法

粒子瀝濾法是一種廣泛應(yīng)用于骨組織工程多孔支架的制備方法，在制備SF基多孔支架時，通常先將SF溶液與一定直徑范圍的致孔顆粒均勻混合、固化，再利用致孔劑與SF不同的溶解性，浸泡去除致孔劑顆粒，在致孔劑原來的位置則形成孔隙，從而產(chǎn)生SF多孔支架［60-61］。常用的致孔劑有鹽顆粒、石蠟顆粒和糖顆粒等，致孔劑的大小、形狀和相對位置可以決定多孔支架中的孔徑、孔隙率、有序性、連通性等結(jié)構(gòu)特征。粒子瀝濾法操作相對簡單，但是由于SF溶液填充致孔劑模板空隙時容易填充不完整，并且致孔劑去除過程易殘留，從而影響支架多孔結(jié)構(gòu)的完整性和再現(xiàn)性［62-63］。

Correia等［54］使用水和六氟異丙醇（HFIP）作溶劑分別制備SF的溶液作為原料，然后采用不同粒徑的氯化鈉（NaCl）顆粒作為致孔劑制備了具有不同多孔結(jié)構(gòu)的SF支架。由于致孔劑尺寸所引起的結(jié)構(gòu)控制，以及致孔劑NaCl顆粒在溶劑中的溶解性對多孔結(jié)構(gòu)的影響，研究者可以對SF支架的孔徑、孔隙率和孔隙的幾何形狀進(jìn)行一定的控制。而力學(xué)性能研究結(jié)果表明，HFIP衍生的SF支架比水性的SF支架具有更高的力學(xué)強(qiáng)度。通過人類脂肪來源干細(xì)胞對多孔結(jié)構(gòu)的響應(yīng)結(jié)果可以看出，通過支架多孔結(jié)構(gòu)的控制可以影響細(xì)胞的生長行為，研究結(jié)果表明孔徑為400～600 μm的多孔HFIP衍生的SF支架（HFIP-400）顯示出最佳的骨組織形成結(jié)果。該研究強(qiáng)調(diào)了粒子瀝濾法對支架多孔結(jié)構(gòu)的控制作用以及多孔結(jié)構(gòu)調(diào)控對骨組織工程支架設(shè)計的重要性。Zeng等［64］使用不溶解于水的石蠟微球作為致孔劑，得到了與石蠟直徑一致的多孔SF支架，并且孔隙率高達(dá)92.38%±5.12%。通過細(xì)胞實驗證明該支架有利于髓核細(xì)胞的生長、浸潤和ECM分泌，具有良好的生物相容性。Park等［65］通過粒子瀝濾法制備SF/HA復(fù)合支架，研究了不同種類的致孔劑（鹽和蔗糖）對支架多孔結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明鹽顆粒制備的支架孔徑較蔗糖顆粒制備的支架孔徑更大一些，但蔗糖顆粒制備的支架具有更好的孔互連性，這為細(xì)胞的遷移和增殖提供了充分的機(jī)會。實驗結(jié)果表明使用蔗糖顆粒制備的SF/HA復(fù)合支架可促進(jìn)骨鈣沉積并能有效促進(jìn)大鼠顱骨缺損處新骨的再生。

傳統(tǒng)的冷凍干燥法和粒子瀝濾法通常依賴于隨機(jī)過程，這些過程通常會導(dǎo)致支架在尺寸、結(jié)構(gòu)和連通性方面形成不受控制的孔隙結(jié)構(gòu)，從而極大限制了其在組織再生中的使用［66-67］。相比之下，基于緊密堆積的單分散微球晶格組成的模板所制造的反蛋白石支架，其孔隙結(jié)構(gòu)、孔徑、孔隙率和互連性都得到了前所未有的控制［68-70］。該方法主要包括微球模板制造、漿料填充和模板去除3個步驟，如圖4所示。Sommer等［71］基于聚己內(nèi)酯（PCL）單分散微球組裝的高度有序緊密堆積晶格模板，通過SF溶液澆鑄微球模板后去除微球模板，最終獲得具有反蛋白石有序多孔結(jié)構(gòu)的SF支架。研究結(jié)果表明，與傳統(tǒng)非均勻多孔支架相比，由于微球的單分散性，所得反蛋白石支架具有較為規(guī)則的孔形狀、均勻的孔徑和孔隙、有序的空間排列以及相互連接的窗口，并且在不同批次的樣品中具有較好的再現(xiàn)性。這種高度有序的多孔結(jié)構(gòu)可有效促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）的生長和成骨分化，在骨組織修復(fù)過程中具有積極的影響。

圖4 反蛋白石法制備SF支架的示意圖及支架結(jié)構(gòu)、孔徑分布，鹽顆粒（黑色柱）和反蛋白石（灰色柱）支架培養(yǎng)6周后測量的鈣含量［68，71］Fig.4 Schematic diagram of SF scaffold prepared by inverse opal method,scaffold structure and pore size distribution,calcium content measured after 6 weeks in culture for salt-leached(black columns)and inverse opal(gray columns)scaffolds[68,71]

3.3 生物3D打印法

如上所述，冷凍干燥法和粒子瀝濾法這些傳統(tǒng)技術(shù)仍廣泛應(yīng)用于多孔材料的制備上，但這些技術(shù)有眾所周知的局限性，如較差的可擴(kuò)展性和可控性，在對多層級多孔結(jié)構(gòu)特征的精確控制上十分困難。近年來發(fā)展起來的3D打印技術(shù)是一種新型的快速成型制造技術(shù)，可通過計算機(jī)輔助技術(shù)精確快速地制造任意復(fù)雜形狀的3D結(jié)構(gòu)體［72-74］。3D打印技術(shù)的獨特優(yōu)勢使其可實現(xiàn)在體外構(gòu)建具有特殊復(fù)雜3D仿生結(jié)構(gòu)的組織工程支架材料。3D打印技術(shù)可有效定義3D支架材料的孔徑、孔隙率、孔隙的空間排列、連通性等結(jié)構(gòu)特征，這使得使用3D打印技術(shù)制備的支架相比于使用其他制造方法制備的支架具有更好的孔隙互連性和更高的機(jī)械強(qiáng)度，這些材料在骨組織工程中具有令人興奮的臨床應(yīng)用潛力。同時，3D打印技術(shù)對多孔結(jié)構(gòu)的精確控制，可使系統(tǒng)變化的生物材料結(jié)構(gòu)成為一種有價值的初始篩選工具，可以確定最合適的孔徑范圍/形態(tài)，從而對組織相關(guān)結(jié)果進(jìn)行更詳細(xì)的研究。用于SF基骨組織工程多孔材料的3D打印技術(shù)的主要形式有擠出式3D打印和光固化3D打?。?5-77］。

在擠出式3D打印中，材料通過氣動壓力或機(jī)械柱塞通過噴嘴擠壓，形成細(xì)絲，并按照每一層指定的不同模式沉積生物墨水，從而實現(xiàn)結(jié)構(gòu)的精確成型［圖5（a）］［78］。該技術(shù)的優(yōu)點是能夠輸送的細(xì)胞和材料選擇性范圍較廣，但是打印分辨率較低，通常需要打印墨水材料具有剪切變稀的流變性能，并且經(jīng)過擠壓后材料可固化成形，以保證打印結(jié)構(gòu)體的完整性。擠出式3D打印技術(shù)的一個局限是無法使用柔軟或低黏度的材料制造結(jié)構(gòu)，這些材料在擠壓后通常不能保持其形狀。而單純的SF材料體系一般具有較低的濃度和黏度，因此需要通過各種物理化學(xué)手段改善和優(yōu)化其流變性能［81-82］。目前通常將SF與其他高黏度生物材料復(fù)合以獲得具有良好流變性能的SF基生物墨水，實現(xiàn)SF的擠出式3D打印制造［83-84］。Zheng等［79］將SF與聚乙二醇（PEG）復(fù)合獲得可用于擠出式3D打印的生物墨水，PEG與SF混合會誘導(dǎo)SF的β-折疊結(jié)構(gòu)形成，從而通過此物理交聯(lián)產(chǎn)生凝膠化和水不溶性。通過控制3D打印參數(shù)，可獲得一系列具有高分辨率、高形狀保真度和均勻凝膠基質(zhì)的多孔結(jié)構(gòu)，如圖5（a）所示。當(dāng)hMSC細(xì)胞在3D打印前與SF溶液預(yù)混合可實現(xiàn)細(xì)胞負(fù)載構(gòu)建體的共同打印，細(xì)胞在所打印3D結(jié)構(gòu)體中可存活至少12周，表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性。研究結(jié)果表明，SF/PEG生物墨水凝膠可借助3D打印技術(shù)設(shè)計和構(gòu)建3D多孔結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞生長和生物功能的實現(xiàn)提供合適的支架環(huán)境。

圖5 基于3D打印法可控構(gòu)建SF支架的3D多孔結(jié)構(gòu)Fig.5 Controllable construction of 3D porous structures of SF scaffolds based on 3D print

光固化3D打印技術(shù)是一種通過光激發(fā)、分層固化的3D打印技術(shù)，采用透明、低黏度的液態(tài)光敏聚合物，通過投射到材料上的光模式選擇性地在特定位置上進(jìn)行逐層固化［85-86］。與擠出式3D打印技術(shù)相比，光固化3D打印技術(shù)提供了更高的分辨率，可實現(xiàn)復(fù)雜結(jié)構(gòu)精細(xì)控制打印。Kim等［80］在SF溶液的制造過程中使用甲基丙烯酸縮水甘油酯（GMA）制備了基于SF的生物墨水（Sil-MA），并用于光固化3D生物打印。為了證明Sil-MA優(yōu)異的可打印性，模擬了各種復(fù)雜的類組織結(jié)構(gòu)，打印了具有高度互連多孔的網(wǎng)狀支架，證明其在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用前景［圖5（b）］。此外，Sil-MA墨水具有良好的力學(xué)性能，打印的具有螺旋褶皺的耳廓結(jié)構(gòu)體具有良好的機(jī)械彈性。將小鼠胚胎成纖維細(xì)胞與墨水混合后打印，打印后培養(yǎng)14 d，封裝在Sil-MA水凝膠內(nèi)的細(xì)胞表現(xiàn)出良好的細(xì)胞活力，證明其具有良好的生物相容性。

3.4 復(fù)合制造技術(shù)

骨組織的形成是在多尺度下進(jìn)行的，而最終形成的骨組織的功能和特性很大程度上歸功于其層次結(jié)構(gòu)。在不同長度尺度上對生物材料結(jié)構(gòu)特征的高度控制通常不能通過單一的制造方法實現(xiàn)。因此，骨組織工程系統(tǒng)的設(shè)計者需要開發(fā)新的制造策略，結(jié)合多種合成和制造技術(shù)，從而實現(xiàn)對骨組織工程材料多層級結(jié)構(gòu)的精確控制［87-90］。

Yan等［91］通過粒子瀝濾和冷凍干燥相結(jié)合的方法，構(gòu)建了更符合天然骨特性的多級多孔結(jié)構(gòu)的SF/CaP復(fù)合支架。實驗結(jié)果證明粒子瀝濾法中的NaCl顆粒產(chǎn)生了約為500 μm的相互連接的大孔，而冷凍干燥過程構(gòu)筑了存在于大孔小梁中的20～100 μm之間的微孔，細(xì)胞毒性評估結(jié)果表明該支架無細(xì)胞毒性。李東等［92］通過低溫3D打印聯(lián)合冷凍干燥技術(shù)制備了膠原蛋白/SF/HA復(fù)合支架，支架顯示出大孔（502.78 μm±21.47 μm）/微孔（62.48 μm±22.07 μm）共存的3D多孔徑立體結(jié)構(gòu)，細(xì)胞培養(yǎng)實驗結(jié)果表明支架細(xì)胞相容性良好，可以有效促進(jìn)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖和分化。Sommer等［93］為了構(gòu)建與天然骨結(jié)構(gòu)類似的層次結(jié)構(gòu)SF支架，通過結(jié)合3D打印法和粒子瀝濾法，控制制備了宏觀-介觀-納米三層分級結(jié)構(gòu)的SF支架，如圖6所示。具體來說，先將犧牲有機(jī)微粒（乳膠納米顆粒包覆的PCL或蠟顆粒）添加到SF和魔芋膠水復(fù)合凝膠中，然后將復(fù)合凝膠通過3D打印構(gòu)建宏觀支架結(jié)構(gòu)，再去除納米和微米微球模板從而形成多級多孔結(jié)構(gòu)。該支架多層級多孔結(jié)構(gòu)特征可由3D打印的間距以及犧牲顆粒的大小和特征精確控制，這種模板組裝與3D打印相結(jié)合的加工技術(shù)大大增強(qiáng)了在多個尺度上對SF支架結(jié)構(gòu)特征的調(diào)控能力，獲得具有毫米-微米-納米多層級多孔結(jié)構(gòu)的支架，其在骨組織工程支架領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。Karamat-Ullah等［94］通過溶膠-凝膠和自組裝的協(xié)同組合開發(fā)了一種含硅（Si）的SF凝膠墨水，之后使用3D打印和冷凍干燥聯(lián)合方法制備了層次化的孔隙結(jié)構(gòu)，即3D打印形成的宏觀孔隙（500 μm～1 mm）、冷凍干燥形成的微孔隙（18～20 μm）以及溶膠-凝膠和自組裝形成的介孔（20 nm）。此外，通過打印前和打印后將巰基端抗菌肽和細(xì)胞黏附肽序列（SH-CM-RGD）通過共價連接到Si-SF雜化凝膠中，實現(xiàn)抗菌功能。結(jié)果表明該3D支架具有良好的力學(xué)性能、抗菌活性，具有低細(xì)胞毒性，并且能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長和增殖。

圖6 基于復(fù)合制造技術(shù)可控構(gòu)建SF支架的3D多孔結(jié)構(gòu)［93］Fig.6 Controllable construction of 3D porous structures of SF scaffolds based on composite manufacturing technology[93]

4 挑戰(zhàn)與展望

SF作為一種生物相容性良好、易加工成型、力學(xué)性能優(yōu)異的天然聚合物，通過不同的制造方法構(gòu)建的SF基3D多孔支架在骨組織工程領(lǐng)域受到了極大的關(guān)注，特別是對于支架多孔結(jié)構(gòu)的調(diào)控是目前的研究熱點，各種制備方法對多孔結(jié)構(gòu)的調(diào)控總結(jié)于表1。盡管已發(fā)展了多種制備技術(shù)用于構(gòu)筑和調(diào)控SF基的多孔結(jié)構(gòu)，但是目前大部分的SF基支架材料的結(jié)構(gòu)與真實骨組織還存在不小的差異，仿生多級結(jié)構(gòu)的精確構(gòu)筑仍是難點。同時，我們發(fā)現(xiàn)眾多研究都表明多孔結(jié)構(gòu)的調(diào)控可有效影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，而材料的多孔結(jié)構(gòu)特性與其力學(xué)性能、降解性能都是相互聯(lián)系的。例如，盡管在許多骨缺損修復(fù)應(yīng)用中需要支架的機(jī)械穩(wěn)定性，但適當(dāng)?shù)慕到饽芰σ约罢T導(dǎo)細(xì)胞和組織加速生長的能力則需要多孔支架具有高孔隙率和內(nèi)部連通性，這勢必會降低材料整體的力學(xué)性能。要將這種相互沖突的要求合并到一個材料體系中，迫切需要結(jié)合多種制造技術(shù)，開發(fā)新的制備策略。例如在設(shè)計組織工程材料上需要構(gòu)筑仿生的多層級梯度結(jié)構(gòu)，而這些都會給材料的設(shè)計和制造帶來前所未有的難度。如前所述，3D打印技術(shù)的出現(xiàn)和迅速發(fā)展，為制造復(fù)雜的仿生結(jié)構(gòu)特征提供了前所未有的機(jī)會。特別是3D打印技術(shù)與其他制造技術(shù)的結(jié)合，為實現(xiàn)在多尺度上對材料結(jié)構(gòu)的精確定義提供了潛在的解決方案。此外，骨組織再生是一個動態(tài)的過程，涉及細(xì)胞和周圍基質(zhì)之間的雙向作用。生物材料的設(shè)計可以適應(yīng)細(xì)胞的局部變化，并且可以根據(jù)局部生物信號的刺激改變支架材料的特性，從而促進(jìn)了這種動態(tài)的相互作用。而這就要求對于多孔結(jié)構(gòu)的設(shè)計不是固定不變的，需要考慮在動態(tài)響應(yīng)過程中的結(jié)構(gòu)變化，這對支架材料的結(jié)構(gòu)設(shè)計和制造無疑會帶來巨大的挑戰(zhàn)。相信在骨組織工程技術(shù)快速發(fā)展的今天，隨著對骨組織生物學(xué)和結(jié)構(gòu)的理解深入，以及材料合成和加工技術(shù)的進(jìn)步，勢必為骨組織工程設(shè)計更加復(fù)雜的材料系統(tǒng)提供新的機(jī)遇。

表1 不同制備方法對SF基三維骨組織修復(fù)支架的孔結(jié)構(gòu)調(diào)控Tab.1 Pore structure regulation of SF-based 3D bone tissue repair scaffolds by different preparation methods

近年來，合成生物學(xué)作為一門由基因組工程、酶工程、代謝工程和生物信息學(xué)等多種技術(shù)交叉發(fā)展形成的新興綜合學(xué)科，為創(chuàng)造高性能新型生物材料提供了有力的工具［95-96］。研究者們將合成生物學(xué)和材料科學(xué)的工程原理相互融合，借助基因合成和編輯技術(shù)對自然界的活體系統(tǒng)進(jìn)行定制化的設(shè)計與改造，將工程改造的生命體作為細(xì)胞工廠，從而智能地構(gòu)建功能定制的生物材料［97］。其中，首要任務(wù)則是選擇適合的天然宿主，天然宿主的正確選擇會直接影響合成生物技術(shù)對其最終的改造，達(dá)到事半功倍的效果。不同于當(dāng)前常見的大腸桿菌這類模式生物作為材料合成的宿主，隨著材料合成生物學(xué)的基因操作工具的發(fā)展，未來天然宿主的選擇可以向家蠶這類非模式生物傾斜以實現(xiàn)高附加值材料的生產(chǎn)，從而為設(shè)計和改造SF材料的功能性提供了可借鑒的研究策略［97］。面對基于絲素蛋白材料構(gòu)建骨組織修復(fù)支架研究中，良好的力學(xué)性能與高孔隙率和內(nèi)部連通性這種相互沖突的要求，基于合成生物技術(shù)構(gòu)建綠色高效的生物制造系統(tǒng)有望解決這一難題。例如蜘蛛絲表現(xiàn)出卓越非凡的力學(xué)性能，已有研究表明，蜘蛛絲巨大的韌性和彈性主要是由于擴(kuò)增絲蛋白（MaSp）的存在［98］。MaSp蛋白具有高度重復(fù)的序列，無法通過使用細(xì)菌或酵母來獲得，而家蠶具有生產(chǎn)高度重復(fù)蛋白質(zhì)的能力。因此可以借用基因編輯技術(shù)操縱家蠶基因組，實現(xiàn)蛛絲蛋白在家蠶細(xì)胞中的表達(dá)，最終獲得具有增強(qiáng)力學(xué)性能的SF材料［98-100］。合成生物學(xué)的發(fā)展為創(chuàng)建具有定制形態(tài)和功能的新型SF材料提供了可能性，對解決SF材料應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域所存在的問題和挑戰(zhàn)具有重大而深遠(yuǎn)的意義。